本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种富硒纳豆芽孢杆菌的生产方法及其所用培养基。
背景技术
纳豆是由纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)发酵大豆而制成的功能性食品。纳豆食品的功能决定于纳豆芽孢杆菌。纳豆芽孢杆菌属于需氧菌中的非致病菌，是以内生孢子的形式存在于动物肠道中，由于纳豆芽孢杆菌具有芽孢，有耐酸、耐碱、耐高温及耐挤压等特点，可以耐唾液和胆汁的攻击，可直达大小肠的活菌，在肠道上段迅速发育转变成具有新陈代谢作用的营养型细胞，以自身的耗氧来抑制肠道中有害需氧菌的生长，从而促使以厌氧菌为优势菌群的肠道正常菌群的生长，提高机体免疫力；能产生多种酶类，增强机体的免疫功能；纳豆芽孢杆菌还能产生多种营养物质，如维生素、氨基酸、促生长因子等，参与机体的生长代谢。
纳豆芽孢杆菌的作用具体如下：(1)具有广谱抗菌作用：纳豆芽孢杆菌具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌都有一定的拮抗作用。(2)增强机体免疫力：能有效地提高巨嗜细胞的数量和活性，通过产生抗体和提高嗜菌作用等刺激免疫，激发体液免疫和细胞免疫，促进分泌型iga的分泌，从而抵抗感染。(3)提高食物转化率：能使机体淀粉酶和总蛋白酶活性升高，使肠道酸化而有利于铁、钙及维生素d等的吸收。(4)分泌纳豆激酶，具有溶血栓、抗肿瘤、调节肠功能等多种保健功效。
作为保健功能的一个重要的生命元素就是硒。硒是人体必需的微量元素，科学界研究发现血硒水平的高低与癌的发生息息相关，美国亚利圣那大学癌症中心clark教授对1312例癌症患者进行13年对照试验。结果表明每日补硒200μg，癌症死亡率下降50％，癌症总发病率下降37％，硒被科学家称之为人体微量元素中的“防癌之王”。2003年美国食品药品管理局(fda)明示：“硒能降低患癌风险”和“硒可在人体内产生抗癌变作用”。人体对硒的营养需求是不可替代的，缺硒就会生病，如克山病、大骨节病、癌症、心脑血管病、衰老、不孕不育等40多种疾病和缺硒有关。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是如何大规模生产富硒纳豆芽孢杆菌。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于发酵培养纳豆芽孢杆菌的硒盐培养基。
本发明提供的用于发酵培养纳豆芽孢杆菌的硒盐培养基是在纳豆芽孢杆菌发酵培养基中添加硒盐得到的培养基。
上述硒盐培养基中，所述硒盐为亚硒酸钠。
上述硒盐培养基中，所述纳豆芽孢杆菌发酵培养基包括玉米粉、黄豆粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素b1。
进一步的，所述硒盐培养基由所述玉米粉、所述黄豆粉、所述葡萄糖、所述磷酸二氢钾、所述亚硒酸钠、所述硫酸镁、所述维生素b1和水组成。
更进一步的，所述玉米粉在所述硒盐培养基中的质量分数为(2-5)％；
所述黄豆粉在所述硒盐培养基中的质量分数为(1-2)％；
所述葡萄糖在所述硒盐培养基中的质量分数为(1-3)％；
所述磷酸二氢钾在所述硒盐培养基中的质量分数为(0.1-0.5)％；
所述亚硒酸钠在所述硒盐培养基中的质量分数为(0.05-0.2)％；
所述硫酸镁在所述硒盐培养基中的质量分数为(0.05-0.1)％；
所述维生素b1在所述硒盐培养基中的浓度为(50-100)ppm。
上述硒盐培养基的ph值为7.0-7.3。
上述纳豆芽孢杆菌发酵培养基也属于本发明的保护范围。
本发明的纳豆芽孢杆菌发酵培养基包括玉米粉、黄豆粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素b1。
进一步的，所述纳豆芽孢杆菌发酵培养基由玉米粉、黄豆粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素b1和水组成。
