本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种利用木质纤维素原料发酵培养微藻的方法。
背景技术
微藻作为一种新型水生生物质资源，具有生长周期短、生物质产量高和油脂含量高的特点，其生物质生产能力可达陆地植物的30倍，具有不与粮争地及不与人争粮的巨大优势。微藻在可再生能源领域有非常吸引人的巨大发展潜力，比如，微藻具有很强的油脂生产能力，其油脂含量可高达细胞干重的40-80％。因此，微藻极有可能为我国生物质能源短缺提供一条有效解决途径。开发能源微藻资源，发展能源微藻生物炼制产业，不仅符合我国可持续发展的能源战略需求，而且与我国建立资源节约型和环境友好型社会的目标相一致，有助于促进人与自然和谐发展与经济社会可持续发展。
目前，微藻的养殖方式有三种：自养、异养和兼养(自养异养相结合)。相较于利用co2、阳光和无机物作为营养来源的自养培养方式，利用葡萄糖和有机物作为营养来源的异养发酵具有易于扩大培养规模、微藻生长繁殖速度快，生物量浓度高、便于生产过程的控制等优势。现有的微藻异养发酵方法主要是以玉米淀粉来源的葡萄糖作为主要碳源，因此葡萄糖的供给和原料成本是目前限制微藻产业发展的关键问题之一。为了攻克这一难题，人们不断尝试寻找廉价的原料作为微藻培养的底物，开发低成本新型碳源以及配套的生物制备技术具有必要性和广阔的应用前景。
木质纤维素是一类供应丰富且环境友好的可再生生物质，包括秸秆、废纸浆、稻壳、酒糟等农林废弃物。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成。其中，纤维素是由葡萄糖组成的。因此，木质纤维素生物质是潜在的廉价葡萄糖原料，发展以木质纤维素原料为底物的葡萄糖的生产方法，可以显著降低微藻异养发酵原料成本，并同时解决农林废弃物的综合利用问题。
目前，木质纤维素为原料进行微藻培养的现有技术中，一般都是采用真菌来源的纤维素酶先将秸秆等底物进行酶解。发明专利cn201610976321和cn201710248657都公开了利用秸秆纤维水解液培养微藻的方法，该发明利用真菌来源的商业化纤维素酶、半纤维素酶将预处理的农业秸秆进行水解，获得纤维水解液，再以纤维水解液作为糖源进行小球藻的发酵培养。其中纤维素酶的添加量为5-500fpu，成本高昂。
采用真菌来源的酶制剂的策略存在效率和成本上的不足，这主要因为纤维素酶制剂的需要在单独的反应器中通过微生物发酵制备，且制备的工艺与纤维素水解条件不同，生产步骤繁琐复杂，人力物力需求和设备投入等成本显著增加，使得木质纤维素的糖化过程不具有市场竞争力，因此基于真菌来源纤维素酶制剂的糖化以及多不饱和脂肪酸制备技术难以实现大规模的工业应用。
发明专利cn201510858635公开了一种利用秸秆半纤维素培养小球藻的方法，该发明利用碱处理的秸秆作为底物，利用纤维弧菌与小球藻构建了共培养体系，使秸秆水解与小球藻发酵同步进行，但存在秸秆水解效率低、培养周期长等问题。因此，需要找到更高效的木质纤维素酶解的方法和技术，并将其与微藻发酵相结合。
已知纤维小体是热纤梭菌等厌氧细菌生产的一种具有复杂结构和组分的多酶复合体，是自然界中已知的最高效的纤维素降解体系之一。尽管纤维小体及其生产菌株在木质纤维素糖化应用中具有巨大潜力，但其工业化应用仍受到多种因素的限制。当木质纤维素复杂底物中非纤维素成分(如，半纤维素、果胶、淀粉、蛋白质、木质素)含量较高时，糖化效率显著降低。前人主要通过向水解体系里额外添加非纤维小体蛋白来提高纤维小体的活力和对底物的适应力。然而，由于外源添加的蛋白的活性及稳定性会随着糖化过程的进行而降低，因此，酶的消耗需要提高酶添加量或添加次数。此外，这些非纤维小体蛋白作为游离酶添加到糖化体系中，不能与纤维小体相互作用，会显著降低与体系中其他酶的协同作用，不可避免造成大于需求量的酶的额外添加，导致酶制剂成本的居高不下。不仅如此，这种依赖于外源添加游离酶的糖化策略，工艺复杂，对设备要求高，转化效率还不能满足工业化生产要求。
技术实现要素：
针对现有技术中在微藻异养发酵所存在的碳源成本高昂的问题，本发明提供了以木质纤维素类农林废弃物为原料的工艺，所述工艺采用了用于催化木质纤维素糖化的纤维素酶制剂，从而降低了微藻异养发酵的碳源成本。
本发明的技术方案：采用木质纤维素培养微藻的方法，包括以下步骤：
(1)预处理：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于20％，半纤维素含量不高于25％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:2-1:25将步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的糖化培养基中，将纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在34-65℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液；所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、尿素0.8g/l、氯化钙0.1g/l、氯化镁1.8g/l、硫酸亚铁0.0005g/l、硫化钠2g/l、玉米浆4g/l、柠檬酸三钠2g/l、ph6.5-7.5。糖化过程中可通过流加氢氧化钠的方式使ph控制在5.8-6.2。
(3)微藻异养发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到25-180g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的微藻种子液，在16-34℃的温度条件下发酵5-10天，至葡萄糖浓度不高于5g/l时发酵结束；或者在发酵过程中连续流加步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/l，在16-34℃的温度条件、补氮发酵5-10天，获得发酵液。
其中，所述的发酵培养基按照质量比例含有以下成分：酵母粉0.3％，玉米浆0.6％，磷酸二氢钾0.3％，七水合硫酸镁0.03％，硝酸钠0.3％，其余为水，ph6.0。
所述的微藻为具备异养生长能力的单细胞光合微生物，包括微拟球藻、栅藻、小球藻、寇氏隐甲藻、螺旋藻、雨生红球藻。其中，微拟球藻、小球藻、螺旋藻和雨生红球藻可采用光周期的方式进行发酵培养。
(4)后处理：将步骤(3)得到的发酵液离心处理，分离藻细胞与发酵后培养基。
所述方法还包括步骤(5)，具体为：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释或经过1-3倍稀释，用于配制步骤(2)的糖化培养基。
其中，步骤(2)所述的纤维素酶制剂，是通过非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分相互作用，将非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中得到的；所述非纤维小体蛋白为木聚糖酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶、膨胀因子、蛋白酶、淀粉酶或果胶酶；所述纤维小体为由厌氧细菌生产且分泌在胞外的具有木质纤维素降解活性的多酶复合体。所述的纤维小体中的组分为脚架蛋白、有催化功能的酶、组装模块。
所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分相互作用的方式为间接性连接或者直接性连接；所述间接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的蛋白组分通过共价相互作用进行连接，所述直接性连接为：非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接。
优选的是，所述非纤维小体蛋白具有序列表seqidno:1-3,15-18所示的氨基酸序列；以及与如seqidno:1-3,15-18所示的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与如seqidno:1-3,15-18所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。其中：seqidno:15:genbank序列号crz35393.1；seqidno:16:由基因组cp001393.1中1968724至1973904核酸序列编码；seqidno:17:genbank序列号为kc763474.1；seqidno:18:由基因组cp001393.1中2531445至2532785核酸序列编码。
优选的是，所述厌氧细菌为热纤梭菌(clostridiumthermocellum)，黄色溶纤梭菌(clostridiumclariflavum)，嗜纤维梭菌(clostridiumcellulovorans)，解纤维梭菌(clostridiumcellulolyticum)，解纤维醋弧菌(acetivibriocellulolyticus)，溶纤维假拟杆菌(pseudobacteroidescellulosolvens)，白色瘤胃球菌(ruminococcusalbus)，黄化瘤胃球菌(ruminococcusflavefaciens)。其中，所述热纤梭菌为表达外泌的β1,4-葡萄糖苷酶的热纤梭菌。
