本发明涉及生物制品加工技术领域，特别是涉及一种活性肽纳米胶原及其制备方法。
背景技术
我国是畜禽生产和销售大国，肉类总产量近6000万吨，约占全世界肉食总产量的四分之一，居世界第一。在肉类生产中，每年产生近2000万吨的各类畜禽骨。随着人们消费水平的提高，对肉制品的需求不断增长，畜禽骨的产量也持续增加，但绝大多数的畜禽骨没有得到充分利用，不仅造成巨大的浪费，还导致环境污染。
按照工艺类型一般纳米胶原的生产方法分为四种：酸分解法、碱分解法、高温热解法和生物酶解法。酸法和碱法加工的工艺简单，成本低，但产品中含盐量较高，所得产品的相对分子质量分布较宽，不适合生产高品质的食品级胶原多肽。而且这两种方法在生产的过程中需要较长时间的浸泡，对设备的材质要求都比较高。高温热解法产品含盐量较低，但水解时间长，需要高压操作，而所得产品的相对分子质量分布较宽，不适合生产高品质的食品级胶原多肽，而且由于这两种方法在生产过程中需要长时间浸泡，对设备的材质要求都比较高。高温热解法产品含盐量低，但水解时间长，需要高压操作，而所得产品的相对分子质量分布不均且不易控制，也不适合生产高品质的食品级胶原多肽。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种纳米肽活性胶原的制备方法。
本发明公开了一种活性肽纳米胶原的制备方法，采用畜禽骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗；
s2整理；
s3制备畜禽骨粉或畜禽骨素；
s4畜禽骨粉或畜禽骨素发酵；
s5灭菌；
s6微滤、超滤；
s7真空冷冻干燥。
作为本发明特别优选的技术方案之一，活性肽纳米胶原的制备方法，采用畜禽骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗：将畜禽骨用流动的水冲洗，除去表面污物和血水；
s2整理：剔除清洗后畜禽骨的肌肉、肌键、软骨、海绵骨以及骨膜；
s3制备畜禽骨粉：将整理后的畜禽骨破碎成畜禽骨颗粒，用流动的水冲洗，沥干备用；将沥干后的畜禽骨颗粒在90～100℃的水中常压煮4～12小时，然后在压力0.1～0.3mpa、110～125℃的条件下高压煮5～8小时，捞出，得到脱脂后的畜禽骨颗粒；将脱脂后的畜禽骨颗粒烘干至含水率达到2～6wt％；接着粉碎，过筛，获得畜禽骨粉；
s4畜禽骨粉发酵：将畜禽骨粉灭菌；向灭菌后的畜禽骨粉中加水，配制成为畜禽骨粉浓度20～40g/l的畜禽骨粉溶液；将发酵菌按照2～4％(ml/ml)的接种量添加于畜禽骨粉溶液中，于35～37℃发酵24～48小时后，收集发酵液；
s5灭菌：将发酵液于110～120℃灭菌10～30分钟后，自然冷却至40～50℃，离心20～40分钟，取上清液；
s6微滤、超滤：将上清液微滤，除去悬浮的小颗粒，收集微滤液；然后用截留分子量为2～10kda的超滤膜对微滤液进行分离，收集超滤透过液；
s7真空冷冻干燥：将收集得到的超滤透过液真空冷冻干燥，得到所述活性肽纳米胶原。
作为本发明特别优选的技术方案之二，活性肽纳米胶原的制备方法，采用畜禽骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗：将畜禽骨用流动的水冲洗，除去表面污物和血水；
s2整理：剔除清洗后畜禽骨的肌肉、肌键、软骨、海绵骨以及骨膜；
s3制备畜禽骨素：将整理后的畜禽骨破碎成畜禽骨颗粒，用流动的水冲洗，沥干备用；将沥干后的畜禽骨颗粒在90～100℃的水中常压煮4～12小时，然后在压力0.1～0.3mpa、110～125℃的的条件下高压煮5～8小时，捞出，得到脱脂后的畜禽骨颗粒；将脱脂后的畜禽骨颗粒浸泡在摩尔浓度0.25～0.65mol/l的盐酸中，浸泡1～6小时后，捞出畜禽骨颗粒并用流动的水除去表面盐酸；继续置于质量分数0.01～0.1％的氢氧化钠水溶液中，浸泡1～2小时后，捞出畜禽骨颗粒并用流动的水除去表面氢氧化钠水溶液，获得脱盐后的畜禽骨颗粒；将脱盐后的畜禽骨颗粒烘干至含水率达到2～6wt％；接着粉碎，过筛，获得畜禽骨素；
