一株粪产碱杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物应用领域，具体涉及一株粪产碱杆菌及其应用。
背景技术：
随着柴油需求日益增加，我国不断增加渣油转化能力，柴油硫含量也随之增加。目前主要使用加氢脱硫的方法，该工艺虽然可以增加脱硫效率，但也有部分萘系芳烃加氢生成四氢萘，使油品不安定，增加了脱硫费用；同时，该脱硫方法反应条件要求相对较高，成本也相对较高。目前，已有很多国家开始致力于研究生物脱硫技术。生物脱硫技术可在常温、常压下进行，脱硫成本低，且能够脱除在加氢过程中不易脱出的二苯并噻吩类物质。生物脱硫技术虽具有诸多好处，但目前发现的能够破坏苯并噻吩类物质的菌株非常少，还处于研发初始阶段。同时，随着人们生活水平不断提高，禽畜粪便及生活垃圾也日增增大，产生的恶臭污染物随着增加，在填埋和堆肥过程中会产生大量氨气和硫化氢，不仅对人的身体造成严重危害，还会污染环境、污染地下水源等。如果能提供一种细菌，可以同时对噻吩类硫化物和恶臭物质进行处理，将具有极大的现实意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一株粪产碱杆菌及其应用。为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株粪产碱杆菌，于2018年6月11日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,菌种名称:粪产碱杆菌dfn2，保藏编号为cgmccno.15926。相应的，一株粪产碱杆菌，16srdna序列如seqidno1所示。相应的，粪产碱杆菌在处理氨气、硫化氢和噻吩类硫化物中的应用。优选的，所述粪产碱杆菌处理氨气、硫化氢的条件为：温度为30～35℃。相应的，所述粪产碱杆菌在处理氨氮废水中的应用。优选的，所述粪产碱杆菌处理氨氮废水的条件为：ph＝5～10，温度为20～40℃。优选的，所述粪产碱杆菌处理氨氮废水的条件为：ph＝7，温度为30℃。本发明具有以下有益效果：1、本发明提供了一种粪产碱杆菌，该菌对常见恶臭物质(氨气、硫化氢)具有极佳的降解效果，对氨气和硫化氢的最大降解率(去除率)均可达到100％；对高氨氮废水中的氨氮物质降解率也高达99.5％。2、本发明提供的粪产碱杆菌还可以对噻吩类硫化物进行生物脱硫处理，脱硫效果远优于通用的加氢脱硫效果，对部分噻吩类硫化物的处理效率等同于100％。附图说明图1为粪产碱杆菌的系统进化树图；图2为粪产碱杆菌在平板培养基中的菌落形态示意图；图3为粪产碱杆菌电镜扫描图；图4为粪产碱杆菌革兰氏染色示意图；图5为c/n对粪产碱杆菌降解氨氮的影响示意图；图6为ph对粪产碱杆菌降解氨氮的影响示意图；图7为转速对粪产碱杆菌降解氨氮的影响示意图；图8为温度对粪产碱杆菌降解氨氮的影响示意图；图9为粪产碱杆菌降解氨氮的降解效果曲线图；图10为粪产碱杆菌降解高氨氮废水效果示意图；具体实施方式全文涉及的培养基如下：1、维氏盐溶液配制(g/l)：k2hpo45.0，mgso4·7h2o2.5，nacl2.5，feso4·7h2o0.05，mnso40.05，ph＝7.0。2、富集培养基为(g/l):硫酸铵2.0；琥珀酸钠13.85；乙酸钠5.0；葡萄糖5.0；维氏盐溶液50ml，ph＝7，加水至1l。3、分离培养基(g/l)：(nh4)2so40.47,琥珀酸钠5.62,维氏盐溶液50ml,ph＝7.0。4、分离固体培养基：在分离培养基的基础上添加体积为分离培养基体积2.0％的琼脂，121℃，30min高温灭菌处理。用于异养硝化菌的分离纯化及脱氨特性研究。5、牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，加水至1l，ph＝7，121℃，30min高温灭菌处理。6、牛肉膏蛋白胨固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基的基础上添加体积为牛肉膏蛋白胨固体培养基体积2.0％的琼脂。用于菌株的形态观察、保存以及活化。7、液体扩大发酵培养基：牛肉膏5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、化钠5g，加水至1000ml，ph7.0～7.4。实施例一：菌株的采集和鉴定1、采集：取四川某污水处理厂二沉池污泥与堆肥样品混合。将采集的活性污泥与堆肥样品混合，按体积为富集培养基的10％，接种于富集培养基中，30℃、好氧条件，用富集培养基进行驯化，每代驯化5天，共驯化4代共计20天，随后进行梯度稀释，从10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释度下吸取0.25ml，于分离培养基平板涂布，30℃恒温培养，经多次分离后最终获得若干株菌株。所述堆肥样品具体指将常见农作物副产物(如秸秆、稻壳等)直接堆放150天及以上。2、分子鉴定使用solarbio细菌基因组dna提取试剂盒，提取菌株的基因组dna，以此为模板，利用16srdna基因通用引物，进行pcr扩增。扩增16srdna的引物：f-primerf27：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；r-primerr1492：5’-ggctaccttgttacgactt-3’。pcr反应体系为：2×mix：12.5μl、f-primerf27：1.0μl、r-primerr1942：1.0μl、dna基因组：1.0μlμl、ddh2o：9.5μl。pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，29个循环，72℃最终延伸5min，4℃保存。取3μl的pcr反应产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳实验。得到的16srdna序列产物由成都擎科生物工程技术服务有限公司测序。测得的序列登陆ncbi网站，通过blast程序与genbank中核酸数据进行比对分析。测序序列如seqidno1所示。使用mega6软件绘制菌株进化发育树，如图1所示。从测序结果和图1可以看出，该菌株与alcaligenesfaecalissubsp.phenolicusdsm16503(粪产碱菌dsm16503)的遗传距离最近，据此确定该菌株为粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)。该菌株已于2018年6月11日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter)保藏,保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；菌种名称:粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)dfn2，保藏编号为cgmccno.15926。3、生理生化特征鉴定观察菌株的平板培养菌落形态，如图2所示：菌落白色凸起，边缘整齐光滑，表面湿润。在扫描电镜下观察菌体形态，如图3所示，菌体为杆状，大小约为0.4×(0.9～1.5)μm。使用solarbio革兰氏染色液对菌液进行革兰氏染色，经过染色鉴定出菌株dnf2为革兰氏阴性菌，如图4所示。该菌可在15～45℃范围生长，最适生长温度为30～35℃；可在ph5～10范围内生长，最适生长ph7.0～8.0。实施例二：菌株降解氨氮物质的条件优选发明人在实验中发现，该菌株具有极佳的降解氨氮的性能，可实际应用于氨氮物质的处理中。本实施例中，所用培养基全部在分离培养基的基础上进行下述相应调整。将分离纯化得到的菌株按接种量为一接种环接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，35℃培养24h，即得种子液。1、c/n对氨氮降解的影响c/n指培养基中的c、n质量比。将种子液按体积为培养基体积1％分别接种到c/n比分别为2、5、10、15、20的培养基中，测定菌株对氨氮的降解率和od600。如图5所示，菌株在c/n比分别为2、5、10、15、20的条件下均可生长。在c/n为2、5时，氨氮降解率为28.9％、61.2％，od600值为0.36、0.68。当c/n比为10，氨氮降解率达到最大，为100％，od600值为1.05。随着c/n比的增加，氨氮降解率均为100％，菌体密度稍有上升。由此可知，菌株dnf2降解氨氮的最佳c/n是10。2、ph值对氨氮降解的影响将种子液按体积为培养基体积1％分别接种到ph值分别为4、5、6、7、8、9、10的培养基中，测定菌株对氨氮的降解率和od600。如图6所示，菌株有较宽的ph值域，在5～10范围内均可生长。菌株在强酸条件下，菌株的氨氮降解率均为0，od600值为0.02，菌体基本不生长。在ph为5、6、7、8、9条件下，菌株氨氮降解率均为100％，菌株的od600值均在1.1以上，说明菌株生长较好。在强碱的条件下(ph＝10)，菌株的氨氮降解率为42％，od600为0.68。所以选择ph＝7为最佳降解条件。3、转速对氨氮降解的影响将种子液按体积为培养基1％接种到转速分别为80、120、160、200r/min的培养基中，测定菌株对氨氮的降解率和od600。如图7所示，在80r/min、120r/min条件下，菌株对氨氮的降解率分别为48.6％、79.7％，od600值为0.56、0.88。当转速为160r/min时，菌株对氨氮的降解率为100％，od600值为1.07。当转速达到200r/min时，菌株对氨氮的降解率为87.8％，od600值为1.01。综上，当转速为160r/min，氨氮降解率和菌体密度od600值均达到最大，可知菌株的最佳降解转速条件为160r/min。4、温度对氨氮降解的影响将种子液按体积为培养基体积1％分别接种到温度条件分别为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃的培养基中，测定菌株对氨氮的降解率和od600。如图8所示，在低温和高温条件下(10℃、50℃)菌株不生长。当温度为20℃时，菌株对氨氮的降解率为11.2％，od600为0.1。当温度为30℃时，菌株对氨氮的降解率为96.3％，od600值为1.16。温度为40℃时，菌株对氨氮的降解率稍后下降为93.6％，od600值为1.1。由此可知，菌株dnf2降解氨氮的最佳温度为30℃。在上述筛选的最佳c/n、ph、转速、温度条件下，将菌株dnf2接种到脱氨氮培养基中。如图9所示，菌株dnf2有较好的脱氨氮效率，可在15h内将96mg/l的氨氮降解至0mg/l。平均降解率为6.4mg/l·h，最大降解率为13.3mg/l·h。实施例三：菌株对高氨氮废水进行降解1、将实施例二制备的种子液按接种量为液体扩大发酵培养基体积的1％接种至液体扩大发酵培养基中，35℃、160rmp条件下振荡培养24h，得接种液。2、将所述接种液5ml接种于装有500ml沼液高氨氮废水(初始氨氮浓度为416.2mg/l)的1l烧杯中(接种量为1.0％)，同时添加等量蒸馏水作为对照组。每组设置三个重复，保持温度为30℃，每6h测定氨氮浓度，结果如图5所示。