其中，所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过共价相互作用进行连接，具体为：非纤维小体蛋白和纤维小体组分分别与具有共价相互作用的多肽片段连接，利用多肽片段间特异性共价相互作用实现纤维小体组分与非纤维小体蛋白的共价交联，利用纤维小体组分所带的组装模块，使非纤维小体蛋白结合在纤维小体复合体中。所述与非纤维小体蛋白和纤维小体组分共价相互作用的多肽片段为seqidno:4中所示的碱基序列或seqidno:5中所示的氨基酸序列。具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与共价相互作用的多肽片段对中的一个片段(多肽片段i或ii，即seqidno:4或5)的编码基因；
2)根据1)，通过基因克隆的方法，连接纤维小体组分蛋白与共价相互作用的多肽片段对中的另一个片段(多肽片段ii或i，即seqidno:5或4)的编码基因。
3)根据1)，将非纤维小体蛋白与多肽片段的重组基因序列连接到产纤维小体细菌表达质粒；
4)根据2)，将纤维小体组分蛋白与多肽片段的重组基因序列连接到产纤维小体细菌同源重组质粒，并根据基因组序列设计同源臂。
5)将4)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，并通过同源重组筛选实现重组基因序列对基因组上原始纤维小体组分蛋白序列的替换，从而构建重组菌株，实现纤维小体组分蛋白与多肽片段在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
6)将3)中获得的质粒转化到5)中获得的重组菌株中，实现非纤维小体蛋白与多肽片段在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，基因组表达的纤维小体组分蛋白与质粒表达的非纤维小体蛋白通过所融合的多肽片段i及ii间的特异性共价相互作用实现共价交联，并组装在纤维小体复合体中。
其中，所述非纤维小体蛋白与纤维小体中的组分通过串联表达进行连接，具体为：非纤维小体蛋白与纤维小体的组装模块或具有组装模块的蛋白组分进行融合表达，通过组装模块间的特异性的非共价相互作用，实现将非纤维小体蛋白组装在纤维小体复合体中。所述融合表达为：非纤维小体蛋白的编码基因插入到编码纤维小体组分蛋白的序列的n端、c端或结构域序列中间的基因组上。
所述各自呼应的模块为粘连模块与对接模块。所述对接模块为seqidno:6、seqidno:9-13、seqidno:14中所示的碱基序列，粘连模块为seqidno:7中所示的氨基酸序列。具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与i型对接模块(seqidno:6)的编码基因，或
2)通过基因克隆的方法，连接非纤维小体蛋白与ii型粘连模块(seqidno:7)的编码基因
3)将1)或2)获得非纤维小体蛋白与组装模块的重组基因序列连接到产纤维小体细菌表达质粒
4)将3)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，实现非纤维小体蛋白与i型对接模块或ii型粘连模块在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，质粒表达的非纤维小体蛋白通过所融合的i型对接模块或ii型粘连模块实现与纤维小体脚架蛋白进行特异性非共价相互作用，从而组装在纤维小体复合体中。
所述直接融合表达的具体实现步骤包括：
1)通过基因克隆的方法，将非纤维小体蛋白的编码基因连接到产纤维小体细菌同源重组质粒中，并根据基因组序列设计同源臂。
2)将1)中获得的质粒转化到产纤维小体细菌胞内，并通过同源重组筛选实现非纤维小体蛋白的编码基因插入到基因组上纤维小体组分蛋白的序列的n端或c端或结构域序列中间，从而构建重组菌株，实现非纤维小体蛋白与纤维小体组分蛋白在产纤维小体细菌胞内的融合表达。
最终获得的重组菌株中，非纤维小体蛋白利用与其融合表达的纤维小体组分蛋白的组装模块结合到纤维小体复合体中。
优选的是，步骤(1)中所述的木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合；所述预处理为碱法、稀酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多种的组合；预处理后的木质纤维素底物为木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于12％。
优选的是，步骤(2)糖化步骤中的温度条件为55-60℃，水解体系中的固液重量体积比为1:3-1:10。
优选的是，步骤(3)中，当葡萄糖浓度为60-150g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器。所述补氮操作具体为：流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了以木质纤维素为原料培养微藻的方法，木质纤维素来源的可发酵糖液可作为多种具有异养生长能力的微藻的发酵碳源，原料来源广泛且廉价，有助于微藻产业的大力发展。
(2)本发明所述的工艺采用木质纤维素生物糖化与微藻异养发酵相结合的策略，与现有采用玉米淀粉来源的葡萄糖作为碳源的发酵工艺相比，通过采用木质纤维素生物质为原料，一方面显著降低了微藻异养发酵的生产成本，另一方面还解决了农林废弃物的综合利用问题。
(3)本发明所述工艺采用基于产纤维小体细菌的纤维素酶制剂实现木质纤维素的糖化，与现有的利用秸秆酶解联合微藻发酵的技术相比，显著降低了糖化阶段的用酶成本，纤维素糖化效率为80％-90％。
(4)本发明所述的工艺中，木质纤维素糖化阶段培养基与发酵培养基可循环使用，可以显著节水和减少化学品使用，具有减少废水排放和降低成本的显著效果；这两点在产业上具有重要的意义，不但具有巨大的经济效益，而且环境友好，必然可以走的更加长远。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：通过间接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
通过无缝克隆，将tdk表达盒(包含gapdh基因的启动子)以及pyrf表达盒(包含pyrf自身启动子)克隆到质粒phk(mohr,g.,hong,w.,zhang,j.,cui,g.-z.,yang,y.,cui,q.,etal.(2013)atargetronsystemforgenetargetinginthermophilesanditsapplicationinclostridiumthermocellum,plosone8:e69032.)的抗生素基因cat的下游，并通过引物的设计，在tdk与pyrf表达盒之间增加nhei和xbai酶切位点，在pyrf下游添加eagi和mlui酶切位点，用于同源臂片段的克隆，从而构建得到phk-hr质粒。
选择热纤梭菌纤维小体中的纤维素酶cel9k(外切纤维素酶，由基因组cp002416.1中2113813至2111293核酸序列编码)的酶催化结构域和对接模块之间作为靶向敲入位点。首先，将β-1,4-葡萄糖苷酶bgla(genbank序列号为afo70070.1)编码基因作为目标序列，利用mlui和eagi的酶切位点克隆到同源重组质粒phk-hr中，构建同源重组质粒phk-hr-bgla。上游同源臂hr-up序列为热纤梭菌dsm1313基因组(ncbi数据库中序列号为cp002416.1)中2111347到2112870核酸序列，下游同源臂hr-down为dsm1313基因组中2109848到2111354核酸序列，中间同源臂hr-short为dsm1313基因组中2111347到2111659核酸序列。其次，将构建好的质粒转化到δpyrf中，并按照三步筛选获得底盘菌株。具体筛选方法为：
1)将同源重组质粒phk-hr转化进入pyrf缺失的菌株中，利用含甲砜氯霉素的gs-2半固体培养基(kh2po41.5g/l,k2hpo4·3h2o3.8g/l,尿素2.1g/l,mgcl2·6h2o1.0g/l,cacl2·2h2o150mg/l,feso4·6h2o1.25mg/l,半胱氨酸盐酸1.0g/l,mops钠盐10g/l,酵母提取物6.0g/l,纤维二糖5.0g/l，二水柠檬酸三钠3.0g/l,刃天青0.1mg/l,ph7.4)平板进行筛选，以获得质粒转化子。
