一种植物乳杆菌菌种及其应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，尤其涉及一种植物乳杆菌菌种及其应用。
背景技术：
发酵肉制品是指自然或人工控制条件下，利用微生物发酵作用生产的具有特殊风味、色泽和质地，且具有较长保存期的肉制品。通过微生物发酵，使原料的质地得到改善，风味有所增加，营养价值得到提高。在发酵肉制品整个加工过程中，肉类本身内源酶和微生物酶会分解蛋白质产生大量的氨基酸，从而提高了人体对发酵肉制品的消化性。而这些游离氨基酸，很多都是人体需要的必需氨基酸，有明显的生物活性，这使得肉制品的保健性和营养性得到很大的提高。氨基酸本身或与其他物质反应产生风味物质，促进肉制品的香气和滋味。同时，肉制品中一些的氨基酸与其他物质复合可以起到抗氧化作用，以及作为发色助剂改善发酵肉制品的感官，对肉制品的品质产生影响。我国肉制品分为西式肉制品和中式肉制品两大类。西式肉制品以灌肠、火腿、培根三类产品为主，中式肉制品包括腌腊类制品、肉类干制品和酱制品三类产品。西式发酵肉制品工业化生产较为成熟，但产品多不符合国人饮食习惯。中式肉制品虽然在少数民族聚居区有着食用发酵肉制品的悠久历史，但多为地方产品，受当地环境和气候的限制。传统的腌肉制品，一般以猪肉为原料，在自然状态下利用微生物进行厌氧发酵而制成。存在以下问题：一方面猪肉脂肪含量高，易导致肥胖和心血管疾病，另一方面自然发酵周期长，控制不好极易污染杂菌。牛肉富含矿物质、b族维生素、钾、铁、锌等营养要素，提供高质量的蛋白质。较猪肉比，蛋白质含量高5-10％，脂肪含量低20-30％。市场上目前牛肉发酵制品，以风干牛肉为主，属于轻度发酵产品。缺乏深度发酵的牛肉制品。目前市场上存在的各类商用发酵肉菌种，生产公司和产品种类较为丰富，且多以直投试发酵为主，操作简便。但是这些菌种大多属于西式发酵肉用菌种，中式发酵肉用菌种很少见。腌肉属中式发酵肉制品，通常采用自然发酵，生产周期长，易污染杂菌。现有商用发酵剂多用于西式发酵肉制品，生产的产品易出现风味同一，无特色的问题。另外，市场上专用中式发酵肉制品的发酵剂少有，要想将中式发酵肉商业化需要开发相应的发酵剂。牛肉经发酵可引起牛肉中蛋白质变性和降解，转化为胨、肽、氨基酸等物质，既改善产品质地，使营养更加丰富，也提高了蛋白质的吸收率，更易被人体吸收利用。但市场上关于牛肉的深度发酵产品不多。技术实现要素：有必要提出一种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)菌种，所述菌种于2018年6月11日保藏于地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.15923。还有必要提出一种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)菌种在发酵中式腌制牛肉中的应用。采用本发明提出的菌种对中式腌制牛肉进行发酵，得到的发酵牛肉产品形状规则，表面肌肉呈玫瑰红色，脂肪白色；弹性较好，切面坚实整齐；具有柔和的芳香味酸甜适中。这与现有技术中对西式肉类进行发酵的发酵菌种是不同的，是一种中式腌制牛肉专用型发酵菌。附图说明图1为筛选的得到的发酵乳酸菌p6在100倍油镜下的个体形态。图2为筛选的得到的发酵乳酸菌k12在100倍油镜下的个体形态。图3-图6为不同菌种、不同发酵时间对发酵腌牛肉品质的影响的感官评价柱状图。依次为l3、k12、p6、zc4。图7-图10为不同菌种在不同温度下感官评价和ph变化情况柱状图。图11-图14为不同菌种在不同湿度下感官评价和ph变化情况柱状图。图15-图18为不同菌种在不同接种量下感官评价和ph变化情况柱状图。图19-图24为乳酸菌产粘实验结果显示图。图25-30为乳酸菌产气实验结果显示图。图31、32为乳酸菌的产h2s实验结果显示图。图33为4株菌的生长曲线图。具体实施方式为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合实施例和实验方案进行说明。