s4畜禽骨素发酵：将畜禽骨素灭菌；向灭菌后的畜禽骨素中加水，配制成为畜禽骨素浓度20～40g/l的畜禽骨素溶液；将发酵菌按照2～4％(ml/ml)的接种量添加于畜禽骨素溶液中，于35～37℃发酵24～48小时后，收集发酵液；
s5灭菌：将发酵液于110～120℃灭菌10～30分钟后，自然冷却至40～50℃，离心20～40分钟，取上清液；
s6微滤、超滤：将上清液微滤，除去悬浮的小颗粒，收集微滤液；然后用截留分子量为2～10kda的超滤膜对微滤液进行分离，收集超滤透过液；
s7真空冷冻干燥：将收集得到的超滤透过液真空冷冻干燥，得到所述活性肽纳米胶原。
作为本发明特别优选的技术方案之三，活性肽纳米胶原的制备方法，采用畜禽骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗：将畜禽骨用流动的水冲洗，除去表面污物和血水；
s2整理：剔除清洗后畜禽骨的肌肉、肌键、软骨、海绵骨以及骨膜；
s3制备畜禽骨素：将整理后的畜禽骨破碎成畜禽骨颗粒，用流动的水冲洗，沥干备用；将沥干后的畜禽骨颗粒在90～100℃的水中常压煮4～12小时，然后在压力0.1～0.3mpa、110～125℃的的条件下高压煮5～8小时，捞出，得到脱脂后的畜禽骨颗粒；将脱脂后的畜禽骨颗粒浸泡在摩尔浓度0.25～0.65mol/l的盐酸中，浸泡1～6小时后，捞出畜禽骨颗粒并用流动的水除去表面盐酸；继续置于质量分数0.01～0.1％的氢氧化钠水溶液中，浸泡1～2小时后，捞出畜禽骨颗粒并用流动的水除去表面氢氧化钠水溶液，获得脱盐后的畜禽骨颗粒；将脱盐后的畜禽骨颗粒烘干至含水率达到2～6wt％；接着粉碎，过筛，获得畜禽骨素；
s4畜禽骨素发酵：向畜禽骨素中添加畜禽骨素重量1～4％的中草药，拌和均匀，得到拌和料；将拌和料灭菌；向灭菌后的拌和料中加水，配制成为拌和料浓度20～40g/l的拌和料溶液；将发酵菌按照2～4％(ml/ml)的接种量添加于拌和料溶液中，于35～37℃发酵24～48小时后，收集发酵液；所述中草药由以下配比的原料组成：白芷30～50wt％，鱼腥草10～30wt％，余量为砂仁；
s5灭菌：将发酵液于110～120℃灭菌10～30分钟后，自然冷却至40～50℃，离心20～40分钟，取上清液；
s6微滤、超滤：将上清液微滤，除去悬浮的小颗粒，收集微滤液；然后用截留分子量为2～10kda的超滤膜对微滤液进行分离，收集超滤透过液；
s7真空冷冻干燥：将收集得到的超滤透过液真空冷冻干燥，得到所述活性肽纳米胶原。
所述畜禽骨为鹅骨、牛骨、猪骨、鱼骨、骆驼骨、狗骨、鹿骨中的一种。
优选地，在步骤s4发酵过程中，向畜禽骨素溶液或拌和料溶液中按照10～15g/l的添加量加入蔗糖，然后添加发酵菌进行发酵。
优选地，在添加蔗糖的同时，按照0.1～1g/l的添加量加入无机盐，所述无机盐为氯化钙、氯化锌、氯化镁、氯化亚铜、氯化亚铁中的一种或多种的混合物。
更优选地，所述无机盐为氯化钙。
优选地，所述发酵菌为蜡样芽孢杆菌和/或保加利亚乳杆菌。作为本发明特别优选的实施方式，所述发酵菌为由蜡样芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌以体积比1:1组成的混合菌。
本发明的第二目的在于提供一种活性肽纳米胶原，采用上述任一种活性肽纳米胶原的制备方法加工而成。
本发明相对于现有技术的有益效果在于：
1、本发明在脱脂过程中使用高温热处理和高压热处理的方法，操作简单，对设备的要求也比较低，无需使用有机溶剂，适合工业使用；
2、本发明通过酸浸和碱浸的方式，将胶原蛋白周围的无机矿物盐游离出原料骨，得到以胶原纤维束为主要形式的骨素，同时调整为适宜的发酵环境，使得发酵菌代谢产物降解了胶原纤维束，产生显著的水解效果；
