一种即用型3D细胞生长支架及其制备方法与流程

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种即用型3d细胞生长支架及其制备方法。

背景技术

细胞是生物体基本的结构和功能单位，细胞的特殊性决定了个体的特异性，细胞的多样性决定了生物的多样性。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。但是我们现在对生物体的理解很大部分依赖于同一种细胞群在平面、二维(2d)塑料或者玻璃基底上的培养研究。然而，在生物体内细胞主要存在于一个复杂且物质丰富的环境中，包括多种细胞外基质(ecm)、异型相互作用的细胞群及各种细胞因子的混合物。

传统的二维(2d)细胞培养是将细胞从组织中分离，置于平面基底上进行培养，具有简单、易操作、费用低等优点。通过二维细胞培养人们对细胞的基本生物学机制(迁移、分化)有了大部分的了解，但是，人们逐渐发现二维培养细胞得到的实验结果往往不能在动物体内得到重复，存在这类差异的主要原因在于二维培养的细胞虽然能在体外繁殖和分化，但其生长发育的环境和条件与体内细胞生长环境差异较大，进而导致细胞的基因表达和形态特征与体内差异较大。例如：将细胞从组织中分离置于平面基底进行培养时，许多的细胞类型逐渐变得扁平、异常分裂并失去其分化类型。有趣的是，当将这类细胞嵌入三维细胞培养环境中时，一些细胞可以恢复其生理形态和功能，将分化的去软骨细胞嵌入3d培养环境中，恢复了它们的生理表型，包括细胞形态和软骨标志物的表达。

三维(3d)细胞培养是指将动物细胞与具有三维结构的支架材料共同培养，使细胞能够在三维立体空间生长、增殖和迁移，构成三维的细胞-细胞或细胞-载体复合物，从而更好的模拟细胞在体内的生长环境。3d细胞培养主要分为有支架的细胞培养和无支架的细胞培养，支架的主要作用是为细胞提供一个附着和生长的多孔结构，依附于支架进行生长和迁移。主要的支架材料有胶原和水凝胶等，价格较低且操作简单。无支架的三维细胞培养主要通过物理方法使贴壁细胞悬浮于培养基中，达到三维培养的目的，目前主要的技术有微载体、磁悬浮、悬滴板和磁性三维生物印刷等技术，但这类方法操作复杂、前期投入较大，因此绝大多数的三维细胞培养借助于支架材料。已经有大量的生物支架材料被我们开发来研究3d细胞之间的相互作用，这类材料通常以含有悬浮细胞的液体为前提，通过一定的方式凝胶化或固化，随后生成的凝胶具有多孔结构，能够进行营养物质和废物的交换，通过调节自身厚度，来提供一定的机械强度，最基本的生物学功能是向凝胶中添加细胞粘附配体来实现，通常以arg-gly-asp肽的形式。天然的ecm已经成为生物学家的重要工具，这类材料来源于动物和人体，其网状结构、成分、生物力学环境适合细胞的增殖、粘附及新陈代谢，这类材料主要包括胶原、matrigel、壳聚糖、明胶等。人工合成的高分子材料大部分情况下是使用静电纺丝的方法合成，这类材料的制备更加标准化，但是前期投入较大，材料亲水性差，不利于细胞的粘附。随着whitesides课题组首次提出“cell-ingel-in-paper”这一概念，人们将天然ecm与纸基相结合，利用纸的纤维结构，模拟支架材料，将纸基浸入含有细胞悬液的的ecm中，让纸基纤维中填充满细胞悬液，将多层纸基堆叠，形成一个可以自由组装和拆卸的3d细胞培养平台。

但是，无论是天然ecm还是高分子合成材料，以及后来的纸基，均存在着在使用过程中需要将细胞悬液与基质相混合的过程，并且要现配现用，从而使整个实验过程变得繁琐，操作极为不便。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种即用型3d细胞生长支架的制备方法；目的之二在于提供一种即用型3d细胞生长支架。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种即用型3d细胞生长支架的制备方法，所述方法包括如下步骤：将细胞外基质溶液均匀覆盖在基底上，于-80℃下静置4-12h，然后真空冷冻干燥24-36h后置于交联剂中浸泡12-24h，洗涤、烘干，制得即用型3d细胞生长支架。

优选的，所述基底的厚度为10-40μm，孔隙率为23-39％，平均孔径为36-280μm时，所述细胞外基质溶液的质量分数为5-25％。

优选的，所述细胞外基质溶液为明胶溶液、胶原溶液、海藻酸钠溶液、胶原蛋白溶液、粘连蛋白溶液、pla溶液或丝素蛋白溶液中的一种。

优选的，所述基底为无纺布、擦镜纸、纱布或滤纸中的一种。

优选的，所述真空冷冻干燥在真空度为0.001mbar，温度为-80℃的条件下进行。

优选的，所述交联剂由如下方法制得：向ph值为4.75、体积分数为80％的乙醇溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺至1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的终浓度为50mmol/l、n-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为10mmol/l。