一、菌种来源p6：宁夏银川地区市民家自然发酵泡菜中分离筛选得到。k12：市售产自西藏林芝地区的藏灵菇菌种自然发酵乳中分离筛选得到。二、菌种分离筛选方法1、浇注平板：将三角瓶中的已灭菌的mrs+0.5％碳酸钙琼脂培养基及msa琼脂培养基，加热熔化，冷却至45℃左右，浇注平板，每个平板约20ml。2、样品稀释：取1ml上述的市售藏灵菇菌种自然发酵乳和1ml的自然发酵泡菜汁，分别加入9ml无菌水，制成稀释度为10-1的发酵菌悬液和泡菜汁菌悬液，分别继续取稀释液1ml放于无菌试管中，加9ml无菌水，混匀，依次做10倍的系列稀释，分别取少量稀释度的发酵菌液和泡菜汁菌液做发酵乳酸菌的分离。3、平板分离：a.平板划线接种：分别用接种环挑取发酵菌液和泡菜汁菌液各一环，无菌操作在平板上进行划线接种；划线完毕后，盖上盖，倒置在40℃恒温培养箱中培养48h。b.平板涂布接种：取两个无菌平板，在两个无菌平板上分别加0.1ml发酵菌液和泡菜汁菌液，用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20min，然后倒置于25℃恒温培养箱培养48h。4、观察菌落：选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出发酵乳酸菌菌落。(mrs+0.5％碳酸钙固体培养基筛选标准：在培养基表面或内部生长良好，白色有光泽，边缘整齐，易挑不粘连，有透明圈。msa固体培养基筛选标准：在培养基表面生长良好，白色有光泽，边缘整齐，易挑不粘连。)5、镜检：从平板上用接种环挑取菌落，制菌涂片，用革兰氏染色，油镜观察得到两种形态的菌种p6和k12，两种菌种的个体形态图片。如图1、图2。三、菌种鉴定及结论对获得的两种个体形态的菌种进行取样标号，分别为k2、k3、k5、k10、k12、k13、k17、k18、k19、k20、k21、k22、l1、l2、l5、fx3、zc4、zc5、zc7、fxh11、fh2、fh6、p6、p7、y4、y6、y9、y10、l3、l7。对以上这些菌种依次进行下述的(四、菌种特性对比实验)中的七种对比实验，以及对筛选后的4株菌种分别进行(五、单一菌株的发酵实验)，得到菌种p6和k12的各项特性均显著优于其他菌种，p6和k12对腌制牛肉发酵的效果是最佳的。对菌种p6和k12进行分子生物学鉴定，采用16srdna扩增过后测序，经测序结果与blast数据库中的序列作对比，最终获得两株菌的鉴定结果：菌株p6鉴定为肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)菌株；k12鉴定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。见菌株p6的16srdna序列和菌株k12的16srdna序列。四、菌种特性对比实验及结论4.1、菌株特性(1)leuconostocmesenteroidesp6和lactobacillusplantarumk12均可耐受6％氯化钠溶液，即在含6％nacl的mrs液体培养基中37℃培养24h，600nm下od分别可达2.360和2.351。(2)leuconostocmesenteroidesp6和lactobacillusplantarumk12可耐受亚硝酸钠溶液，即在含150mg/kg的mrs液体培养基中37℃培养24h，600nm下测定od值分别2.517和2.611。(3)leuconostocmesenteroidesp6和lactobacillusplantarumk12在mrs液体培养基中37℃培养28h后，ph值分别降至3.78和3.71。(4)两株菌在mrs固体平板培养基上，37℃培养48h，菌落无产粘情况出现。(5)两株菌接种在装有杜氏小管的葡萄糖产气培养基中，37℃培养24h，均无产气现象发生。(6)两株菌穿刺接种在产h2s培养基中，37℃培养24小时，无黑色沉淀线出现，不产生硫化氢。(7)用牛津杯在含有10％脱脂乳的mrs固体平板培养基上中打孔，分别在孔内加入100μl上述两株菌种乳酸菌液，24h后观察酪蛋白的水解能力强。