2)获得的转化子在mj液体培养基(kh2po41.5g/l,k2hpo4·3h2o3.8g/l,尿素2.1g/l,mgcl2·6h2o1.0g/l,cacl2·2h2o150mg/l,feso4·6h2o1.25mg/l,半胱氨酸盐酸1.0g/l,mops钠盐10g/l,纤维二糖5.0g/l，二水柠檬酸三钠3.0g/l,刃天青0.1mg/l,盐酸吡哆胺2mg/l,生物素0.2mg/l,对氨基苯甲酸0.4mg/l，维生素b120.2mg/l，ph7.4)中转接三代后，涂布含10μg/ml5-氟脱氧尿苷(fudr)的mj半固体培养基进行第一次同源重组筛选。在这一步骤中，由于tdk可以将fudr转化为对细胞有毒的f-dump，同时底盘细胞在mj培养基中必须依靠质粒上的pyrf基因合成尿嘧啶核苷酸才能生存，因此，这一筛选策略保证了质粒上的同源重组模块与基因组发生同源重组的同时，重组后的质粒也发生丢失。根据长同源臂优先发生同源重组的原理，前后两个长同源臂首先与基因组发生同源重组，此时获得的重组子由出发菌株的尿嘧啶营养缺陷型回复成原养型。
3)经第一次同源重组后获得的重组子先在gs-2液体培养基中传代3次，并用相同的培养基对菌液进行梯度稀释后涂布含有500μg/ml5-氟乳清酸(foa)的gs-2半固体培养基进行筛选，获得目的无疤基因敲除/敲入菌株。在这一步骤中，pyrf的反向筛选作用会促使上游长同源臂和短同源臂发生第二次同源重组将pyrf表达框从基因组中去除。第二次同源重组后的突变株又从原养型突变成尿嘧啶营养缺陷型。从而实现基因组上目标位点基因的敲除、敲入或者替换。分别获得同源重组菌株δpyrf-i或δpyrf-ii，分别表达cel48s与多肽片段i或多肽片段ii的融合蛋白。
选择热纤梭菌纤维小体的纤维素外切酶cel48s(由基因组cp002416.1中3228088至3230229核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点，将多肽片段i(seqidno:4)或多肽片段ii(seqidno:5)两个片段的编码序列作为目标序列，利用mlui和eagi的酶切位点分别克隆到同源重组质粒phk-hr中，分别构建获得同源重组质粒phk-hr-i或phk-hr-ii。上游同源臂hr-up为热纤梭菌dsm1313基因组(ncbi数据库中序列号为cp002416.1)中3230200到3230700核酸序列，下游同源臂hr-down为dsm1313基因组中3229699到3230199核酸序列，中间同源臂hr-short为dsm1313基因组中3230200到3230500核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到上述构建的底盘菌株中，并按照上述三步筛选方法获得同源重组菌株δpyrf::bgla-i或δpyrf::bgla-ii。
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将多肽片段ii或多肽片段i连接到木聚糖酶xyna(seqidno:1)的3’端。利用bamhi和xbai酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒phk上。将含有xyna与多肽片段i的重组序列的表达质粒转化到δpyrf::bgla-ii；将含有xyna与多肽片段ii的重组序列的表达质粒转化到δpyrf::bgla-i，从而实现cel48s和xyna能够通过多肽片段i和ii间特异性共价相互作用进行结合。通过提取获得热纤梭菌重组菌株的纤维小体发现，表达的具有共价结合模块的xyna可以外泌到胞外，并与具有共价结合模块的cel48s相互作用，组装到纤维小体复合体中。将上述重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的gs-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例2：通过间接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例1不同的是，将多肽片段ii或多肽片段i连接到纤维小体内切酶celz(seqidno:15)的3’端。将构建的重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的gs-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例3：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将纤维素外切酶cel9-48(seqidno:16)与热纤梭菌的ii型粘连模块cohiict的序列(seqidno:7)或i型对接模块docict的序列(seqidno:6)直接连接起来，其中cohiict或docict的序列连接至cel9-48序列的3’端，获得cel9-48-docict或cel9-48-cohiict序列。
以cel9-48-docict或cel9-48-cohiict序列为目标序列，利用mlui和eagi的酶切位点克隆到同源重组质粒phk-hr中，以乳酸脱氢酶基因clo1313_1160为靶向替换序列，构建同源重组质粒phk-hr-cel9-48。上游同源臂hr-up为热纤梭菌dsm1313基因组(ncbi数据库中序列号为cp002416.1)中1380180到1380679核酸序列，下游同源臂hr-down为dsm1313基因组中1380634到1381133核酸序列，中间同源臂hr-short为dsm1313基因组中1380833到1381133核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到实施例1构建的底盘菌株中，并按照实施例1的三步筛选方法获得同源重组菌株1和2。通过提取重组菌株的纤维小体发现，cel9-48与组装模块的融合蛋白可以外泌到胞外，并通过非共价交联的相互作用方式组装到纤维小体复合体中。将上述重组菌株在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的gs-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例4：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
将膨胀因子epn(seqidno:2)编码基因作为目标序列，选择热纤梭菌纤维小体的脚架蛋白sdba(由基因组cp002416.1中1108113至1109912核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点构建同源重组质粒phk-hr-epn。上游同源臂hr-up为热纤梭菌dsm1313基因组(ncbi数据库中序列号为cp002416.1)中1107610到1108109核酸序列，下游同源臂hr-down为dsm1313基因组中1109916到1110415核酸序列，中间同源臂hr-short为dsm1313基因组中1107809到1108109核酸序列。
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将木聚糖酶xyna(seqidno:1)与ii型粘连模块cohii的序列(seqidno:7)直接连接起来，其中cohii的序列连接至xyna序列的3’端，从而获得xyna-cohii的序列。以xyna-cohii序列为目标序列，利用mlui和eagi的酶切位点克隆到同源重组质粒phk-hr中，以乳酸脱氢酶基因clo1313_1878为靶向替换序列，构建同源重组质粒phk-hr-xyna。上游同源臂hr-up为热纤梭菌dsm1313基因组(ncbi数据库中序列号为cp002416.1)中2194853到2195353核酸序列，下游同源臂hr-down为dsm1313基因组中2196312到2196811核酸序列，中间同源臂hr-short为dsm1313基因组中2195053到2195353核酸序列。
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将果胶酶pela(seqidno:18)编码基因与热纤梭菌的i型对接模块docict的序列(seqidno:6)直接连接起来，其中docict的序列连接至pela序列的3’端，获得pela-docict目标序列。再利用bamhi和xbai酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒phk上，获得表达质粒phk-pcels-pela-docict。由于phk上带有来源于热纤梭菌的纤维素酶cel48s的启动子及信号肽序列(seqidno:8)，表达的目标基因可以外泌到细胞胞外。
将同源重组质粒phk-hr-xyna转化到实施例3构建的重组菌株1中，并按照实施例1所述筛选方法获得同源重组菌株3。再将同源重组质粒phk-hr-epn转化到重组菌株3中，同样的按照实施例1所述筛选方法获得同源重组菌株重组菌株4。最后，将质粒phk-pcels-pela-docict转化到重组菌株4中，从而获得同时表达具有ii型粘连模块的xyna、具有i型对接模块的cel9-48和pela以及融合蛋白epn-sdba的热纤梭菌重组菌株5。