优选的，所述交联剂由如下方法制得：将戊二醛溶于水中制得体积分数为25％的戊二醛水溶液。

优选的，所述烘干具体为在50-60℃烘干2-4h。

优选的，所述细胞外基质溶液中还包含有表皮细胞生长因子或t细胞生长因子中的一种。

2、所述的方法制备的即用型3d细胞生长支架。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种即用型3d细胞生长支架及其制备方法，该即用型3d细胞生长支架不但可以为细胞培养提供三维生长环境，而且可以长期保存，有效的避免了现有技术中需要现配现用的缺点，简化了实验操作流程。该支架制备方法简单，原料来源广泛，且成本低，适合大规模工业化生产。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为pp无纺布、支架ⅰ、支架ⅱ、支架ⅲ、支架ⅳ和支架ⅴ的显微镜图；

图2为pp无纺布、支架ⅰ、支架ⅱ、支架ⅲ、支架ⅳ和支架ⅴ的细胞毒性测试结果图；

图3为pp无纺布和支架ⅲ的形貌图；(a为pp无纺布形貌图，b为支架ⅲ的形貌图，c为支架ⅲ弯折后的形貌图，d为支架ⅲ浸水后的形貌图)

图4为pp无纺布和支架ⅲ的扫描电镜图；(a为pp无纺布的扫描电镜图，b为支架ⅲ的扫描电镜图)

图5为pp无纺布和支架ⅲ的红外测试图；

图6为pp无纺布和支架ⅲ的膨胀性测试结果图；

图7为支架ⅲ、pp无纺布和纯明胶用于细胞培养时细胞增殖情况测试结果图；

图8为支架ⅲ用于细胞培养时细胞黏附性能测试结果图；

图9为pp无纺布用于细胞培养时细胞黏附性能测试结果图；

图10为支架ⅲ用于细胞培养时细胞迁移性能测试结果图；

图11为支架ⅲ稳定性测试结果图。(a为红外测试图，b为膨胀性测试图，c为细胞增殖情况测试图)

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

制备一种即用型3d细胞生长支架

(1)配制细胞外基质溶液

将明胶溶于60℃的去离子水中，恒温水浴2h至明胶完全溶解，获得质量分数为5％的明胶溶液；

(2)将厚度为10μm，孔隙率为26.60±2.7％，平均孔径为280μm的pp无纺布分别固定于96孔板上，然后将5ml质量分数为5％的明胶溶液均匀覆盖到各pp无纺布上，随后于-80℃下静置4h后在真空度为0.001mbar，温度为-80℃的条件下真空冷冻干燥26h，最后置于交联剂中浸泡18h，分别以去离子水进行洗涤，在60℃烘干3h，制得即用型3d细胞生长支架，其中，交联剂由如下方法制得：向ph值为4.75、体积分数为80％的乙醇溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺至1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的终浓度为50mmol/l、n-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为10mmol/l。

实施例2

与实施例1的区别在于：

步骤(1)中，配制的明胶溶液的质量分数为10％；

步骤(2)中，在-80℃下静置6h，在-80℃的条件下真空冷冻干燥32h，置于交联剂中浸泡20h，在50℃烘干2h。

实施例3

与实施例1的区别在于：

步骤(1)中，配制的明胶溶液的质量分数为15％；

步骤(2)中，在-80℃下静置12h，在-80℃的条件下真空冷冻干燥24h，置于交联剂中浸泡12h，在60℃烘干4h。

实施例4

与实施例1的区别在于：

步骤(1)中，配制的明胶溶液的质量分数为20％；

步骤(2)中，在-80℃下静置8h，在-80℃的条件下真空冷冻干燥36h，置于交联剂中浸泡16h，在55℃烘干4h。

实施例5

与实施例1的区别在于：

步骤(1)中，配制的明胶溶液的质量分数为25％；

步骤(2)中，在-80℃下静置10h，在-80℃的条件下真空冷冻干燥30h，置于交联剂中浸泡24h，在50℃烘干2h。

将实施例1至实施例5中制备的即用型3d细胞生长支架依次标记为支架ⅰ、支架ⅱ、支架ⅲ、支架ⅳ和支架ⅴ。

(1)在显微镜下观察pp无纺布、支架ⅰ、支架ⅱ、支架ⅲ、支架ⅳ和支架ⅴ的相貌特征，结果如图1所示，由图1可知，随着明胶溶液质量分数的增加，无纺布纤维与纤维之间逐渐成片状连接，且呈现出蜂窝状的小腔室，纤维之间的缝隙逐渐被明胶溶液填充满，当明胶溶液质量分数为10％时，明胶溶液基本可以完全覆盖pp无纺布，形成多孔片状连接，且孔状结构深度逐渐增加。