即：以上试验结论是通过以下七组对比试验来验证leuconostocmesenteroidesp6和lactobacillusplantarumk12具有耐盐性高、耐亚硝酸钠高、产酸高、不产粘液、不产气、不产硫化氢气体、蛋白质活性降解好的优良特性。(1)乳酸菌的耐盐实验方案与试验数据，见表1。把乳酸菌接种在添加2.0％、4.0％、6.0％nacl的mrs液体培养基中，37℃培养24h，600nm下测定od值，同时以不接菌mrs液体培养基作空白对照，比较其生长情况。表130株菌在2.0％、4.0％、6.0％盐下的od值通过对菌株测定的od值比较，发现k2、k3、k5、k10、k12、k13、k18、k20、k21、p6、p7、y4、y10、zc4、zc5、zc7、fx3、fxh11、fh2、l320株菌的耐nacl性较高，选择这20株菌进行后续试验。(2)乳酸菌的耐亚硝酸钠实验与试验数据，见表2。把乳酸菌接种在添加50mg/kg、100mg/kg、150mg/kgnan02的mrs液体培养基中，600nm下测定od值，同时以不接菌mrs液体培养基作空白对照，比较其生长情况。表220株菌在50mg/kg、100mg/kg、150mg/kgnano2下的od值通过对菌株测定的od值比较，发现k2、k3、k5、k10、k12、k13、k18、k20、l3、p6、y4、fxh11、zc4、zc5、zc7这15株菌的耐nan02性高。(3)乳酸菌的产酸实验与试验数据，见表3。把乳酸菌接种在mrs液体培养基中，37℃培养，24h后第一次测定其ph值，同时每次测不接菌mrs液体培养基的ph值作空白对照，看各乳酸菌的产酸情况。表320株菌ph值通过对菌株培养24h测定的ph值比较，发现k2、k3、k5、k10、k12、k13、k18、k20、l3、p6、y4、fxh11、zc4、zc5、zc7这15株菌的ph值下降较快，说明产酸效果较好。(4)乳酸菌的产粘液实验与试验结果，见图19-24。把乳酸菌接种在mrs固体平板培养基上，然后放置37℃恒温培养48h，挑取菌落直接观察。使用接种环将菌落挑起，观察菌落是否存在拉丝或粘连，根据观察试验平板上的菌落被接种环挑起后的状态，可以确定zc4、k3、k12、l3、p6、y4、k18这7株菌的菌落不拉丝，不粘连，不产粘液。(5)乳酸菌的产气实验与试验结果，见图25-30。把乳酸菌接种在装有杜氏小管的葡萄糖产气培养基中，37℃培养24h。观察杜氏小管内是否有气泡生成。通过观察杜氏小管，确定k2、k3、k5、k10、k12、k13、k18、k20、l3、p6、y4、fxh11、zc4、zc5、zc7这15株菌的小管内部没有气泡产生，不产气。(6)乳酸菌的产h2s实验与试验结果，见图31、32。把乳酸菌穿刺接种在产h2s培养基中，37℃培养24小时，如果出现黑色沉淀线就是有h2s产生，否则就是不产h2s。蛋白质降解活性实验(7)试验方法：用牛津杯在含有10％脱脂乳的mrs固体平板培养基上中打孔，在孔内加入100μl乳酸菌液，24h后观察酪蛋白水解圈。根据水解圈有无及大小判断菌株对蛋白酶的水解能力。蛋白质降解活性实验及结果如下表4：表4不同菌株的降解蛋白试验结果菌株名称水解能力菌株名称水解能力菌株名称水解能力k2--k13--y4+k3--k18+fxh11++k5--k20--zc4++k10--l3+zc5+k12++p6++zc7--比较透明圈的大小，确定zc4、zc5、k12、k18、y4、fxh11、p6、l3这8株菌的水解能力强。。4.2、绘制生长曲线根据上述七组耐受性实验结果，总体分析，筛选出耐盐性高、耐亚硝酸钠高、产酸高、不产粘液、不产气、不产硫化氢气体、蛋白质活性降解好的zc4、k12、p6、l3、y4、k18这6株菌绘制生长曲线。如图33。如图可见，k12、p6，l3，zc4这4株菌20小时左右可达到稳定期，生长旺盛，且k12、p6这2株菌生长速度快，分别在9小时、20小时左右可达到稳定期，且生长旺盛，因此作为后续生产的应用菌株。