一株分解几丁质的绛红产色小单胞菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株分解几丁质的绛红产色小单胞菌及其应用。

背景技术

水稻是我国乃至世界的主要粮食作物之一，伴随着人口的不断增长，生活水平的改善和提升，水稻的产量和质量是人们关注的焦点。水稻稻瘟病是由真菌梨孢菌霉引起的，俗称“稻热病”，可侵染水稻整个发育时期，是水稻生产上威胁最大的病害之一。为更好的满足人类对高质量水稻的需求，生物防治手段在化学防治及抗性育种上具有明显的竞争优势，相比传统的的化学防治手段更加环保，不产生抗药性；抗性育种的周期时间长以及对环境的针对性强，因此生物防治更具时效性和可控性，这不仅满足了人们对绿色健康食品的需求，更是在环境友好以及农业健康可持续发展提供保障。

技术实现要素：

本发明的目的是要解决现有水稻稻瘟病主要防治方法存在着农残隐患的问题，提供了一株分解几丁质的绛红产色小单胞菌及其应用。

本发明一株分解几丁质的绛红产色小单胞菌为绛红产色小单胞菌(micromonosporapurpureochromogenes)a6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2018年2月02日，保藏编号为cgmccno.15335。

本发明一株分解几丁质的绛红产色小单胞菌的应用是指在水稻病害防治上的应用。

本发明采用野生稻根际土壤中进行绛红产色小单胞菌菌株的分离纯化：

初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10^-1、10^-2、10^-3浓度的稀释液各80μl，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，nh4cl1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)

复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出分解几丁质的绛红产色小单胞菌(micromonosporapurpureochromogenes)a6，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定a6菌株的生理生化特征发现，a6菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阴性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

利用基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil)提取菌株的基因组，进行16srdna的扩增。pcr扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到genbank。通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用mega5.1软件中neihbor-joinhing构建系统发育进化树。a6菌株与绛红产色小单胞菌属的同源性最高，达99％，最终命名为绛红产色小单胞菌(micromonosporapurpureochromogenes)a6。

本发明在野生稻根际土壤中筛选得到不仅可以分解几丁质且对稻瘟病有抑制作用的绛红产色小单胞菌a6菌株，保藏编号为cgmccno.15335，它是在江西东乡不同地点的野生稻根际土壤中，经初选得到具有分解几丁质能力较强的菌株后，再反复筛选与稻瘟病拮抗效果好的菌株，大量实验证明，菌株a6不仅可以分解稻瘟病细胞壁的重要成分几丁质，且菌株a6的发酵液对稻瘟病的抑制效果能达到90％，从而说明菌株a6对稻瘟病有很好的拮抗作用。

本发明利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的的化学防治更加环保，无农药残留，不产生抗药性，为生防微生物资源的开发和有效利用提供了理论依据。从而为绿色有机农业奠定长远发展。

附图说明

图1为a6菌株在pda平板上的形态图；

图2为a6菌株分子鉴定聚类图谱；

图3为a6菌株与稻瘟病的拮抗效果图；

图4为a6发酵液和稻瘟灵对稻瘟病抑制效果图；

图5为a6发酵液和稻瘟灵唑对稻瘟病抑制效果的对比图；其中a为a6发酵液，b为稻瘟灵。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一株分解几丁质的绛红产色小单胞菌为绛红产色小单胞菌(micromonosporapurpureochromogenes)a6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2018年2月02日，保藏编号为cgmccno.15335。

本实施方式采用野生稻根际土壤中进行绛红产色小单胞菌菌株的分离纯化：

初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10^-1、10^-2、10^-3浓度的稀释液各80μl，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，nh4cl1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)

复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选分解几丁质的绛红产色小单胞菌(micromonosporapurpureochromogenes)a6，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定a6菌株的生理生化特征发现，a6菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阴性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

利用基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil)提取菌株的基因组，进行16srdna的扩增。pcr扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到genbank。通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用mega5.1软件中neihbor-joinhing构建系统发育进化树。a6菌株与绛红产色小单胞菌属的同源性最高，达99％，最终命名为绛红产色小单胞菌(micromonosporapurpureochromogenes)a6。

本实施方式利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的的化学防治更加环保，无农药残留，不产生抗药性，为生防微生物资源的开发和有效利用提供了理论依据。从而为绿色有机农业奠定长远发展。

具体实施方式二：本实施方式一株分解几丁质的绛红产色小单胞菌的应用是指在水稻病害防治上的应用。

本实施方式在野生稻根际土壤中筛选得到可分解几丁质且对稻瘟病有抑制作用的绛红产色小单胞菌a6菌株，保藏编号为cgmccno.15335，它是在江西东乡不同地点的野生稻根际土壤中，经初选得到具有分解几丁质能力较强的菌株后，再反复筛选与稻瘟病拮抗效果好的菌株，大量实验证明，菌株a6不仅可以分解稻瘟病细胞壁的重要成分几丁质，且菌株a6的发酵液对稻瘟病的抑制效果能达到90％，从而说明菌株a6对稻瘟病有很好的拮抗作用。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：分解几丁质的绛红产色小单胞菌的应用在稻瘟病防治上。其他与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式绛红产色小单胞菌micromonosporapurpureochromogenesa6的筛选方法为：初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10^-1、10^-2、10^-3浓度的稀释液各80μl，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，nh4cl1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)

复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出分解几丁质的绛红产色小单胞菌(micromonosporapurpureochromogenes)a6，a6菌株在pda平板上的形态图如图1所示，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定a6菌株的生理生化特征发现，a6菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阴性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

