本发明属于饲料生物添加剂技术领域，具体涉及采用细菌培养与微量元素生物转化的饲用复合富硒益生的芽孢杆菌制剂。
背景技术
硒是人和动物所必需的微量元素，具有提高机体免疫力、抗癌、抗自由基、延缓衰老、拮抗有毒元素、防治某些地方性流行病等多种功能。缺硒是世界性问题。我国存在一条从东北到西南的广阔低硒地带，这些地区的人和动物硒的摄入量普遍偏低。因此补硒成为人和动物营养研究的热点。当前广泛使用的补硒方法是添加无机硒，随着对硒研究的深入，发现亚硒酸钠利用率低、毒性大、且本身具有亲氧化作用，而且对环境会造成潜在的污染，因此一些国家已经限制使用亚硒酸钠作为硒的营养补充剂。有机硒具有吸收率高、生物活性强、毒性低、环境污染小等特点，因此成为目前硒研究的重点。目前世界各国已经开发了多种形式的有机硒产品，如硒蛋氨酸、富硒酵母、硒化多糖、富硒蛋白粉等。
益生菌是一类通过改善动物胃肠道微生物区系平衡而促进动物健康和生长的有益菌，已经发现益生菌皆具有一系列重要的生物学功能。这些功能包括：补充肠道有益菌群，调整动物肠道菌群微生态平衡，防治胃肠道疾病；抑制肠道内氨及胺等毒性物质的产生，改善环境卫生；产生多种酶类，合成多种营养物质，提高饲料转化率，促进生长；增强机体免疫功能；控制血清胆固醇；抗过敏；抗肿瘤等。
现有技术存在的问题如下：1.目前有机硒产品如富硒农产品，存有生产周期长，有机硒产品成本较高致使难以规模化生产和推广应用的缺点。2.益生菌作为原核生物，难以在高浓度的硒溶液中生长，需采取特殊的技术，完成有机硒转化。既要保证益生菌数量达到规定的标准，添加剂中益生菌数量不得低于108cfu/g，也要满足有机硒转化效率。3.生产出的益生菌产品稳定性，产品能否在货架时间达到3个月时，且活菌数量仍达到国家规定标准的问题。
技术实现要素：
为了实现将将无机硒转化成有机硒，并研发出固态硒制剂，并发挥有机硒和益生菌的双重功效，本发明提供一种饲用复合富硒益生的芽孢杆菌固态制剂及制备方法。
一种饲用复合富硒益生的芽孢杆菌固体制剂经过两次发酵制成，先由复合芽孢杆菌在含硒的ypd培养基中，液态发酵，成熟后接种到由玉米粉、麸皮、菊糖、无机硒和自来水组成的固态培养基后混合均匀，固态发酵制得；
所述复合芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌的活化菌液和枯草芽孢杆菌的活化菌液按体积比1：1混合均匀制得；
所述芽孢杆菌固体制剂中地衣芽孢杆菌的含量为9.41´109cfu/g、枯草芽孢杆菌的含量为9.65´109cfu/g、有机硒含量为48.25±0.15ug/g、无硒含量为1.83±0.05g/g，ph值为7.46-7.61，有机硒转化率大于95.0%；货架时间90天内，地衣芽孢杆菌的活菌数量为9.31.±0.03´108cfu/g，枯草芽孢杆菌的活菌数量为6.33±0.03´108cfu/g；
所述地衣芽孢杆菌bacilluslicheniformis，保藏编号为cgmccno.14245，保藏日期为2017年06月15日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
所述枯草芽孢杆菌bacillussubtilis，保藏编号为cgmccno.14246，保藏日期为2017年06月15日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
一种饲用复合富硒益生的芽孢杆菌固体制剂的制备操作步骤如下：
（1）菌种的活化
将保存在-20℃的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于ypd液态培养基上，接种量3-5%，37℃培养30-36h，如此连续活化3～5次，分别得到活化的地衣芽孢杆菌和活化的枯草芽孢杆菌；
（2）制备种子液
将活化的地衣芽孢杆菌和活化的枯草芽孢杆菌分别转接于液态ypd培养基中，转接种量1-3%，在液态ypd培养基中，添加无机硒至含量达到23.5-25.9ug/ml，37℃培养24h，分别得到地衣芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液；
（3）一次发酵
在1000mlypd液态培养基中加入51-57mg无水亚硒酸钠混匀；按体积比1%:1%的量混合接种地衣芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液，即地衣芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液各10毫升，37℃培养32h，得到一次发酵液；
（4）二次发酵制备饲用复合富硒益生的芽孢杆菌固体制剂
将22-28kg玉米粉、71-77kg麸皮、1-1.5kg菊糖、7.65-8.1kg无水无机硒、60l一次发酵液和7-7.5l自来水混合均匀，温度37℃、固态发酵32-33h，得到饲用复合富硒益生的芽孢杆菌固体制剂，粉碎，得到粉状的芽孢杆菌固体制剂。