(2)对pp无纺布、支架ⅰ、支架ⅱ、支架ⅲ、支架ⅳ和支架ⅴ进行细胞毒性测试，a549细胞用含体积分数为10％的胎牛血清、青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml)的dmem培养基在37℃、5％co2孵箱中培养，待细胞生长至对数期时，用体积分数为0.25％的胰酶消化，1000rpm离心3min，调整细胞密度为5×10³个/ml，将细胞悬液接种于各支架上(将每种支架裁减为半径为6mm的圆片，且每种支架设置6个平行试验组)，37℃、5％co2孵箱中培养24h后进行mtt测定。移除旧培养基，加入含有3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四溴化钠(0.5mg/ml)的新鲜培养基，37℃、5％co2孵箱中孵育4h，小心移除培养基，加入dmso溶解蓝色沉淀，使用酶标仪(elx800tm，genecompany)在490nm波长下测定吸光度，测试结果如图2所示，由图2可知，随着明胶溶液质量分数的增加，细胞数量呈线性上升，当明胶溶液质量分数达到15％时，细胞数量达到最大值，之后细胞数量逐渐下降，因为当明胶溶液质量分数小于15％时，由于明胶浓度过低，不能很好的填充pp无纺布，使支架上孔径过大，不利于细胞的生长，而当明胶溶液质量分数大于15％时，由于明胶浓度过高，使支架中孔径深度增加，不利于营养物质的扩散，也不利于细胞的生长。

(3)观察pp无纺布和支架ⅲ(以质量分数为15％的明胶溶液为原料制备的即用型3d细胞生长支架)的形貌，结果如图3所示，其中，图3中a为pp无纺布形貌图，图3中b为支架ⅲ的形貌图，图3中c为支架ⅲ弯折后的形貌图，图3中d为支架ⅲ浸水后的形貌图，由图3可知，pp无纺布中纤维稀疏，而支架ⅲ中纤维变得致密，且可以弯曲折叠，浸水后呈无色透明状。将pp无纺布和支架ⅲ将处理后分别置于场发射扫描电子显微镜下观察，结果如图4所示，图4中a为pp无纺布的扫描电镜图，图4中b为支架ⅲ的扫描电镜图，由图4可知，pp无纺布和支架ⅲ在形态上发生的显著变化，支架ⅲ的平均孔径为24.05±3.91μm，pp无纺布中纤维排列稀疏，纤维之间缝隙较大，支架ⅲ在形态上pp无纺布本身的纤维排列，在纤维之间形成片状连接，且呈现蜂窝状小腔室，支架ⅲ的孔径大小和开孔结构更适合细胞的生长和粘附。

(4)利用红外对pp无纺布和支架ⅲ(以质量分数为15％的明胶溶液为原料制备的即用型3d细胞生长支架)进行检测，检测结果如图5所示，由图5可知，pp无纺布在2985-2810cm-1,1475-1440cm-1和1380-1370cm-1处显示出特征峰，表示-ch的伸缩振动，-ch2和-ch3的弯曲振动，支架ⅲ在1538^-1和1628cm^-1处有酰胺特征峰的出现，说明支架ⅲ上成功负载上了明胶。

(5)分别测试pp无纺布和支架ⅲ(以质量分数为15％的明胶溶液为原料制备的即用型3d细胞生长支架)的接触角，分别将pp无纺布和支架ⅲ平整的固定在载玻片上，水平放置于载物台上，各滴加3μl水，滴水后3s内计量接触角大小，pp无纺布和支架ⅲ各设置3个平行组，最终测得pp无纺布的接触角为120.2°±1.2°，支架ⅲ的接触角为90.69°±0.8°，由于支架ⅲ的接触角与培养皿的接触角(92.05°)大小相接近，将有利于与细胞黏附。

(6)分别测试pp无纺布和支架ⅲ(以质量分数为15％的明胶溶液为原料制备的即用型3d细胞生长支架)的孔隙率，测试方法如下：将一定重量的支架ⅲ(w)或pp无纺布(w)浸入已知体积(v1)的水中，浸泡10分钟，浸泡支架ⅲ或pp无纺布后水的体积记录为v2，挪出支架ⅲ或pp无纺布，记录剩余水的体积为v3，设置6个平行试验组，孔隙率的计算公式如下：ε(％)＝[(v1-v3)/(v2-v3)]×100。通过计算可知，pp无纺布的孔隙率为26.60±2.7％，支架ⅲ的孔隙率为40.40±1.5％，表明明胶的加入可以增加pp无纺布本身的孔隙率，使其更有利于细胞的培养。