3、结果表明：在初始氨氮浓度为416.2mg/l条件下，菌株在84h时可将氨氮降解到8.53mg/l，降解率为98.6％，在96h时，氨氮浓度为2.4mg/l，降解效率为99.5％。实施例四：菌株在脱臭反应器中对nh3和h2s的处理1、30～35℃，将实施例三制备的接种液按1％的接种量接种至脱臭反应器中，在不同浓度、不同负荷下，检测nh3和h2s的去除情况。结果如表1所示。表1菌株对nh3和h2s的去除情况展示2、由表1可知，在将粪产碱杆菌dnf2接种到生物滴滤塔后，菌株对臭气硫化氢和氨气均能较好的去除，效率均在94％以上。实施例五：菌株在处理噻吩类硫化物中的应用发明人在研究中发现，该菌株还可用于噻吩类硫化物的脱硫处理，这可能是因为该菌株产生的酶能够将噻吩类硫化物转化为水溶性硫化物，从而实现噻吩类硫化物的脱硫。具体效果展示如下：1、以市购普通柴油为原料，测定其中的主要硫化物的分布情况，结果如表2所示。表2处理前柴油中硫化物分布情况表2、将实施例三制备的接种液按体积为培养基体积3％的接种量接种至柴油培养基中，所述柴油培养基为在牛肉膏蛋白胨培养基的基础上，加入体积为牛肉膏蛋白胨培养基体积10％的所述柴油，培养48h，观察菌株的生长情况，并检测培养基中各类硫化物的含量，结果如表3所示。其中，“/”表示未检出。表3处理后培养基中各硫化物的分布情况含硫化合物分布(mg/l)4-甲基二苯并噻吩4.64-乙基二苯并噻吩3.94.6-二甲基二苯并噻吩0.12.4-二甲基二苯并噻吩/2.8-二甲基二苯并噻吩/1,2-二甲基二苯并噻吩6.52,4,6-三甲基二苯并噻吩2.4菌株生长状态良好。从表3可以看出，柴油中的各类噻吩类硫化物，尤其是2.4-二甲基二苯并噻吩和2.8-二甲基二苯并噻吩，降解效果明显，降解率相当于高达100％。序列表<110>陕西理工大学中国科学院成都生物研究所<120>一株粪产碱杆菌及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1368<212>dna<213>粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)<400>1ttgctctcttggcggcgagtggcggacgggtgagtaatatatcggaacgtgcccagtagc60gggggataactactcgaaagagtggctaataccgcatacgccctacgggggaaagggggg120gatcgcaagacctctcactattggagcggccgatatcggattagctagttggtggggtaa180aggctcaccaaggcaacgatccgtagctggtttgagaggacgaccagccacactgggact240gagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggggaaa300ccctgatccagccatcccgcgtgtatgatgaaggccttcgggttgtaaagtacttttggc360agagaagaaaaggtatcccctaatacgggatactgctgacggtatctgcagaataagcac420cggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttaatcggaatta480ctgggcgtaaagcgtgtgtaggcggttcggaaagaaagatgtgaaatcccagggctcaac540cttggaactgcatttttaactgccgagctagagtatgtcagaggggggtagaattccacg600tgtagcagtgaaatgcgtagatatgtggaggaataccgatggcgaaggcagccccctggg660ataatactgacgctcagacacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtag720tccacgccctaaacgatgtcaactagctgttggggccgttaggccttagtagcgcagcta780acgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgac840ggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattcgatgcaacgcgaaaaaccttac900ctacccttgacatgtctggaaagccgaagagatttggccgtgctcgcaagagaaccggaa960cacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaa1020cgagcgcaacccttgtcattagttgctacgcaagagcactctaatgagactgccggtgac1080aaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgggtagggcttcac1140acgtcatacaatggtcgggacagagggtcgccaacccgcgagggggagccaatctcagaa1200acccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagt1260aatcgcggatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtca1320caccatgggagtgggtttcaccagaagtaggtagcctaaccgtaagga1368当前第1页12