3、本发明在发酵的过程中添加白芷、鱼腥草和砂仁组成的中草药，在降低活性肽纳米胶原苦涩口感和腥味的同时，中草药发酵代谢产物促进了骨素的同时，提高了活性肽纳米胶原的疗效；在一些实施方式中，在发酵的过程中还添加了蔗糖和无机盐氯化钙，蔗糖为菌体的发酵提供了丰富的碳源，氯化钙可能促进了发酵代谢产物胶原蛋白酶的产生并提高了其活性；
4、值得注意的是，在本发明特别优选的实施例中，采用了蜡样芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌组成的混合菌作为发酵菌，但是这两种菌存在一定的拮抗作用。发明人将蜡样芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌组成的混合菌作为发酵菌，意外发现，得到的活性肽纳米胶原的功效显著增强，推测可能是由于保加利亚乳杆菌利用发酵液中的糖分代谢产生乳酸，创造了酸性环境，有利于混合发酵菌代谢产物对胶原蛋白的水解；判断保加利亚乳杆菌菌液和蜡样芽孢杆菌之间拮抗作用的方式；在mrs平板培养基中，加入1ml保加利亚乳杆菌菌液涂布均匀，在37℃恒温培养48小时，待形成菌落后，再用接种环挑取蜡样芽孢杆菌，在菌落上面轻划s形，再在37℃条件下培养48小时后。观察有菌落在s形上产生，两者有轻微的拮抗作用。
用本方法得到的活性肽纳米胶原可以扩散至皮肤深层，使皮肤中胶原蛋白活性增强，促进皮肤组织的新陈代谢，具有美白、保湿、防皱、修复、营养、减肥等美容美体作用，还可以促进骨细胞的成熟和矿化，提高骨骼强度，促进矿物质吸收，对骨质疏松起到有效防治作用，可以作为医药、保健品、化妆品原料使用，具有较高的推广价值以及良好的应用前景。
具体实施方式
实施例中原料介绍如下：
鹅骨，购于上海桃浦畜禽产品市场。
蜡样芽孢杆菌，购于安阳市源首生物药业有限责任公司，菌种浓度108cfu/ml。
保加利亚乳杆菌，购于陕西藤迈生物科技有限责任公司，菌种浓度108cfu/ml。
蔗糖，cas号：57-50-1。
氯化钙，cas号：10043-52-4。
白芷，产地安徽，购于亳州百川药业销售有限公司。
鱼腥草，产地四川，购于亳州市源生堂药业有限公司。
砂仁，购于亳州市朗元药业有限公司。
在本发明未作具体说明的情况下，实施例中真空冷冻干燥的具体操作为：预冻温度-80℃，预冻时间1小时，冷冻温度-70℃，绝对压强100pa，冷冻干燥时间48小时。
实施例1
活性肽纳米胶原的制备方法，采用鹅骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗：将鹅骨用流动的水冲洗20分钟，除去表面污物和血水；
s2整理：剔除清洗后鹅骨的肌肉、肌键、软骨、海绵骨以及骨膜；
s3制备鹅骨粉：将整理后的鹅骨破碎成大小为5mm×10mm×3mm的鹅骨颗粒，用流动的水冲洗10分钟，沥干备用；将沥干后的鹅骨颗粒在100℃的水中常压煮8小时，然后在压力0.1mpa、121℃的条件下高压煮6小时，捞出，得到脱脂后的鹅骨颗粒；将脱脂后的鹅骨颗粒于60℃烘干至含水率达到3wt％；接着粉碎，过100目筛，获得鹅骨粉；
s4鹅骨粉发酵：将鹅骨粉在微波功率20kw、微波频率2450mhz的条件下灭菌5分钟；向灭菌后的鹅骨粉中加水，配制成为鹅骨粉浓度40g/l的鹅骨粉溶液；将蜡样芽孢杆菌按照4％(ml/ml)的接种量添加于鹅骨粉溶液中，于37℃发酵36小时后，收集发酵液；
s5灭菌：将发酵液于121℃灭菌10分钟后，自然冷却至40℃，以6000转/分钟离心20分钟，取上清液；
s6微滤、超滤：将上清液在操作压力0.2mpa下通过孔径0.15μm的微滤膜，除去悬浮的小颗粒，收集微滤液；然后用截留分子量为10kda的超滤膜对微滤液进行分离，收集超滤透过液；
s7真空冷冻干燥：将收集得到的超滤透过液真空冷冻干燥，得到所述活性肽纳米胶原。
实施例2
