专利名称：：一种完全利用木质纤维素生产富马酸的方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，尤其是利用木质纤维素资源的微生物发酵产有机酸的方法，具体涉及将木质纤维素完全利用于微生物发酵生产富马酸的方法。
背景技术：
：富马酸(FumaricAcid)，是一种重要的有机基本化工原料和精细化工产品，主要用于合成不饱和聚酯树脂等，广泛用于涂料、树脂、医药、增塑剂等领域，并可作为添加剂用于食品飼料工业以及医药领域。同时作为一种重要的四碳平台化合物，富马酸还可以通过酶催化转化等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸等其他四碳化合物。当前富马酸生产的主流技术是顺酐异构法，其原料苯的毒性严重限制了富马酸在食品及医药等方面的应用。近年来随着石油价格的不断上涨，富马酸的生产成本也不断提高，研究利用可再生的生物质资源发酵制备富马酸成为大势所趋。发酵法制备富马酸的常用菌种为根霉菌(i/^o;w),如米根霉(/.W7加e)、少根根霉(兄arWzi^)以及黑根霉(i.m'gn'cara)等，使用的原料有葡萄糖、木糖、淀粉等，在发酵过程中产生的主要副产物为苹果酸、乳酸等杂酸。美国专利US4877731公开了一种通过分阶段溶氧控制策略发酵i.an^/zws利用葡萄糖生产有机酸的方法，富马酸占发酵产总酸的比例约为78%，同时发酵液中含有琥珀酸、苹果酸、a-酮戊二酸等多种有机酸。本发明人公开了一种富马酸产生菌及其诱变筛选方法和利用该菌抹发酵葡萄糖生产富马酸的方法，经液体深层发酵富马酸浓度达到90120g/L,富马酸产量占总酸产量的90%95%。除了使用葡萄糖为原料，HelenaKautola等利用木糖为原料，固定化发酵i.wr/n'zw,10.25天后得到富马酸最大产量为16.4g/L(ApplMicrobiolBiotechnol,1989，31:448452);CartaF.S等利用根霉菌发酵富含淀粉的木质纤维素木薯甘蔗渣酶解液得到富马酸产量为21.28g/L(BioresourceTechnology,1999,68:2328)。到目前为止，主要研究集中于根霉菌发酵葡萄糖生产富马酸，而以木糖等其他生物质资源作为发酵培养基的碳源，富马酸产量低，生产速率差，糖酸转化率低，制约了发酵产富马酸的工业化。木质纤维素来源于农作物废弃物，它包括玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣、废木屑等工农业废弃物，含35%50%的纤維素，20%35%的半纤维素和10%15%的木质素，其降解产物中富含大量的糖类，主要有纤维素降解产物葡萄糖以及半纤维素降解产物木糖等。因此，木质纤维素是一笔巨大的潜在资源，若利用得当，就可以化废为利，兼收经济、环境和社会效益。对于我国这样一个人口众多，人均资源贫乏的农业大国，研究与推广木质纤维素的资源化对保护环境，发展经济具有重大的现实意义。目前对微生物如何有效利用木质纤维素这一方法的研究主要集中于将木质纤维素降解得到的混合糖液用于发酵产乙醇的方面，但是由于葡萄糖对乙醇发酵有很强的抑制作用，以及混和糖利用在乙醇发酵上有困难等问题，在这类产品的生产方法的开发改进问题还有待解决。而其他研究也限于诸如将降解得到的糖液分别分离提纯后，再利用纯木糖转化为木糖醇等方面，然而木糖的转化率低、代谢效率差是解决木质纤维素有效利用的一个关键问题，木质纤维素的完全利用还需要在生产方法上进一步改良。
发明内容本发明的目的是提供一种能将木质纤维素的降解液完全利用于微生物发酵生产富马酸的方法，主要在于可以将降解半纤维素得到的木糖和降解纤維素得到的葡萄糖几乎完全利用于发酵生产富马酸，实现木质纤维素的高效利用，有效降低富马酸生产的成本。为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案如下以两步法降解木质纤维素得到的两步降解液为原料，将其分别用于^f艮霉菌的种子培养步骤以及发酵产富马酸步骤。将降解半纤維素得到的木糖溶液配制成种子培养基用于种子培养的同时，再将降解纤维素的产物葡萄糖溶液配制成发酵产酸培养基用于发酵产富马酸，实现完全利用木质纤维素发酵生产富马酸的技术目的。