通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的木聚糖酶xyna、纤维素外切酶cel9-48、果胶酶pela都通过直接性连接的方式结合在热纤梭菌纤维小体上、膨胀因子epn通过与脚架蛋白sdba的融合表达也可以外泌并组装到纤维小体复合体中。将重组菌株5在以5克每升纤维素或纤维二糖为碳源的gs-2培养基中培养至对数中期，可以作为全菌酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例5：通过直接性连接的方法，构建基于热纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
将实施例4构建的重组菌株5，在以5克每升纤维素为碳源的gs-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例6：通过直接性连接的方法，构建基于黄色溶纤梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
利用重叠延伸聚合酶链式反应的方法，将纤维素外切酶cel48s与黄色溶纤梭菌的i型对接模块序列dociccl(seqidno:9)连接起来，其中dociccl的序列连接至cel48s序列的3’端，从而获得cel48s-dociccl序列。再利用bamhi和xbai酶切位点，将连接起来的重组序列作为目标序列克隆到表达质粒phk上。构建好的质粒转化到黄色溶纤梭菌(clostridiumclariflavumdsm19732)中获得表达的具有dociccl的cel48s重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有dociccl的cel48s可以外泌到胞外，并组装到黄色溶纤梭菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的gs-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例7：通过直接性连接的方法，构建基于白色瘤胃球菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例6不同的是，将纤维素外切酶cel48s与白色瘤胃球菌的i型对接模块序列docira(seqidno:10)连接起来，从而获得cel48s-docira序列。构建好的质粒转化到白色瘤胃球菌(ruminococcusalbussy3)中获得表达的具有docira的cel48s的重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有docira的cel48s可以外泌到胞外，并组装到白色瘤胃球菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的gs-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例8：通过直接性连接的方法，构建基于黄化瘤胃球菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例6不同的是，将纤维素外切酶cel48s与黄化瘤胃球菌的i型对接模块序列docirf(seqidno:11)连接起来，从而获得cel48s-docirf序列。构建好的质粒转化到黄化瘤胃球菌(ruminococcusflavefaciens)中获得表达的具有docirf的cel48s的重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有docirf的cel48s可以外泌到胞外，并组装到黄化瘤胃球菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的gs-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例9：通过直接性连接的方法，构建基于溶纤维假拟杆菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例6不同的是，将纤维素外切酶cel48s与溶纤维假拟杆菌的i型对接模块序列docipc(seqidno:13)连接起来，从而获得cel48s-docipc序列。构建好的质粒转化到溶纤维假拟杆菌(pseudobacteroidescellulosolvensdsm2933)中获得表达的具有docipc的cel48s的重组菌株。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的具有docipc的cel48s可以外泌到胞外，并组装到溶纤维假拟杆菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的gs-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例10：通过直接性连接的方法，构建基于嗜纤维梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
将蛋白酶prol(seqidno:3)编码基因作为目标序列，选择嗜纤维梭菌纤维小体的纤维素酶clocel_2823(由基因组cp002160.1中3464080至3466140核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点。利用mlui和eagi的酶切位点克隆到同源重组质粒phk-hr中，构建同源重组质粒phk-hr-prol。同源臂hr-up、hr-down和hr-short分别为clostridiumcellulovorans743b基因组中(ncbi数据库中序列号为cp002160.1)中3466141到3466640、3465641到3466140以及3466141到3466441核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到pyrf缺失的743b突变株中，并按照实施例1的方法筛选获得蛋白酶prol与纤维素酶clocel_2823融合表达的同源重组菌。通过提取重组菌株的纤维小体发现，该融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的gs-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例11：通过直接性连接的方法，构建基于解纤维梭菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例10不同的是，将淀粉酶amya(seqidno:17)编码基因作为目标序列，选择解纤维梭菌纤维小体的纤维素酶ccel_0729(由基因组cp001348.1中843122至845197核酸序列编码)的5’端作为靶向敲入位点。同源臂hr-up、hr-down和hr-short分别为clostridiumcellulolyticumh10基因组中(ncbi数据库中序列号为nc_011898)中842441到842941、842942到843441以及842641到842941核酸序列。将构建好的质粒再分别转化到pyrf缺失的h10突变株中，筛选获得淀粉酶amya与纤维素酶ccel_0729融合表达的同源重组菌。通过提取重组菌株的纤维小体发现，该融合蛋白可以外泌到胞外，并组装到纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的gs-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例12：通过直接性连接的方法，构建基于解纤维醋弧菌纤维小体的纤维素酶制剂
与实施例10不同的是，将果胶酶pela(seqidno:18)编码基因与解纤维醋弧菌的i型对接模块序列dociac(seqidno:14)连接起来，从而获得pela-dociac序列。构建好的质粒转化到解纤维醋弧菌(acetivibriocellulolyticus)中。通过提取重组菌株的纤维小体发现，表达的pela可以外泌到胞外，并通过具有的dociac组装到解纤维醋弧菌纤维小体复合体中。将该菌株在以5克每升纤维素为碳源的gs-2培养基中培养至对数后期或平台前期，然后通过低速离心去除沉淀细胞，上清液可以作为纤维小体酶制剂用于木质纤维素的生物糖化。
实施例13：采用木质纤维素培养微藻
(1)预处理：对玉米秸秆按照文献(中国造纸，2015,34,1-6)中采用的磺化法进行预处理，得到木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于10％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:6，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的6l培养基中，然后将实施例1制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在55℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、尿素0.8g/l、氯化钙0.1g/l、氯化镁1.8g/l、硫酸亚铁0.0005g/l、硫化钠2g/l、玉米浆4g/l、柠檬酸三钠2g/l、ph6.5-7.5。糖化过程中可通过流加氢氧化钠的方式使ph控制在5.8-6.2。