活性肽纳米胶原的制备方法，采用鹅骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗：将鹅骨用流动的水冲洗20分钟，除去表面污物和血水；
s2整理：剔除清洗后鹅骨的肌肉、肌键、软骨、海绵骨以及骨膜；
s3制备鹅骨素：将整理后的鹅骨破碎成大小为5mm×10mm×3mm的鹅骨颗粒，用流动的水冲洗10分钟，沥干备用；将沥干后的鹅骨颗粒在100℃的水中常压煮8小时，然后在压力0.1mpa、121℃的条件下高压煮6小时，捞出，得到脱脂后的鹅骨颗粒；将脱脂后的鹅骨颗粒浸泡在摩尔浓度0.49mol/l的盐酸中，鹅骨颗粒和盐酸的固液比为1：5(g/ml)，浸泡6小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面盐酸；继续置于质量分数0.05％的氢氧化钠水溶液中，鹅骨颗粒和氢氧化钠水溶液的固液比为1：3(g/ml)，浸泡2小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面氢氧化钠水溶液，获得脱盐后的鹅骨颗粒；将脱盐后的鹅骨颗粒于60℃烘干至含水率达到3wt％；接着粉碎，过100目筛，获得鹅骨素；
s4鹅骨素发酵：将鹅骨素在微波功率20kw、微波频率2450mhz的条件下灭菌5分钟；向灭菌后的鹅骨素中加水，配制成为鹅骨素浓度40g/l的鹅骨素溶液；将蜡样芽孢杆菌按照4％(ml/ml)的接种量添加于鹅骨素溶液中，于37℃发酵36小时后，收集发酵液；
s5灭菌：将发酵液于121℃灭菌10分钟后，自然冷却至40℃，以6000转/分钟离心20分钟，取上清液；
s6微滤、超滤：将上清液在操作压力0.2mpa下通过孔径0.15μm的微滤膜，除去悬浮的小颗粒，收集微滤液；然后用截留分子量为10kda的超滤膜对微滤液进行分离，收集超滤透过液；
s7真空冷冻干燥：将收集得到的超滤透过液真空冷冻干燥，得到所述活性肽纳米胶原。
实施例3
活性肽纳米胶原的制备方法，采用鹅骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗：将鹅骨用流动的水冲洗20分钟，除去表面污物和血水；
s2整理：剔除清洗后鹅骨的肌肉、肌键、软骨、海绵骨以及骨膜；
s3制备鹅骨素：将整理后的鹅骨破碎成大小为5mm×10mm×3mm的鹅骨颗粒，用流动的水冲洗10分钟，沥干备用；将沥干后的鹅骨颗粒在100℃的水中常压煮8小时，然后在压力0.1mpa、121℃的条件下高压煮6小时，捞出，得到脱脂后的鹅骨颗粒；将脱脂后的鹅骨颗粒浸泡在摩尔浓度0.49mol/l的盐酸中，鹅骨颗粒和盐酸的固液比为1：5(g/ml)，浸泡6小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面盐酸；继续置于质量分数0.05％的氢氧化钠水溶液中，鹅骨颗粒和氢氧化钠水溶液的固液比为1：3(g/ml)，浸泡2小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面氢氧化钠水溶液，获得脱盐后的鹅骨颗粒；将脱盐后的鹅骨颗粒于60℃烘干至含水率达到3wt％；接着粉碎，过100目筛，获得鹅骨素；
s4鹅骨素发酵：向鹅骨素中添加鹅骨素重量2％的中草药，拌和均匀，得到拌和料；将拌和料在微波功率20kw、微波频率2450mhz的条件下灭菌5分钟；向灭菌后的拌和料中加水，配制成为拌和料浓度40g/l的拌和料溶液；将蜡样芽孢杆菌按照4％(ml/ml)的接种量添加于拌和料溶液中，于37℃发酵36小时后，收集发酵液；所述中草药由以下配比的原料组成：白芷50wt％，鱼腥草30wt％，余量为砂仁；将白芷、鱼腥草、砂仁按配比混合即得中草药；
s5灭菌：将发酵液于121℃灭菌10分钟后，自然冷却至40℃，以6000转/分钟离心20分钟，取上清液；