具体的步骤如下1、对木质纤维素进行降解本发明所述的对木质纤维素的降解主要是两步降解法，即首先降解木质纤维素中的半纤维素得到木糖以供种子培养步骤，再降解木质纤维素中的纤维素得到葡萄糖以供发酵产富马酸步骤。1)降解半纤维素木质纤维素原料经过除杂粉碎、稀酸浸泡预处理后，使用3%的稀硫酸，20(TC处理120分钟，过滤后将滤液收集得到半纤维素降解液。在此过程中，半纤维素非常容易被降解得到以木糖为主的五碳糖降解液；利用Ca(0H)2调节该降解液pH至10,再用酸溶液调节到7，过滤CaS04沉淀以及不溶物，得到的主要含有木糖的降解液供种子培养用；2)降解纤维素重新加酸降解残留的纤维素(主要为微晶纤维素)。降解完半纤维素后剩余的固体残渣于250°C,3%硫酸处理5分钟，将剩余纤维素的75。/。可转化为葡萄糖，该降解液再经过蒸发浓缩脱毒，得到纤維素降解液供发酵产酸用得到可发酵的降解产物葡萄糖降解液以备用于发酵产富马酸步骤。2、半纤维素降解液用于种子培养1)配制种子培养基称量一定量的半纤维素降解液稀释或浓缩成浓度为1040g/L的木糖溶液，加入种子培养必需的营养物质，配制成种子培养基，将种子培养基在11512rC的高温下灭菌1530分钟，冷却；种子培养所必需的营养物质为(NH4)2S041.53g/L，酵母膏04g/L,玉米浆05mL/L，KH2P040.11g/L，MgS04.7H200,1g/L,ZnS04'7H200.010.1g/L,FeS04.7H20O.O卜O,lg/L,琼脂03g/L,添加中和剂控制pH为46.5;其中,添加的中和剂为H2S04或HCI;2)种子培养按照1%5%的接种量接入配制好的霉菌孢子悬浮液，置于温度为3035°C，培养1842小时后的种子液备用以发酵产富马酸。3、纤维素降解液用于发酵富马酸1)制备发酵产酸培养基将降解纤维素后得到的葡萄糖降解液浓缩至80120g/L,加入发酵产酸必需的营养物质，配制成发酵产酸培养基，将发酵产酸培养基在11512rC的高温下灭菌1530分钟，冷却；发酵产酸培养基所必需的营养物质为(NH4)2S0403g/L,酵母膏01g/L,KH2PO40.11.0g/L，MgS04'7H200.11.0g/L,ZnS04-7H200.010.1g/L，FeS04'7H200.010.1g/L,通过向培养基中添加中和剂控制pH为3.06.0;其中，添加的中和剂为CaC03、Ca(OH)2、NaOH或NaHC03;2)接种种子液发酵产富马酸量取种子培养得到的种子液，按照10%30%的接种量接入发酵产酸培养中，置于温度为3035。C，发酵培养6096小时，得到富马酸。本发明的有益效果在于将木质纤维素资源通过工艺成熟的两步法处理d旦得到的降解糖液不合并，将主要含有木糖的半纤维素降解液和主要为葡萄糖的纤维素降解液分别用于种子培养以及发酵，利用霉菌发酵高产富马酸，所用原料为木质纤维素类物质，来源更加广泛，且不经过分离提纯，有效降低了生产成本，具备优异的工业化生产前景。且本发明的整个技术方案不仅充分利用了木质纤维素中的木糖，避免了木糖直接用于发酵产酸的效率低的问题，而且充分利用了木质纤维素资源，降低了生产成本。图1完全利用木质纤维素类两步降解糖液生产富马酸的工艺流程图具体实施方式实施例1本实施例说明了两步法降解木质纤维素得到两种糖液的步骤。(1)木质纤维素原料除杂，粉碎到粒径50目备用；(2)用1。/。的稀酸浸泡过夜处理后过滤；(3)加入3%的稀硫酸，200。C处理120分钟；(4)过滤后将滤液收集得到半纤维素降解液，半纤维素转化率为70%90%,经过Ca(0H)2调节pH至10,再^^用酸溶液调节到pH为7,过滤;琉酸4丐沉淀以及不溶物，得到的主要含有木糖的半纤维素降解液供种子培养用；(5)将上述剩余的固体残渣250°C,3%硫酸处理25分钟，将剩余纤维素中约50%80%转化为葡萄糖，经过蒸发浓缩脱毒，得到纤维素降解液供发酵产酸用。不同种木质纤维素降解得到的两种糖液指标如表1:表1不同木质纤维素降解得到的两种糖液含量木质纤维素种类半纤维素降解液木糖(g/L)半纤维素转化率(%)纤维素降解液葡萄糖(g/L)纤维素转化率(%)玉米秸秆19.99018.472玉米芯17.98020.476甘庶渣23.3卯21.968废木屑15.57516.373实施例2本实施例说明完全利用木质纤维素降解液生产富马酸的步骤。