五、单一菌株的发酵实验选取上述性能优良的4株菌株接种至腌制牛肉中做发酵试验，以证明k12、p6在发酵腌制牛肉中的应用及效果。5.1、实验菌株为经过上述“四、菌种特性对比实验及结论”筛选得到的性能良好的4株菌株。lactobacillusplantarumk12、leuconostocmesenteroidesp6，lactobacillusalimentariusl3，leuconostocmesenteroideszc4。5.2、试验方法(1)四株不同菌种接种量的考察：接种量按0.2％、1.0％、2.0％三组不同接种量生产发酵腌肉，每5小时测一次ph，直到ph达到5.2以下时停止发酵。(2)四株不同菌种发酵温度：将乳酸菌在28℃、37℃、41℃进行腌肉的发酵，每4小时测一次ph，直到ph达到5.2以下时停止发酵。(3)四株不同菌种发酵湿度：将乳酸菌在85％、90％、95％进行腌肉的发酵，每5小时测一次ph，直到ph达到5.2以下停止发酵。(4)四株不同菌种发酵时间：将乳酸菌在在6h、12h、18h、24h、30h进行腌肉的发酵，每个时间点进行腌肉制品的感官评价。5.3感官评定采用均衡非完全分块设计bib，对达到发酵终点的腌肉进行感官评定，具体如下：学习食品加工的专业人员组成5人评定小组，要求评定人员前12h不吸烟、不饮酒、不食辛辣等刺激性食物。评定人员保持一定距离，评定过程不准相互交谈对发酵腌牛肉感官质量的评定，主要针对其外观，组织状态及风味这三方面属性进行评定，评定标准参照(表4)评定一个产品完，以清水漱口，间隔10min再评定下一个样品，最后填好评分表并签名，将各评定人员的评定结果收集起来，进行分析。5名品评员分别对每种产品进行综合感官评分，打分范围为0～100分。表4发酵腌牛肉感官评定标准5.4实验结果(1)不同菌种、不同发酵时间对发酵腌牛肉品质的影响，如图3-6。将k12、p6，l3，zc4，四株菌，在6h、12h、18h、24h、30h，接种量为0.2％，温度为28℃，湿度为85％进行腌肉的发酵。不同发酵时间不同菌种发酵，腌肉制品的感官评价如图3-6所示。实验结果表明：四株菌随着发酵时间的延长，ph值总体呈现下降趋势；组织结构方面、风味评分越来越高；外观颜色变暗，脂肪稍有发黄，这可能与肉中的脂肪及蛋白质被乳酸菌利用氧化有关。消化乳杆菌k12达到发酵终点最快，24小时ph即可达到5.1，是一株具有较高产酸潜力的菌株。虽然发酵能力较其它三株菌弱，但肠膜明串珠菌p6的感官评价最高，综合感官评价分值为81分，相对于l3高2.1分，k12高0.2分，zc4高0.5分，产品，外观形状稍有不规则，肌肉表面部分呈现咖啡色，脂肪发黄；组织状态方面，弹性较好，切面结实整齐；风味柔和的芳香味，酸味适中。(2)不同菌种在不同温度下感官评价和ph变化情况，如图7-10。将四株菌，分别在28℃、37℃、41℃下发酵，保持接种量0.2％，湿度为85％不变，发酵15h后观察结果。不同菌种发酵不同发酵温度下，腌肉制品的感官评价和ph如图7-10所示。实验结果表明这四株菌同时发酵15h，随着温度升高ph整体呈现下降的趋势，生产的发酵肉总体外观形状规则，表面肌肉变暗，脂肪发黄，组织状态弹性较好，切面齐，具有发酵的香味但乳酸风味不足。总体分析，在41℃时四株菌的感官品评价较其它两个发酵温度得分高，平均分为81.9分，较28℃发酵高出7.6分，较37℃发酵高出3.5分。p6在41℃感官评价得分最高为83.0分。结合ph曲线，可知41℃发酵植物乳杆菌k12产酸效果仍为最佳。(3)不同菌种在不同湿度下感官评价和ph变化情况，如图11-14。将四株菌，分别在85％、90％、95％湿度下发酵，保持接种量为0.2％，温度为28℃，发酵15h时后观察结果。不同发酵湿度不同菌种发酵，腌肉制品的感官评价见图11-14所示。实验结果表明四株菌随着湿度的不同ph整体呈现先下降后上升的趋势。发酵肉总体感官表现为外观表面肌肉变暗，脂肪发黄，组织状态有弹性，切面齐，有裂隙但不明显，发酵香味足。