s6微滤、超滤：将上清液在操作压力0.2mpa下通过孔径0.15μm的微滤膜，除去悬浮的小颗粒，收集微滤液；然后用截留分子量为10kda的超滤膜对微滤液进行分离，收集超滤透过液；
s7真空冷冻干燥：将收集得到的超滤透过液真空冷冻干燥，得到所述活性肽纳米胶原。
实施例4
活性肽纳米胶原的制备方法，采用鹅骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗：将鹅骨用流动的水冲洗20分钟，除去表面污物和血水；
s2整理：剔除清洗后鹅骨的肌肉、肌键、软骨、海绵骨以及骨膜；
s3制备鹅骨素：将整理后的鹅骨破碎成大小为5mm×10mm×3mm的鹅骨颗粒，用流动的水冲洗10分钟，沥干备用；将沥干后的鹅骨颗粒在100℃的水中常压煮8小时，然后在压力0.1mpa、121℃的条件下高压煮6小时，捞出，得到脱脂后的鹅骨颗粒；将脱脂后的鹅骨颗粒浸泡在摩尔浓度0.49mol/l的盐酸中，鹅骨颗粒和盐酸的固液比为1：5(g/ml)，浸泡6小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面盐酸；继续置于质量分数0.05％的氢氧化钠水溶液中，鹅骨颗粒和氢氧化钠水溶液的固液比为1：3(g/ml)，浸泡2小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面氢氧化钠水溶液，获得脱盐后的鹅骨颗粒；将脱盐后的鹅骨颗粒于60℃烘干至含水率达到3wt％；接着粉碎，过100目筛，获得鹅骨素；
s4鹅骨素发酵：向鹅骨素中添加鹅骨素重量2％的中草药，拌和均匀，得到拌和料；将拌和料在微波功率20kw、微波频率2450mhz的条件下灭菌5分钟；向灭菌后的拌和料中加水，配制成为拌和料浓度40g/l的拌和料溶液；向拌合料溶液中按照10g/l的添加量加入蔗糖，然后将将蜡样芽孢杆菌按照4％(ml/ml)的接种量添加于拌和料溶液中，于37℃发酵36小时后，收集发酵液；所述中草药由以下配比的原料组成：白芷50wt％，鱼腥草30wt％，余量为砂仁；将白芷、鱼腥草、砂仁按配比混合即得中草药；
s5灭菌：将发酵液于121℃灭菌10分钟后，自然冷却至40℃，以6000转/分钟离心20分钟，取上清液；
s6微滤、超滤：将上清液在操作压力0.2mpa下通过孔径0.15μm的微滤膜，除去悬浮的小颗粒，收集微滤液；然后用截留分子量为10kda的超滤膜对微滤液进行分离，收集超滤透过液；
s7真空冷冻干燥：将收集得到的超滤透过液真空冷冻干燥，得到所述活性肽纳米胶原。
实施例5
活性肽纳米胶原的制备方法，采用鹅骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗：将鹅骨用流动的水冲洗20分钟，除去表面污物和血水；
s2整理：剔除清洗后鹅骨的肌肉、肌键、软骨、海绵骨以及骨膜；
s3制备鹅骨素：将整理后的鹅骨破碎成大小为5mm×10mm×3mm的鹅骨颗粒，用流动的水冲洗10分钟，沥干备用；将沥干后的鹅骨颗粒在100℃的水中常压煮8小时，然后在压力0.1mpa、121℃的条件下高压煮6小时，捞出，得到脱脂后的鹅骨颗粒；将脱脂后的鹅骨颗粒浸泡在摩尔浓度0.49mol/l的盐酸中，鹅骨颗粒和盐酸的固液比为1：5(g/ml)，浸泡6小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面盐酸；继续置于质量分数0.05％的氢氧化钠水溶液中，鹅骨颗粒和氢氧化钠水溶液的固液比为1：3(g/ml)，浸泡2小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面氢氧化钠水溶液，获得脱盐后的鹅骨颗粒；将脱盐后的鹅骨颗粒于60℃烘干至含水率达到3wt％；接着粉碎，过100目筛，获得鹅骨素；