(3)微藻异养发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到70-80g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的微拟球藻种子液，采用光周期12:12的方式，在25℃的温度条件下发酵5天，至葡萄糖浓度不高于5g/l时发酵结束。
所述的发酵培养基按照质量比由以下组分组成：酵母粉0.3％，玉米浆0.6％，磷酸二氢钾0.3％，七水合硫酸镁0.03％，硝酸钠0.3％，其余为水，ph6.0。
(4)后处理：将步骤(3)得到的发酵液离心处理，分离藻细胞与发酵后培养基。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释，直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例14：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对小麦秸秆按照专利cn201610133959中采用的水热与磺化法联合预处理法进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于8％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:3.5，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的350l培养基中，然后将实施例2制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到140-150g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的栅藻种子液，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/l，在28℃的温度条件、6.5的ph条件下发酵7天，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释3倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例15：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对灌木枝条按照文献(binli,etal.recentprogressonthepretreatmentandfractionationoflignocellulosesforbiorefineryatqibebt.journalofbioresourcesandbioproducts,2017,2(1),4-9)中的碱法预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于15％，半纤维素含量不高于7.5％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:8，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的800l培养基中，然后将实施例3制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到90-110g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的小球藻种子液，连续流加步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/l，在30℃的温度条件、6.0的ph条件下发酵8天，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例16：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对木片按照文献(biotechnologyforbiofuels，2014，7:116)中的碱法与水热相结合的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于11％，半纤维素含量不高于10％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:10，将100kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的1000l培养基中，然后将实施例4制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在60℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到60-70g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的寇氏隐甲藻种子液，在20℃的温度条件下发酵3天，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例17：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对稻草按照文献(纤维素科学与技术，2002，3，47-52)中的汽爆预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于20％，半纤维素含量不高于14.5％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:5，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的5l培养基中，然后将实施例5制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在58℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到50-60g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的螺旋藻种子液，在34℃的温度条件、8.0的ph条件下采用光周期18:6的方式发酵7天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/l，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例18：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对废纸按照文献(bioresourcetechnology，2004，91，93-100)中的水热预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于7％，半纤维素含量不高于11％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:2，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的2l培养基中，然后将实施例6制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在37℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到160-180g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的小球藻种子液，在28℃的温度条件、6.0的ph条件下，采用光周期18:6的方式发酵9天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/l，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释3倍后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例19：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对麦秆按照实施例13预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于11％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:15，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的3l培养基中，然后将实施例7制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