菌种霉菌(孢子悬浮液，浓度为1(^个/mL)(1)配制培养基a.种子培养基将实施例1中降解半纤维素得到的木糖降解液浓縮得到浓度为29.5g/L的木糖溶液，加入霉菌种子培养必需的营养物质(NH4)2S042.5g/L,酵母膏2.4g/L,玉米浆2mL/L,KH2PO40.4g/L,MgS04'7H200.4g/L,ZnS04-7H200.05g/L，FeS04-7H200.01g/L,琼脂2g/L,力。H2S04调节pH为4.5。b.发酵产酸培养基将实施例1中纤维素降解液蒸发浓缩脱毒并适当浓缩或稀释得到浓度为80g/L的葡萄糖溶液，加入霉菌发酵产酸必需的营养物质(NH4)2S041.8g/L,酵母膏0.4g/L,KH2P040.4g/L，MgS04.7H200.4g/L,ZnS04.7H200.05g/L,FeS04'7H200.01g/L,加入过量CaC0380g/L,解除产物抑制作用并保持发酵液pH5.5。a和b中碳源、氮源分开灭菌，115。C灭菌15分钟，CaC03干热灭菌，冷却后混合后备用；(2)种子培养将孢子悬浮液按照4%的接种量接入装有50mL种子培养基的250mL凹槽摇瓶中，置于温度为34。C、转速为180rpm的摇床上培养种子液，42小时结束。(3)发酵产酸步骤(2)中孢子悬浮液按照10。/。的接种量接入装有50mL发酵产酸培养基的250mL凹槽摇瓶中，置于温度为34。C、转速为160卬m的摇床上，培养60小时结束。(4)结果对不同霉菌的种子培养结果见表2。表2数据统计结果菌种42h后残余木糖菌体干重木糖转化率富马酸产量糖酸转化率(g/L)(%)(g/L)(g/g葡萄糖)少根根審ME-F216.14.479.328.60.42米根霉ME-Fll7.53.974.628.10.41实施例3本实施例与实施例2方法相同，条件改变。菌种根霉(孢子悬浮液，浓度为1(^个/mL)(1)配制培养基a.种子培养基将实施例1中降解半纤维素得到的木糖降解液稀释得到浓度为10g/L的木糖溶液,加入霉菌种子培养必需的营养物质(NH4)2S041.5g/L,KH2P040.1g/L,MgS04'7H200.1g/L,ZnS04'7H200.01g/L，FeS04'7H200.01g/L,力口HC1调节pH为4。b.发酵产酸培养基将实施例1中纤维素降解液蒸发浓缩脱毒并适当浓缩或稀释得到浓度为100g/L的葡萄糖溶液，加入霉菌发酵产酸必需的营养物质KH2P040.1g/L,MgS04.7H200.1g/L，ZnS04'7H200,01g/L,FeS04.7H200.01g/L,加入过量Ca(OH)80g/L,解除产物抑制作用并保持发酵液pH3.0。a和b中碳源、氮源分开灭菌，115。C灭菌30分钟，CaC03干热灭菌，冷却后混合后备用；(2)种子培养将孢子悬浮液按照1%的接种量接入装有50mL种子培养基的250mL凹槽摇瓶中，置于温度为30°C、转速为100rpm的摇床上培养种子液，18小时结束。(3)发酵产酸步骤(2)中孢子悬浮液按照20%的接种量接入装有50mL发酵产酸培养基的250mL凹槽摇瓶中，置于温度为3CTC、转速为120rpm的摇床上，培养80小时结束。(4)结果对不同霉菌的种子培养结果见表3。表3数据统计结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例4本实施例与实施例2方法相同，条件改变。菌种根霉(孢子悬浮液，浓度为1(^个/mL)(1)配制培养基a.种子培养基将实施例1中降解半纤维素得到的木糖降解液适当浓缩或稀释得到浓度为40g/L的木糖溶液，加入霉菌种子培养必需的营养物质(NH4)2S043g/L,酵母膏4g/L，玉米浆5mL/L,KH2P041g/L,MgS04'7H201g/L，ZnS04.7H200.1g/L，FeS04'7H200.1g/L，琼脂3g/L,加H2S04调节pH为6.5。b.发酵产酸培养基将实施例1中纤维素降解液蒸发浓缩脱毒并适当浓缩或稀释得到浓度为120g/L的葡萄糖溶液，加入霉菌发酵产酸必需的营养物质(NH4)2S043g/L，酵母膏1g/L,KH2P041g/L,MgS04'7H201g/L,ZnS04'7H200.1g/L,FeS04.7H200.1g/L,加入过量NaHC0380g/L,解除产物抑制作用并保持发酵液pH6.0。