s4鹅骨素发酵：向鹅骨素中添加鹅骨素重量2％的中草药，拌和均匀，得到拌和料；将拌和料在微波功率20kw、微波频率2450mhz的条件下灭菌5分钟；向灭菌后的拌和料中加水，配制成为拌和料浓度40g/l的拌和料溶液；向拌合料溶液中按照10g/l的添加量加入蔗糖、按照0.5g/l的添加量加入氯化钙，然后将将蜡样芽孢杆菌按照4％(ml/ml)的接种量添加于拌和料溶液中，于37℃发酵36小时后，收集发酵液；所述中草药由以下配比的原料组成：白芷50wt％，鱼腥草30wt％，余量为砂仁；将白芷、鱼腥草、砂仁按配比混合即得中草药；
s5灭菌：将发酵液于121℃灭菌10分钟后，自然冷却至40℃，以6000转/分钟离心20分钟，取上清液；
s6微滤、超滤：将上清液在操作压力0.2mpa下通过孔径0.15μm的微滤膜，除去悬浮的小颗粒，收集微滤液；然后用截留分子量为10kda的超滤膜对微滤液进行分离，收集超滤透过液；
s7真空冷冻干燥：将收集得到的超滤透过液真空冷冻干燥，得到所述活性肽纳米胶原。
实施例6
活性肽纳米胶原的制备方法，采用鹅骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗：将鹅骨用流动的水冲洗20分钟，除去表面污物和血水；
s2整理：剔除清洗后鹅骨的肌肉、肌键、软骨、海绵骨以及骨膜；
s3制备鹅骨素：将整理后的鹅骨破碎成大小为5mm×10mm×3mm的鹅骨颗粒，用流动的水冲洗10分钟，沥干备用；将沥干后的鹅骨颗粒在100℃的水中常压煮8小时，然后在压力0.1mpa、121℃的条件下高压煮6小时，捞出，得到脱脂后的鹅骨颗粒；将脱脂后的鹅骨颗粒浸泡在摩尔浓度0.49mol/l的盐酸中，鹅骨颗粒和盐酸的固液比为1：5(g/ml)，浸泡6小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面盐酸；继续置于质量分数0.05％的氢氧化钠水溶液中，鹅骨颗粒和氢氧化钠水溶液的固液比为1：3(g/ml)，浸泡2小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面氢氧化钠水溶液，获得脱盐后的鹅骨颗粒；将脱盐后的鹅骨颗粒于60℃烘干至含水率达到3wt％；接着粉碎，过100目筛，获得鹅骨素；
s4鹅骨素发酵：向鹅骨素中添加鹅骨素重量2％的中草药，拌和均匀，得到拌和料；将拌和料在微波功率20kw、微波频率2450mhz的条件下灭菌5分钟；向灭菌后的拌和料中加水，配制成为拌和料浓度40g/l的拌和料溶液；向拌合料溶液中按照10g/l的添加量加入蔗糖、按照0.5g/l的添加量加入氯化钙，然后将保加利亚乳杆菌按照4％(ml/ml)的接种量添加于拌和料溶液中，于37℃发酵36小时后，收集发酵液；所述中草药由以下配比的原料组成：白芷50wt％，鱼腥草30wt％，余量为砂仁；将白芷、鱼腥草、砂仁按配比混合即得中草药；
s5灭菌：将发酵液于121℃灭菌10分钟后，自然冷却至40℃，以6000转/分钟离心20分钟，取上清液；
s6微滤、超滤：将上清液在操作压力0.2mpa下通过孔径0.15μm的微滤膜，除去悬浮的小颗粒，收集微滤液；然后用截留分子量为10kda的超滤膜对微滤液进行分离，收集超滤透过液；
s7真空冷冻干燥：将收集得到的超滤透过液真空冷冻干燥，得到所述活性肽纳米胶原。
实施例7
活性肽纳米胶原的制备方法，采用鹅骨作为主要原料，包括以下步骤：
s1清洗：将鹅骨用流动的水冲洗20分钟，除去表面污物和血水；
s2整理：剔除清洗后鹅骨的肌肉、肌键、软骨、海绵骨以及骨膜；
s3制备鹅骨素：将整理后的鹅骨破碎成大小为5mm×10mm×3mm的鹅骨颗粒，用流动的水冲洗10分钟，沥干备用；将沥干后的鹅骨颗粒在100℃的水中常压煮8小时，然后在压力0.1mpa、121℃的条件下高压煮6小时，捞出，得到脱脂后的鹅骨颗粒；将脱脂后的鹅骨颗粒浸泡在摩尔浓度0.49mol/l的盐酸中，鹅骨颗粒和盐酸的固液比为1：5(g/ml)，浸泡6小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面盐酸；继续置于质量分数0.05％的氢氧化钠水溶液中，鹅骨颗粒和氢氧化钠水溶液的固液比为1：3(g/ml)，浸泡2小时后，捞出鹅骨颗粒并用流动的水除去表面氢氧化钠水溶液，获得脱盐后的鹅骨颗粒；将脱盐后的鹅骨颗粒于60℃烘干至含水率达到3wt％；接着粉碎，过100目筛，获得鹅骨素；