具体实施方式五：本实施方式绛红产色小单胞菌micromonosporapurpureochromogenesa6的鉴定：

1.生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定a6菌株的生理生化特征发现，a6菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阴性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

表1菌株a6的生理生化特性

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

2.分子鉴定

利用基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil)提取菌株的基因组，进行16srdna的扩增。pcr通用引物为：27f(5ˊ-agagtttgatcctggctcag-3ˊ)，1492r(5ˊ-ggttaccttgttacgactt-3ˊ)，反应体系25μl，premixversion2.012.5μl，27f(10nm)1μl，1492r(10nm)1μl，dna模板1μl，无菌水不足至25μl。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸10min。

pcr扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到genbank。dna序列如seqidno：1所示。通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用mega5.1软件中neihbor-joinhing构建系统发育进化树(图2)。a6菌株与绛红产色小单胞菌属的同源性最高，达99％，最终命名绛红产色小单孢菌(micromonosporapurpureochromogenes)a6。

对本实施方式的绛红产色小单胞菌micromonosporapurpureochromogenesa6在稻瘟病防治上的功能性验证：

试验1：平板对峙法对稻瘟病拮抗作用

采用平板对峙法，测定拮抗菌株对稻瘟病的抑菌活性。先将稻瘟病在pda平板上进行活化，挑选长势旺盛的病原菌平板。用打孔器制成直径为7mm的菌饼，倒置于pda平板，将拮抗菌菌株的菌饼接种在距病原菌约2cm处，其中以不接拮抗菌的平板为对照，每组3个重复，置于26℃下恒温培养箱中培养2-6天，观察抑菌圈的大小(图3)。并在第2，4，6天的时候记录病原菌的菌落最小半径以及对照菌落的半径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落半径-病原菌菌落半径)/对照菌落半径×100

从不同天数的抑菌率数据来看，a6菌株随着天数的增加，抑制效果增强，在第6天的抑制效果最佳，达78.2％。

试验2：a6发酵液和稻瘟灵对稻瘟病的抑制效果

a6发酵液的制备：250ml三角瓶中装入100ml发酵培养基(发酵培养基：葡萄糖10.0g，酵母浸膏7.5g加蒸馏水定容至1000ml)，121℃下高压灭菌。在超净工作台中将a6菌饼接入到冷却的液体培养基中，于160rpm恒温震荡摇床中发酵培养3天后，得到发酵液，将发酵液3500rpm离心5分钟收集菌体，无菌水洗涤2次后重悬浮无菌水中，血球计数板测定浓度并将其稀释浓度为10⁷cfu/ml，备用。

农药稀释液制备：将市售稻瘟灵(北美农大)按照使用说明稀释500-1000倍，为了验证a6对病原菌的抑制效果，我们对稻瘟灵稀释了250倍和500倍。

拮抗试验：分别取100μla6发酵滤、250倍50％稻瘟灵稀释液、500倍稻瘟灵稀释液涂布于pda平板，平皿中央分别接种7mm稻瘟病病原菌菌饼，以无菌水为对照(图4)，每组3个重复，26℃下恒温培养，在第2，3，4，5天测量病原菌的直径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落直径-病原菌菌落直径)/对照菌落直径×100％

结果显示：由于500倍稀释的稻瘟灵几乎对稻瘟病无抑制效果，因此仅在图中比较了a6发酵液和250倍稻瘟灵的抑制作用(图5)。其中在第4天时，a6发酵液对稻瘟病的抑制效果最好，抑菌率达到90％。而稻瘟灵的效果随着天数的增加在逐渐降低，稻瘟灵在第2天的抑制效果最好为15.38％。

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>一株分解几丁质的绛红产色小单胞菌及其应用

<160>3

<210>1

<211>1422

<212>dna

<213>绛红产色小单胞菌（micromonosporapurpureochromogenes）

<400>1

cgggcgtggccgcgtgcttaccatgcaagtcgagcggaaggcccttcggggtactcgagc60

ggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgccctaggctttgggataaccctcggaaa120

cgggggctaataccggatatgaccttgccctgcatggggtttggtggaaagtttttcggc180

ctgggatgggctcgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacga240

cgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcc300

tacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcggaagcctgatgcagcgacgccg360

cgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggacgaagcgcaagtga420

cggtacctgcagaagaagcaccggccaactacgtgccagcagccgcggtaagacgtaggg480

tgcgagcgttgtccggatttattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcgac540

cgtgaaaacttggggctcaaccccaagcctgcggtcgatacgggcaggctagagttcggt600

aggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccgg660

tggcgaaggcgggtctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaa720

caggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgttgggcgctaggtgtggggggcct780

ctccggttccctgtgccgcagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgca840

aggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaat900

tcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggtttgacatggccgcaaaacttccagagatgg960

gaggtccttcgggggcggtcacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagat1020

gttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgttcgatgttgccagcgcgttatggcg1080

gggactcatcgaagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcat1140

catgccccttatgtccagggcttcacgcatgctacaatggccggtacaatgggttgcgat1200

gccgtgaggtggagcgaatcccaaaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactc1260

gaccccgtgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgtt1320

cccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggcaacacccgaagccggtg1380

gcccaacccttgtggaggagccgtcgaagggggcgggcgtta1422

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物27f的核苷酸序列。

<400>2

agagtttgatcctggctcag20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物1492r核苷酸序列。

<400>3

ggttaccttgttacgactt19