在37℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到30-50g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的小球藻种子液，在30℃的温度条件、6.5的ph条件下发酵5天；连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/l，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例20：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对麦秆按照实施例13预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于11％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:10，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的2l培养基中，然后将实施例8制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在65℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到40-60g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的小球藻种子液，在30℃的温度条件、6.5的ph条件下发酵7天，连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/l；流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释1倍然后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例21：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对麦秆按照实施例14预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于8％，半纤维素含量不高于8％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:4.5，将1kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的4.5l培养基中，然后将实施例9制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在34℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到110-130g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的螺旋藻种子液，在32℃的温度条件、9.0的ph条件下，采用光周期12:12的方式发酵10天；连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/l，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍然后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例22：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对玉米芯按照文献(生物加工过程，2010，3，66-72)中的稀酸水解预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于9％，半纤维素含量不高于13％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:5，将0.4kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的2l培养基中，然后将实施例10制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在42℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到60-80g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的螺旋藻种子液，在30℃的温度条件、8.5的ph条件下，采用光周期18:6的方式发酵7天；连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/l，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释1倍然后用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例23：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对废纸按照实施例17的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于7％，半纤维素含量不高于9％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:25，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的5l培养基中，然后将实施例11制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在40℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到25-35g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的微拟球藻种子液，在25℃的温度条件下发酵4天，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮，至葡萄糖浓度不高于5g/l时发酵结束。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基不稀释直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。
实施例24：采用木质纤维素培养微藻
与实施例13不同的是，
(1)预处理：对玉米芯按照实施例17的预处理技术进行预处理，得到木质素含量不高于5％，半纤维素含量不高于25％的木质纤维素底物；
(2)糖化：按照固液重量体积比1:3，将0.2kg干重步骤(1)得到的木质纤维素底物转移至厌氧发酵罐的0.6l培养基中，然后将实施例12制备的纤维素酶制剂加入所述木质纤维素底物中，在40℃的温度条件下进行水解反应，得到含有葡萄糖的糖液。
(3)微藻发酵：当步骤(2)得到的糖液中葡萄糖浓度达到100-120g/l后，使糖液通过发酵罐出口装配的过滤组件进入生物反应器；向生物反应器中添加培养基组分，获得发酵培养基，并高温高压灭菌；然后接入活化的雨生红球藻种子液，在16℃的温度条件、7.0的ph条件下，采用光周期12:12的方式发酵5天；连续流加实施例14步骤(2)获得的糖液，使糖浓度维持在5-10g/l，流加50％(w/v)的玉米浆溶液进行补氮。
(4)后处理：与实施例13相同。
(5)培养基再利用：将步骤(4)固液分离得到的发酵后培养基稀释2倍，然后直接用于配制步骤(2)的糖化培养基。
表1.实施例13-24采用木质纤维素培养微藻的结果列表
由表1可知，实施例13-24中采用木质纤维素培养微藻的方法，纤维素糖化率为82.50-90.80％，微藻生物量为15.83-90.67g/l，培养基再利用后的纤维素糖化率为80.50-90.5％。这说明，本发明所述的采用木质纤维素培养微藻的方法，不但具有原料来源广泛且廉价的优势，而且通过木质纤维素生物糖化与与微藻异养发酵相结合的策略，水解效率大幅度提高，纤维素糖化效率可达到80％-90％。此外，与第一轮的纤维素糖化率相比，培养基再利用后的纤维素糖化率相差无几，说明本发明所述的工艺中，木质纤维素糖化阶段培养基与发酵培养基可循环使用，可以显著节水和减少化学品使用，具有减少废水排放和降低成本的显著效果。
因此，本发明所述的采用木质纤维素培养微藻的方法解决了现有技术中培养微藻所存在的原材料和酶制剂成本高、水解效率低的问题，将产生巨大的经济效益，具备广阔的市场前景。
序列表
<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120>采用木质纤维素培养微藻的方法
<160>14
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>212
<212>prt
<213>热解纤维素果汁杆菌(caldicellulosiruptorsp.)