s4鹅骨素发酵：向鹅骨素中添加鹅骨素重量2％的中草药，拌和均匀，得到拌和料；将拌和料在微波功率20kw、微波频率2450mhz的条件下灭菌5分钟；向灭菌后的拌和料中加水，配制成为拌和料浓度40g/l的拌和料溶液；向拌合料溶液中按照10g/l的添加量加入蔗糖、按照0.5g/l的添加量加入氯化钙，然后将发酵菌按照4％(ml/ml)的接种量添加于拌和料溶液中，所述发酵菌为由蜡样芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌以体积比1:1组成的混合菌，于37℃发酵36小时后，收集发酵液；所述中草药由以下配比的原料组成：白芷50wt％，鱼腥草30wt％，余量为砂仁；将白芷、鱼腥草、砂仁按配比混合即得中草药；
s5灭菌：将发酵液于121℃灭菌10分钟后，自然冷却至40℃，以6000转/分钟离心20分钟，取上清液；
s6微滤、超滤：将上清液在操作压力0.2mpa下通过孔径0.15μm的微滤膜，除去悬浮的小颗粒，收集微滤液；然后用截留分子量为10kda的超滤膜对微滤液进行分离，收集超滤透过液；
s7真空冷冻干燥：将收集得到的超滤透过液真空冷冻干燥，得到所述活性肽纳米胶原。
测试例1
对实施例1～7活性肽纳米胶原的美白功效进行评价。以小鼠b16黑色素瘤细胞作为模型，以黑色素含量和酪氨酸酶活性作为指标，判断活性肽纳米胶原对黑素瘤细胞的增殖抑制作用。
黑色素含量检测
将小鼠b16黑素瘤细胞株(购于武汉普诺赛生命科技有限公司，货号cl-0029)于rpmi-1640培养基(购自gibco公司，含10％小牛血清，105u/l青霉素，105μg/l链霉素)，在37℃、5％co2的培养箱中培养，每3天传代一次。
取对数生长期的小鼠b16黑色素瘤细胞，经0.25％胰酶消化后，以rpmi-1640完全培养基配成密度为1×105个/ml的细胞悬液，接种于6孔板，每孔2ml，置于37℃、5％co2的培养箱内培养。贴壁培养24小时后，弃培养液，向每mlrpmi-1640培养基添加0.025mg活性肽纳米胶原作为试验组，对照组为等体积的rpmi-1640培养基。培养48小时后，收获细胞进行黑色素含量测定。以含10％dmso的1mol/l的氢氧化钠水溶液裂解细胞，超声波破碎30分钟，于90℃水浴处理2小时后，以3000转/分钟离心15分钟，于酶标仪450nm处测吸光度值，计算细胞黑色素相对含量。
黑素合成相对含量(％)＝a1/a0×100％。式中，a1是试验组的吸光度，a0是对照组的吸光值。
每个处理组实验重复3次。取其平均值作为最终测试结果。
酪氨酸酶活性检测
取对数生长期的小鼠b16黑色素瘤细胞，经0.25％胰酶消化后，以rpmi-1640培养基配成密度为1×105个/ml的细胞悬液，接种于6孔板，每孔2ml，置于37℃、5％co2的培养箱内培养。贴壁培养24小时后，弃培养液，向每mlrpmi-1640培养基添加0.025mg活性肽纳米胶原作为试验组，对照组为等体积的rpmi-1640培养基。培养48小时后，收获细胞进行酪氨酸酶活性测测定。将细胞用ph6.8、摩尔浓度0.1mol/l的磷酸缓冲液冲洗两遍，每孔加300μl含5％体积分数tritonx-100的缓冲液，反复冻融，冰浴中超声破碎，得到细胞破碎液；取2ml细胞破碎液于37℃预热10分钟，迅速加入0.1％l-dopa溶液500μl，振摇后在分光光度计波长475nm处，分别于0分钟和30分钟时读取吸光度值，计算酪氨酸酶活性抑制率。