更进一步的，所述玉米粉在所述纳豆芽孢杆菌发酵培养基中的质量分数为5％；
所述黄豆粉在所述纳豆芽孢杆菌发酵培养基中的质量分数为2％；
所述葡萄糖在所述纳豆芽孢杆菌发酵培养基中的质量分数为3％；
所述磷酸二氢钾在所述纳豆芽孢杆菌发酵培养基中的质量分数为0.5％；
所述硫酸镁在所述纳豆芽孢杆菌发酵培养基中的质量分数为0.2％；
所述维生素b1在所述纳豆芽孢杆菌发酵培养基中的浓度为100ppm。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述硒盐培养基或上述纳豆芽孢杆菌发酵培养基的新用途。
本发明提供了上述硒盐培养基或上述纳豆芽孢杆菌发酵培养基在生产富硒纳豆芽孢杆菌中的应用。
本发明还提供了上述硒盐培养基或上述纳豆芽孢杆菌发酵培养基在制备生产富硒纳豆芽孢杆菌的产品中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种生产富硒纳豆芽孢杆菌的方法。
本发明提供的生产富硒纳豆芽孢杆菌的方法包括将纳豆芽孢杆菌在上述硒盐培养基中进行发酵培养的步骤。
上述方法中，所述方法包括如下步骤：
(1)将纳豆芽孢杆菌种子液在上述纳豆芽孢杆菌发酵培养基中进行一级放大培养，得到一级种子液；
(2)将所述一级种子液在上述纳豆芽孢杆菌发酵培养基中进行二级放大培养，得到二级种子液；
(3)将所述二级种子液在上述硒盐培养基中进行发酵培养，得到发酵产物，所述发酵产物中含有富硒纳豆芽孢杆菌。
上述方法中，所述(1)中，所述纳豆芽孢杆菌种子液的制备方法如下：将纳豆芽孢杆菌在种子培养基中活化，得到活化后的纳豆芽孢杆菌；将所述活化后的纳豆芽孢杆菌在所述种子培养基中培养，得到种子液。
进一步的，所述活化的条件如下：37℃培养18-20小时。
所述活化后的纳豆芽孢杆菌在所述种子培养基中培养的条件如下：37℃，220rpm振荡培养16-18小时。
更进一步的，所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：胰化蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，高温高压灭菌后使用。
上述方法中，所述(1)中，所述一级放大培养在10l种子罐中进行，培养条件如下：37℃培养16-18小时；
所述(2)中，所述二级放大培养在200l发酵罐中进行，培养条件如下：37℃培养16-18小时；
所述(3)中，所述发酵培养在6吨发酵罐中进行，培养条件如下：37℃培养24小时；
上述方法中，所述步骤(3)后还依次包括压滤和粉碎的步骤。所述压滤采用板框压滤机；所述压滤的条件如下：压力为50-60kg，时间为1小时。所述粉碎为粉碎至颗粒直径为60-80目。
上述方法中，所述纳豆芽孢杆菌可为枯草芽孢杆菌(纳豆)bacillussubtilisnatto(枯草芽孢杆菌含有多种亚型，纳豆芽孢杆菌为其中一种亚型)。在本发明的具体实施例中，所述纳豆芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，保藏编号为cicc10023。
本发明提供了一种大量生产富硒纳豆芽孢杆菌的方法及其专用培养基。通过本发明的大规模生产方法可以获得大量富硒纳豆芽孢杆菌，其具有硒和纳豆芽孢杆菌的双重功效，具有良好的经济效益。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的纳豆芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(纳豆)bacillussubtilisnatto，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，保藏编号为cicc10023。
下述实施例中的固体种子培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：胰化蛋白胨(购自生工生物工程(上海)有限公司)10g/l，酵母提取物(购自生工生物工程(上海)有限公司)5g/l，nacl10g/l，琼脂粉15g/l，高温高压灭菌后使用。