步骤（1）和步骤（3）中，所述液态ypd培养基由蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g和蒸馏水1000ml混合均匀，灭菌制得。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1.本发明从健康的安徽地方鸡—淮南麻黄鸡肠道内分离出具有益生作用芽孢杆菌，经鉴定为地衣芽孢杆菌bacilluslicheniformis和枯草芽孢杆菌bacillussubtilis，地衣芽孢杆菌bacilluslicheniformis和枯草芽孢杆菌bacillussubtilis是我国农业部规定可直接添加的饲用益生菌。
2.本发明使用地衣芽孢杆菌bacilluslicheniformis和枯草芽孢杆菌bacillussubtilis，采用特定二次发酵技术，将无机硒转化成有机硒，研发出饲用复合富硒益生的芽孢杆菌固体制剂，既提高了有机硒含量和转化率，活菌数量又得到保证，通过稳定性试验检测，3个月，芽孢杆菌活菌数量仍达到108cfu/g。可发挥有机硒和益生菌的双重功效。
3.通过研究富硒益生菌大规模生产所用的培养基，优化培养条件，以实现工业化生产的目的，大大降低了生产成本，生产周期短，产量高等特定，为其在动物上的应用奠定基础。
关于本发明二次发酵有益技术效果的说明如下：
1.首次发酵各条件的确立
（1.1）不同硒浓度对地衣、枯草芽孢杆菌生长的影响
配制不同含无机硒（无水亚硒酸钠）浓度的ypd液态培养基，浓度分别为0、5、10、15、20、25、30微克/毫升（ug/ml），备用。后分别按1%接种两种芽孢杆菌，37℃培养24h，用平板计数法检测各发酵液中两种芽孢杆菌的活菌数量。
结果如下表1所示，在ypd培养基无机硒浓度达到20ug/ml，枯草芽孢杆菌的细菌数量与0ug/ml浓度相比，没有受到显著的降低，当硒浓度达到25ug/ml，活菌数极显著低于0ug/ml浓度时的活菌数量（p<0.01）。地衣芽孢杆菌数量在培养基无机硒浓度达到20ug/ml时，活菌数量极显著低于0ug/ml浓度下的活菌数量（p<0.01）。由此初步确定两株芽孢杆菌硒耐受量。
（1.2）不同培养时间对地衣、枯草芽孢杆菌生长的影响
配制同含无机硒浓度为20ug/mlypd液态培养基，分别后按1%接种两种芽孢杆菌，37℃培养24、28、32、36h，用平板计数法检测各发酵液中两种芽孢杆菌的活菌数量。
结果如下表2所示，培养时间为32h时，枯草芽孢杆菌的活菌数量显著高于其他24、28、36h的培养时间（p<0.05），地衣芽孢杆菌的结果与枯草芽孢杆菌一致，培养时间达到32h，为最优。由此确定富硒芽孢杆菌的培养时间。
（1.3）混合培养对芽孢杆菌数量的影响
配制同含无机硒浓度为25ug/mlypd液态培养基，后按1%:1%的比例同时接种到培养基中，检测混合培养和单独培养对活菌数量的影响，37℃培养32h。结果见表3。结果表明，混合培养下枯草芽孢杆菌数量与单独培养没有显著差异，而混合培养时地衣芽孢杆菌数量极显著高于单独培养（p<0.01）；
注：1培养基中细菌数量为log10cfu/ml，2数据经统计学分析，用spss17.0软件进行统计分析，差异显著者进行duncan氏进行多重比较，同一行的数值后不同小写字母表示差异显著，p<0.05，不同大写字母表示差异极显著，p<0.01；
1、2注释同上表
1、2注释同上表
小结：由以上结果，确立了富硒芽孢杆菌的发酵条件，在ypd液态培养基中，无机硒浓度达到25ug/ml，按1%:1%混合接种枯草和地衣芽孢杆菌，在37℃培养32h，结果最优。
2.二次发酵各条件的确立
（2.1）培养基配方的摸索
芽孢杆菌对外界环境抗逆性强，对营养要求比乳酸杆菌和双歧杆菌低。设计不同配比的玉米粉和麸皮组成的培养基，研究其对芽孢杆菌活菌数量的影响。分别配制固态培养基，玉米粉和麸皮组成分别为：100%:0，75%:25%，50%:50%，25%:75%，0:100%。。按上述比例称取玉米粉和麸皮，混合。每个比例皆为1000g，后接种富硒枯草和地衣芽孢杆菌液态菌液500毫升。配制1000ug/ml的无机硒母液，取母液25毫升，添加至菌液中，加自来水至600毫升。配制5份，分别与不同配比的固态培养基混合，37℃固态发酵32h，后烘干至水分含量达到13-15%，粉碎，检测活菌数量。
结果见表4，当玉米粉和麸皮比例为25%:75%对枯草和地衣芽孢杆菌的活菌数量没有显著影响，当比例为0:100%时，两种菌的活菌数量极显著低于其他比例。因而采用玉米粉:麸皮比例为25%:75%；
1、2注释同上表
（2.2）培养基配方的优化
为了增强固态芽孢杆菌粉剂中的活菌保质期，在培养基中添加1-1.5%的益生元菊糖以保证后期的货架时间。