酪氨酸酶活性抑制率(％)＝(a’30-a’0)/(a30-a0)×100％式中，a’0和a’30是试验组在0分钟和30分钟时的吸光度；a0和a30是对照组在0分钟和30分钟时的吸光度。
每个处理组实验重复3次。取其平均值作为最终测试结果。具体测试结果见表1。
表1活性肽纳米胶原的美白功效测试结果表
测试例2
骨质疏松症是单位体积内骨量减少，骨的微观结构受到破坏，从而导致骨脆性增加甚至骨折的一类骨代谢疾病。对实施例1～7活性肽纳米胶原的治疗骨质疏松功效进行评价。
大鼠骨髓间充质干细胞的传代培养及诱导：将大鼠骨髓间充质干细胞bmscs(购于上海邦景实业有限公司，货号cs-0001-0067)以1×105个/ml的密度接种于培养板中，于dmem-f12培养基(购于上海博省生物科技有限公司，含10％的胎牛血清，105u/l青霉素，105μg/l链霉素)，在37℃、5％co2的培养箱中进行培养，三天换液一次，待细胞生长到80％～90％融合时，用ph6.8、摩尔浓度0.1mol/l的磷酸缓冲液冲洗两遍，用0.25％胰酶-edta消化1～2分钟，加入完全培养基终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，移入离心管，在20℃以250转/分钟离心5分钟，弃上清液，按照1：2的比例进行传代培养。
碱式磷酸酶活性检测
取生长良好传至第三代的大鼠骨髓间充质干细胞bmscs，消化后制成单细胞悬液并调整浓度至1×105个/ml，接种于24孔板，每孔lml；培养24小时后分别添加对照组培养基和试验组培养基，向每mlrpmi-1640培养基添加0.1mg活性肽纳米胶原作为试验组，对照组为等体积的rpmi-1640培养基。置于37℃、5％co2的培养箱内，于第14天测定碱式磷酸酶活性。吸去孔内培养液，用ph6.8、摩尔浓度0.1mol/l的磷酸缓冲液冲洗两遍，加入lml含2％体积分数tritonx-100的缓冲液，于4℃冰箱过夜裂解，以12000转/分钟于4℃离心5分钟，取上清液；取30μl上清液于96孔板，按照碱式磷酸酶试剂盒说明书测定，酶标仪测各管吸光度，根据碱式磷酸酶试剂盒(购于北京中生生物工程高技术有限公司)计算碱式磷酸酶活性。
钙素检测
将骨髓间充质干细胞bmscs以1×105个/ml的密度接种于6孔板，分别用对照组和试验组培养液培养，每3天换液一次，在第14天收集细胞培养上清液，以250转/分钟离心15分钟，取上清液，用酶联免疫法(elisa)(上海仁捷生物科技有限公司提供)检测骨钙素含量。
每个处理组实验重复3次，取其平均值作为最终测试结果。具体测试结果见表2。
表2活性肽纳米胶原的治疗骨质疏松功效测试结果表
从上述测试例可知，实施例2活性肽纳米胶原的无论美白效果还是治疗骨质疏松功效都优于实施例1，其原因可能是畜禽骨中含有高含量无机矿物盐，影响了发酵菌产生的胶原蛋白酶与骨骼中胶原的接触。本发明中通过酸浸和碱浸的方式，将胶原蛋白周围的无机矿物盐游离出原料骨，得到以胶原纤维束为主要形式的骨素，同时调整为适宜的发酵环境，使得发酵菌代谢产物降解了胶原纤维束，产生显著的水解效果。值得注意的是，在实施例7中，采用了蜡样芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌组成的混合菌作为发酵菌，但是这两种菌存在一定的拮抗作用。发明人将蜡样芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌组成的混合菌作为发酵菌，意外发现，得到的活性肽纳米胶原的功效显著增强，推测可能是由于保加利亚乳杆菌利用发酵液中的糖分代谢产生乳酸，创造了酸性环境，有利于混合发酵菌代谢产物对胶原蛋白的水解。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为了清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。