a和b中碳源、氮源分开灭菌，m。C灭菌15分钟，CaC03干热灭菌，冷却后混合后备用；(2)种子培养将孢子悬浮液按照5%的接种量接入装有50mL种子培养基的250mL凹槽摇瓶中，置于温度为35。C、转速为220rpm的摇床上培养种子液，24小时结束。(3)发酵产酸步骤(2)中孢子悬浮液按照30。/。的接种量接入装有50mL发酵产酸培养基的250mL凹槽摇瓶中，置于温度为35。C、转速为220rpm的摇床上，培养96小时结束。(3)结果对不同霉菌的种子培养结果见表4。表4数据统计结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1、一种将木质纤维素的降解液完全利用于微生物发酵生产富马酸的方法，其特征在于以两步法降解木质纤维素步骤得到的两步降解液为原料，将降解半纤维素得到的木糖溶液配制成种子培养基用于种子培养步骤的同时，再将降解纤维素的产物葡萄糖溶液配制成发酵产酸培养基用于发酵产富马酸步骤，实现完全利用木质纤维素发酵生产富马酸的目的。2、根据权利要求1所述的两步法降解木质纤维素的方法，其特征在于首先降解木质纤维素中的半纤维素得到木糖以供种子培养步骤，再降解木质纤维素中的纤维素得到葡萄糖以供发酵产富马酸步骤。3、根据权利要求1所述的配制种子培养基的步骤，其特征在于称量一定量的半纤维素降解液稀释或浓缩成浓度为1040g/L的木糖溶液，加入种子培养必需的营养物质，配制成种子培养基，将种子培养基在115121。C的高温下灭菌1530分钟，冷却。4、根据权利要求3所述的配制种子培养基的步骤，其特征在于加入的种子培养必需的营养物质为(NH4)2S041.53g/L,酵母膏04g/L，玉米浆05mL/L,KH2P040.1lg/L，MgSO4'7H2O0.1lg/L，ZnS04.7H200.010.1g/L,FeS04.7H200.010.1g/L，琼脂03g/L,添加中和剂控制pH为46.5。5、根据权利要求4所述的配制种子培养基的步骤，其特征在于所添加的中和剂为恥04或HC1。6、根据权利要求1所述的种子培养步骤，其特征在于按照1%5%的接种量接入配置好的霉菌孢子悬浮液，置于温度为3035°C,培养1842小时后的种子液备用以发酵产富马酸。7、根据权利要求1所述的配制发酵产酸培养基的步骤，其特征在于将降解纤维素后得到的葡萄糖降解液浓缩至80120g/L，加入霉菌种子液发酵产酸必需的营养物质，配制成发酵产酸培养基，将发酵产酸培养基在11512rC的高温下灭菌1530分钟，冷却。8、根据权利要求7所述的配制发酵产酸培养基的步骤，其特征在于加入的发酵产酸培养基所需要的营养物质为(NH4)2SO403g/L,酵母膏0lg/L,KH2P040.11.0g/L,MgSO4'7H2O0.11.0g/L,ZnS04'7H200.010.1g/L,FeS04'7H20O.O卜O.lg/L,通过向培养基中添加中和剂控制pH为3.06.0。9、根据权利要求8所述的配制发酵产酸培养基的步骤，其特征在于所添加的中和剂为CaC03、Ca(OH)2、NaOH或NaHC03。10、根据权利要求1所述的发酵产富马酸的步骤，其特征在于量取种子培养得到的种子液，按照10%30%的接种量接入发酵产酸培养中，置于温度为3035°C,发酵培养6096小时，得到富马酸。全文摘要本发明公开了一种完全利用木质纤维素资源发酵制备富马酸的方法。该工艺涉及通过两步法降解木质纤维素，将主要含有木糖的半纤维素降解液添加适当的营养物质，用于产富马酸霉菌种子培养18～42小时，第二步将主要含有葡萄糖的纤维素降解液添加适量营养物质，作为发酵产酸培养基接种，接种上述种子液后培养60～96小时，高产富马酸，其产量为28～56g/L，转化率为41％～52％。本发明充分利用了原料木质纤维素类物质，来源更加广泛，且不经过分离提纯，有效降低了生产成本，具备优异的工业化应用前景。文档编号C12P7/46GK101225412SQ20081001877公开日2008年7月23日申请日期2008年1月23日优先权日2008年1月23日发明者皓何,宁刘,霜李,振高,和黄申请人:南京工业大学