本方法采取两次发酵技术即提高单次高浓度硒条件下，发酵时芽孢杆菌有机硒转化率，又提高活菌数量。第二次发酵采用固态发酵技术，降低水分含量，易于烘干，制成粉剂，便于添加和配制饲料。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
以下实施例所用原料说明如下：
地衣芽孢杆菌bacilluslicheniformis，保藏编号为cgmccno.14245，保藏日期为2017年06月15日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
枯草芽孢杆菌bacillussubtilis，保藏编号为cgmccno.14246，保藏日期为2017年06月15日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实施例1
一种饲用复合富硒益生的芽孢杆菌固体制剂的制备操作步骤如下：
（1）菌种的活化
将保存在-20℃的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于ypd液态培养基上，接种量3%，37℃培养30-36h，如此连续活化3～5次，分别得到活化的地衣芽孢杆菌和活化的枯草芽孢杆菌。液态ypd培养基即牛肉膏蛋白胨培养基（ypd），成分：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml；加热溶解，校正ph使其达到7.0，分装后，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用；
（2）制备种子液
将活化的地衣芽孢杆菌和活化的枯草芽孢杆菌分别转接于ypd液态培养基中，转接种量1%，37℃培养24h，分别得到地衣芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液；
（3）一次发酵
在1000毫升液态ypd培养基中加入51.40mg无水亚硒酸钠混匀。按1%:1%混合接种地衣芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液，即地衣芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液各10毫升，37℃培养32h，得到一次发酵液；
（4）二次发酵制备饲用复合富硒益生的芽孢杆菌固体制剂
将22kg玉米粉、77kg麸皮、1kg菊糖、8.10g无水无机硒、60l发酵液和5l自来水混合均匀，温度37℃、固态发酵32-33h；
（5）制剂烘干与分装
固态发酵结束后，在45-50℃温度条件下烘干，粉碎，得到粉状的芽孢杆菌固体制剂，分装，分装成500g每袋。常温保存90天后，检测总硒、有机硒、枯草和地衣芽孢杆菌活菌数量。
烘干至水分含量为14%，测定总硒含量为50.18mg/kg，有机硒含量为48.40mg/kg，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活菌数量分别达到6.36´108cfu/g，9.34´108cfu/g。
实施例2
一种饲用复合富硒益生的芽孢杆菌固体制剂的制备操作步骤如下：
（1）菌种的活化
将保存在-20℃的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于ypd液态培养基上，接种量5%，37℃培养30-36h，如此连续活化3～5次，分别得到活化的地衣芽孢杆菌和活化的枯草芽孢杆菌；
（2）制备种子液
将活化的地衣芽孢杆菌和活化的枯草芽孢杆菌分别转接于ypd液态培养基中，转接种量3%，37℃培养24h，分别得到地衣芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液；
（3）一次发酵
在1000毫升ypd液态培养基中加入56.94mg无水亚硒酸钠混匀。按体积比1%:1%的量混合接种地衣芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液，即地衣芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液各10毫升，37℃培养32h，得到一次发酵液；
（4）二次发酵制备饲用复合富硒益生的芽孢杆菌固体制剂
将28kg玉米粉、71kg麸皮、1kg菊糖、7.65g无水无机硒、60l一次发酵液和5l自来水混合均匀，温度37℃、固态发酵33h；
（5）制剂烘干与分装
固态发酵结束后，在45-50℃温度条件下烘干，粉碎，得到粉状的芽孢杆菌固体制剂，分装，分装成500g每袋。常温保存90天后，检测总硒、有机硒、枯草和地衣芽孢杆菌活菌数量。
烘干后总硒含量为50.01mg/kg，有机硒含量为48.10mg/kg，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活菌数量分别达到6.30´108cfu/g，9.28´108cfu/g。