<400>1
alailethrleuthrserasnalaserglythrtyraspglytyrtyr
151015
tyrgluleutrplysaspserglyasnthrthrmetthrvalaspthr
202530
glyglyargphesercysglntrpserasnileasnasnalaleuphe
354045
argthrglylyslyspheasnthralatrpasnglnleuglythrval
505560
lysilethrtyrseralathrtyrasnproasnglyasnsertyrleu
65707580
cysiletyrglytrpserlysasnproleuvalgluphetyrileval
859095
glusertrpglysertrpargproproglyalathrserleuglythr
100105110
valthrileaspglyglythrtyraspiletyrlysthrthrargval
115120125
asnglnproserilegluglythrthrthrpheaspglntyrtrpser
130135140
valargthrserlysargthrserglythrvalthrvalthrasphis
145150155160
phelysalatrpalaalalysglyleuasnleuglythrileaspgln
165170175
ilethrleucysvalgluglytyrglnserserglyseralaasnile
180185190
thrglnasnthrpheserilethrseraspserserglyserthrthr
195200205
prothrthrthr
210
<210>2
<211>327
<212>prt
<213>黄色溶纤梭菌(clostridiumclariflavum)
<400>2
metasnphelyslysileargleuphethralaileleuileileala
151015
alaglnvalleusertyrasnpheileserseralaglnleuglnval
202530
glyaspvalasnglyaspasnasnvalaspserileaspphealaleu
354045
metlysserpheileleulysileileasnthrleuproalagluasp
505560
serleuleualaglyaspleuaspglyaspglyserileasnserile
65707580
aspcysalaleumetlysglntyrleuleuglymetilelysvalphe
859095
prolysthrglnserproalaprothrprothrasnthrproleupro
100105110
glutyrsergluprotyrproglytrpasplysileargserglytyr
115120125
alathrtyrthrglyserglytyrvalglyglyilealaleuleuasp
130135140
proileprogluaspmetgluilevalalavalasnlysproaspphe
145150155160
asncystyrglyvalglnalaalaleualaglyalatyrleugluval
165170175
thrglyprolysglythrthrvalvaltyrvalthraspcystyrthr
180185190
glualaprogluglyalaleuaspleucysglyilesercysasplys
195200205
ileglyaspthrasnvalproglyglylysileaspvalthrtrparg
210215220
ileileproalaproilethrglyasnpheiletyrargileleupro
225230235240
alaserserlystrptrpphealaileglnvalargasnhislystyr
245250255
provalmetlysmetglutyrphelysaspglyglutrpvalaspile
260265270
prolysaspargcysasntyrphevalileasnasnleuaspthrser
275280285
asnleulysileargilethraspileargglylysvalvalthrasp
290295300
ileileaspproileproaspasnleumetasnglycyspheilegln
305310315320
glyasnvalglnpheproasp
325
<210>3
<211>440
<212>prt
<213>溶蛋白杆菌(coprothermobacterproteolyticus)
<400>3
metlyslysileleuleuthrleuvalilealavalleuleuleuser
151015
glyphealaglyvallysseralagluleuleuphevalserasnser
202530
thrthrthrasnglngluaspprogluasngluileilevalglytyr
354045
lysgluasnthraspvalalavalleuserlysglnvalglulysthr
505560
thrglyalalysleuserarglysglyleulysasnphealavalphe
65707580
lysleuproglnglylysalaalaaspvalvalmetasnglnleulys
859095
asnaspproasnvalglutyrvalgluproasntyrilealahisala
100105110
pheaspvalproasnaspthrphepheasnprotyrglntrpasnphe
115120125
tyrasptyrglymetthrserasnglytyrvalserasntyrglyile
130135140
glnalavalseralatrpasnilethrlysglyalaglyvallysval
145150155160
alaileileaspthrglyvalalatyrgluasntyrglyalatyrthr
165170175
lysalaproaspleualaasnthrleupheaspthralaasnalatyr
180185190
aspphevalasnasnaspthrhisalaasnaspaspasnserhisgly
195200205
thrhisvalalaglythrilealaglnserthrasnasnglymetgly
210215220
alaalaglyilealatyrglnalathrileleuproilelysvalleu
225230235240
aspsergluglyserglythrtyraspalailealaasnglyileile
245250255
trpalaalaasplysglyalaargvalileasnmetserleuglygly
260265270
serserglyserthrthrleuglnasnalaileglntyralatyrasn
275280285
lysglyvalvalilevalcysalaserglyasnaspargargserthr
290295300
valsertyrproalaalatyrthrglncysilealavalglyserthr
305310315320
argpheaspglythrargalaargtyrserasntyrglyseralaleu
325330335
aspilevalalaproglyglyaspthrservalaspglnasnhisasp
340345350
glytyrglyaspglyileleuglnglnthrphealagluglyserpro
355360365
thraspphealatyrtyrphepheglnglythrsermetalaserpro
370375380
hisvalalaglyvalalaalaleuvalleuseralahisprothrtyr
385390395400
thrasngluglnvalargthralaleuglnserthralalysaspleu
405410415
glythralaglytrpasplystyrtyrglytyrglyleuvalasnala
420425430
tyralaalavalasntrpthrpro
435440
<210>4
<211>13
<212>prt
<213>酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)
<400>4
alahisilevalmetvalaspalatyrlysprothrlys
1510
<210>5
<211>97
<212>prt