(7)分别测试pp无纺布和支架ⅲ(以质量分数为15％的明胶溶液为原料制备的即用型3d细胞生长支架)的膨胀性，测试方法如下：将pp无纺布和支架ⅲ裁减为半径为6mm的圆片，且设置6个平行试验组，放入60℃烘箱中干燥过夜，将pp无纺布或支架ⅲ放置于精密电子天平上称重，记录重量为w1，然后放入已知体积的水中浸泡，在不同的时间间隔内，取出浸泡后的pp无纺布或支架ⅲ，用吸水纸中吸干pp无纺布或支架ⅲ表面的液体，在pp无纺布或支架ⅲ膨胀状态下称量pp无纺布或支架ⅲ膨胀后的重量，记录重量为w2，按如下公式进行膨胀率的计算：s＝(w2-w1)/w1。测试结果见如6，由图6可知，支架ⅲ的吸水量明显大于pp无纺布，且支架ⅲ在短时间内快速膨胀，液体快速大量的被吸附，保证了营养物质的吸附和储存，为细胞的生长和增殖提供营养，更利于细胞3d生长环境的创建。

(8)测试支架ⅲ(以质量分数为15％的明胶溶液为原料制备的即用型3d细胞生长支架)的生物相容性，以pp无纺布和纯明胶作为组照，三组均设置6个平行试验组，具体为：将密度为3×10³个/ml的a549细胞分别接种于支架ⅲ、pp无纺布和纯明胶上，37℃、5％co2孵箱中分别培养3d、5d后，向培养基中加入cck-8试剂，37℃、5％co2孵箱中孵育2h，使用酶标仪(elx800tm,genecompany)进行双波长测定，选择波长为450nm和630nm，测试结果如图7所示，由图7可知，细胞在培养3d和5d后，支架ⅲ上细胞的增值情况明显优于pp无纺布和纯明胶。另外，在以支架ⅲ进行细胞培养期间，分别在培养0h、1h、2h、4h时，将支架ⅲ从培养中取出，用pbs洗掉未粘附细胞，贴壁细胞用4％的多聚甲醛固定，使用结晶紫染色液染色，用显微镜随机选取6个区域拍照，结果如图8所示，由图8可知，在0h时无任何细胞吸附在支架上，1h后可以发现大量细胞粘附于支架的腔体中生长，随着培养时间的延长，细胞在腔室中的呈正常生长状态，出现贴壁生长的趋势，且细胞数量呈现增殖的情况，说明支架ⅲ具有良好的生物相容性。在以pp无纺布进行细胞培养期间，分别在培养0h、4h时，将pp无纺布从培养中取出，用pbs洗掉未粘附细胞，贴壁细胞用4％的多聚甲醛固定，使用结晶紫染色液染色，用显微镜随机选取6个区域拍照，结果如图9所示，由图9可知，pp无纺布并无细胞粘附现象出现，经对比可知，支架ⅲ上蜂窝状小腔室的出现，为细胞的粘附和增殖提供了更多的空间，致使细胞能够快速大量地粘附于支架表面。

(9)测试支架ⅲ(以质量分数为15％的明胶溶液为原料制备的即用型3d细胞生长支架)的细胞迁移性，测试方法如下：将支架ⅲ裁减为半径为1.5mm的圆片，且设置3个平行试验组，将密度为1×10⁵个/ml的a549细胞接种于支架ⅲ上，37℃、5％co2孵箱中培养12h后取出，将接种有细胞的支架ⅲ放置于无细胞的支架ⅲ中间(接种细胞的支架为0层，0层上边的支架为+1层，0层下边的支架为-1层)；将三层支架放置于含有dmem培养基的培养皿中，放入孵箱培养，培养5天后拆分支架，洗涤支架并使用结晶紫染色，最后用显微镜随机选取6个区域拍照，结果如图10所示，由图10可知，0层细胞状态生长良好，在+1层和-1层之间有细胞出现，表明细胞可以从0层迁移到或浸入+1层和-1层之间。

(10)测试支架ⅲ(以质量分数为15％的明胶溶液为原料制备的即用型3d细胞生长支架)的稳定性，具体为：将支架在室温下分别放置1d、30d、50d后进行红外测试、膨胀性测试(参见(7)中的方法)和细胞增殖情况测试(参见(8)中的方法)，测试结果如图11所示，其中，红外测试结果如图11中a所示，可知支架的特征峰未出现明显改变；膨胀性测试结果如图11中b所示，可知支架的膨胀性并未随放置时间的延长而有所改变，支架的吸水性仍然是自生重量的10倍左右，展现出支架良好的吸水性，将利于营养物质的储存；细胞增殖情况测试如图11中c所示，可知细胞在支架上的增殖情况并未随支架放置时间的延长而有所改变，说明本发明中的支架可以在室温条件下长时间储存，其性能不会随储存时间的延长而有所降低。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。