下述实施例中的液体种子培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：胰化蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，高温高压灭菌后使用。
实施例1、一种富硒纳豆芽孢杆菌的生产方法
(一)富硒纳豆芽孢杆菌的生产方法
一、菌种的活化
将纳豆芽孢杆菌作为发酵菌种，在种子培养基固体斜面上划线，37℃培养18-20小时，得到活化后的纳豆芽孢杆菌。
二、种子液的制备
完成步骤一后，将活化后的纳豆芽孢杆菌用接种环挑取一环接种于含有400ml液体种子培养基的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床中，37℃，220rpm振荡培养16-18小时，得到种子液。
三、种子液的一级放大培养
完成步骤二后，将种子液(400ml)导入含有6l发酵培养基的10l种子罐中，37℃发酵培养16-18小时，得到一级种子液。
发酵培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：玉米粉5％(质量分数)(购自广东赢特保健食品有限公司)，黄豆粉2％(质量分数)(购自广东赢特保健食品有限公司)，葡萄糖3％(质量分数)，磷酸二氢钾0.5％(质量分数)，硫酸镁0.2％(质量分数)，维生素b1100ppm。
四、种子液的二级放大培养
完成步骤三后，将种子罐中的一级种子液全部负压吸入含有120l发酵培养基的200l发酵罐中，37℃发酵培养16-18小时，得到二级种子液。
五、种子液在硒盐培养基中发酵培养
完成步骤四后，将种子罐中的二级种子液全部负压吸入6吨发酵罐中，并加入3.6吨硒盐培养基，37℃发酵培养24小时，得到发酵产物。
硒盐培养基的溶剂为水，溶质浓度如下：玉米粉2％(质量分数)，黄豆粉1％(质量分数)，葡萄糖1％(质量分数)，磷酸二氢钾0.1％(质量分数)，亚硒酸钠0.05％(质量分数)，硫酸镁0.05％(质量分数)，维生素b150ppm。ph值为7.0-7.3。
六、板框压滤
完成步骤五后，取出发酵罐中的发酵产物，用板框压滤机(购自上海信步科技有限公司)压滤，压滤的压力为50-60kg，压滤的时间为一小时，得到固体产物。
七、干燥粉碎
完成步骤六后，将固体产物置于真空中干燥，干燥温度为60-65℃，干燥完成后粉碎，得到颗粒直径为60-80目的富硒纳豆芽孢杆菌产物。
(二)富硒纳豆芽孢杆菌的有机硒含量检测
采用比色分光光度计法(国标法(gb5009.93-2017))检测富硒纳豆芽孢杆菌产物中的有机硒含量。
结果表明：富硒纳豆芽孢杆菌产物中的有机硒含量为6500ppm。
实施例2、一种富硒纳豆芽孢杆菌的生产方法
(一)富硒纳豆芽孢杆菌的生产方法
将实施例1(一)的步骤五中的硒盐培养基替换为如下硒盐培养基：玉米粉5％(质量分数)，黄豆粉2％(质量分数)，葡萄糖3％(质量分数)，磷酸二氢钾0.5％(质量分数)，亚硒酸钠0.2％(质量分数)，硫酸镁0.2％(质量分数)，维生素b1100ppm。其他步骤与实施例1(一)相同。
(二)富硒纳豆芽孢杆菌的有机硒含量检测
采用比色分光光度计法(国标法(gb5009.93-2017))检测富硒纳豆芽孢杆菌产物中的有机硒含量。
结果表明：富硒纳豆芽孢杆菌产物中的有机硒含量为9800ppm。
实施例3、一种富硒纳豆芽孢杆菌的生产方法
(一)富硒纳豆芽孢杆菌的生产方法
将实施例1(一)的步骤五中的硒盐培养基替换为如下硒盐培养基：玉米粉3.5％(质量分数)，黄豆粉1.5％(质量分数)，葡萄糖2％(质量分数)，磷酸二氢钾0.3％(质量分数)，亚硒酸钠0.12％(质量分数)，硫酸镁0.1％(质量分数)，维生素b180ppm。其他步骤与实施例1(一)相同。
(二)富硒纳豆芽孢杆菌的有机硒含量检测
采用比色分光光度计法(国标法(gb500993-2017))检测富硒纳豆芽孢杆菌产物中的有机硒含量。
结果表明：富硒纳豆芽孢杆菌产物中的有机硒含量为8100ppm。