<213>酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)
<400>5
sersergluglnglyglnserglyaspmetthrileglugluaspser
151015
alathrhisilelyspheserlysargaspgluaspglylysgluleu
202530
alaglyalathrmetgluleuargaspserserglylysthrileser
354045
thrtrpileseraspglyglnvallysaspphetyrleutyrprogly
505560
lystyrthrphevalgluthralaalaproaspglytyrgluvalala
65707580
thralailethrphethrvalasngluglnglyglnvalthrvalasn
859095
gly
<210>6
<211>55
<212>prt
<213>热纤梭菌(clostridiumthermocellum)
<400>6
tyrglyaspvalasnaspaspglylysvalasnserthraspalaval
151015
alaleulysargtyrvalleuargserglyileserileasnthrasp
202530
asnalaaspleuasngluaspglyargvalasnserthraspleugly
354045
ileleulysargtyrileleu
5055
<210>7
<211>160
<212>prt
<213>热纤梭菌(clostridiumthermocellum)
<400>7
serserilegluleulyspheaspargasnlysglygluvalglyasp
151015
ileleuileglythrvalargileasnasnilelysasnphealagly
202530
pheglnvalasnilevaltyraspprolysvalleumetalavalasp
354045
progluthrglylysgluphethrserserthrpheproproglyarg
505560
thrvalleulysasnasnalatyrglyproileglnilealaaspasn
65707580
aspproglulysglyileleuasnphealaleualatyrsertyrile
859095
alaglytyrlysgluthrglyvalthrglugluserglyileileala
100105110
lysileglyphelysileleuglnlyslysserthralavallysphe
115120125
glnaspthrleusermetproglyalaileleuglythrglnleuphe
130135140
asptrpaspglygluvalilethrglytyrgluvalileglnproasp
145150155160
<210>8
<211>891
<212>dna
<213>热纤梭菌(clostridiumthermocellum)
<400>8
tagtactattaaagtcagacttggttaaatataaattttatgacttgcatacaaacttga60
tgtgtattataataaaaatacaaaacaaaatagcaataatttactcagttatttttgaaa120
tgggggtagtattaatatcgtataatggggttgcatatctgctgtctttcgaaaaaagca180
caagaacttcaaatgtttccatagtgaaatttaaaaattggagatttctttgttgccccc240
tcaaaaagtatatttttttcgaagatatatatatggaatttattgattaatttaagttat300
taattttggccttttagggtcgttgaaaactgaatatgttaagttgttttgcgtgattca360
gctgcatttgacgtaagacttcgccggtctgtttaaattcccataataagatgtatttat420
tgtagtaataatctggcatctacaaatttcagtatttgcaatagtctctgttcaaaaaag480
caattgtcttttaaacctttcagtattgtcttcgtggcagtttcttttgttatacgtcgt540
tccgacaaaaaaatgtaaatttatgtcaaatgcgcggctgatttgataaaaaagtttgtt600
aacacaaatttattatgttaacacaagtattttttgggtccagcttagttttatgatgaa660
aataatgcgtaaaatttatccgcaaaaagggggaatgaatttattgcgggtaggttgcat720
tatttcatcatataacttaaaaagaataaaaaagtatatttgaaaggggaagatggagag780
atggtaaaaagcagaaagatttctattctgttggcagttgcaatgctggtatccataatg840
atacccacaactgcattcgcaggtcctacaaaggcacctacaaaagatggg891
<210>9
<211>59
<212>prt
<213>黄色溶纤梭菌(clostridiumclariflavum)
<400>9
tyrglyaspleuasnglyasplysleuvalasnserileasppheala
151015
leuleulysiletyrleuleuglytyrserlysglupheprotyrglu
202530
tyrglyilelysseralaaspleuasnargasnglygluvalaspser
354045
ileaspphealaileleuargserpheleuleu
5055
<210>10
<211>57
<212>prt
<213>白色瘤胃球菌(ruminococcusalbus)
<400>10
argglyaspvalasnglyaspglyvalvalasnvalthraspvalala
151015
lysilealaalahisvallysglylyslysileleuthrglyaspser
202530
leulysasnalaaspvalasnpheaspglyservalasnilethrasp
354045
ilethrargilealaalaphevallys
5055
<210>11
<211>56
<212>prt
<213>黄化瘤胃球菌(ruminococcusflavefaciens)
<400>11
tyrglyaspalaasncysaspglyasnvalserilealaaspalathr
151015
alaileleuglnhisleuglyasnargasplystyrglyleuargala
202530
glnglymetleuasnalaaspvalaspglyglnserglyvalthrala
354045
asnaspalaleuvalleuglnlys
5055
<210>12
<211>54
<212>prt
<213>解纤维梭菌(clostridiumcellulolyticum)
<400>12
tyrglyasptyrasnasnaspglyserileaspalaleuasppheser
151015
serphelysmettyrleumetasnprovalargthrtyrthrgluval
202530
leuaspleuasnseraspasnthrvalaspalaileaspphealaile
354045
metlysglntyrleuleu
50
<210>13
<211>57
<212>prt
<213>溶纤维假拟杆菌(pseudobacteroidescellulosolvens)
<400>13
tyrglyaspvalthrglyaspglnleuvalthraspalaasplysthr
151015
lysvalserasntyrileleuglyservaltyrleuthrserargglu
202530
phealaalaalaaspvalasnglyaspglnvalvalasnserglyasp
354045
leuthrleuileasnarghisileleu
5055
<210>14
<211>58
<212>prt
<213>解纤维醋弧菌(acetivibriocellulolyticus)
<400>14
lysglyaspvalaspleuaspglyalaalaasnserileaspphegly
151015
lysmetargleucysleuleuglylysserproalaphethrglygln
202530
alaleuaspasnalaaspleuasnaspaspglyalapheasnserile
354045
asppheglytyrmetarglyslysleuleu
5055