总体分析，在湿度90％发酵时，四株菌的感官品评价较其它两个发酵湿度得分高，平均分为83.8分，较85％发酵高出8.0分，较95％发酵高出3.1分。p6在90％感官评价得分最高为85.6分。结合ph曲线，可知41℃发酵植物乳杆菌l3产酸性能最好。(4)不同菌种在不同接种量下感官评价和ph变化情况，如图15-18。将四株菌，分解以0.2％、1.0％、2.0％的接种量接种，保持温度41℃，湿度为85％，发酵15h小时观察发酵结果。不同发酵温度不同菌种发酵，腌肉制品的感官评价和ph见图15-18所示。实验结果表明四株菌随着添加量的升高ph整体呈现下降的趋势，外观表面肌肉变暗，脂肪发黄，组织状态形状比较规则，发酵香味不足，有乳酸发酵的香味。总体分析体分析，在2.0％时四株菌的感官品评价较其它两个发酵湿度得分高，平均分为76.2分，较0.2％发酵高出8分，较1.0％发酵高出2.5分。p6在2.0％感官评价得分最高为77.8分。结合ph曲线，可知2.0％发酵植物乳杆菌k12产酸效果仍为最佳。综上所述，结合感官评价和ph曲线图可知28℃最佳发酵时间为24小时，温度为41℃，湿度为90％，添加量为2.0％。虽然由湿度图得到最优的两株菌是p6和l3但是时间图，温度图，添加量图得到最优菌株为p6，k12，结合感官评价，最终选择最优的菌株为p6和k12。六、发酵腌制牛肉的制备6.1、菌种活化将本发明的植物乳杆菌k12活化，必须在无菌操作台进行。将要接种的单个菌株在靠近火焰的地方进行接种，将接种环进行烧，直到接种环变红的时候就可以接种，但放入试管的时候要先在试管壁上进行冷却在进行挑取，将挑取出的菌种接入之前配好培养基试管中，整个过程都必须在火焰周围进行。后期的培养；在温度为37℃的保温箱中培养24小时。按上述方法传代培养3次，使菌种保持活力旺盛。将培养得到的菌种放在离心机中离心，转速3000转，离心5分钟，得到湿的菌泥沉淀。6.2、牛肉前期工艺处理①切块：将新鲜的牛肉切成长为2cm、宽为1cm、厚为1cm的长方体，②混合调料：将3％的盐和1.25％的花椒均匀的混合在一起，使之成为混合调料。③小火翻炒调料；炒制过程中不停翻炒，防止局部炒焦。直至颜色泛黄。④盐浴：要将小火翻炒的混合调料均匀的搅拌防止有的肉块没有盐浴到。⑤腌制密封：一定要在密封之前对腌肉的器皿进行密封性检查，以防有漏气的可能。6.3、菌种接入及发酵植物乳杆菌k12菌种接种量为上述腌制后的腌制牛肉的2.0％接种发酵。发酵湿度控制在为90％～95％，温度为41℃、发酵15～24小时，检测发酵后牛肉的ph值不大于5.2即可，制得发酵腌制牛肉。6.4、发酵腌制牛肉产品特性采用该工艺方法和本发明菌种制得的发酵腌制牛肉产品的水分含量72％，ph5.1，pov值2.0mg/100g，tvb-n值为6.1×10-6mg/100g。该工艺条件下发酵的产品形状规则，表面肌肉呈玫瑰红色，脂肪白色；弹性较好，切面坚实整齐；具有柔和的芳香味酸甜适中。这与现有技术中对西式肉类进行发酵的发酵菌种是不同的，是一种中式腌制牛肉专用型发酵菌。七、菌株p6的16srdna序列为：cagtcgaacgcacagcgaaaggtgcttgcacctttcaagtgagtggcgaacgggtgagtaacacgtggacaacctgcctcaaggctggggataacatttggaaacagatgctaataccgaataaaacttagtgtcgcatgacacaaagttaaaaggcgcttcggcgtcacctagagatggatccgcggtgcattagttagttggtggggtaaaggcctaccaagacaatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggctgcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggctttcgggtcgtaaagcactgttgtatgggaagaacagctagaataggaaatgattttagtttgacggtaccataccagaaagggacggctaaatacgtgccagcagccgcggtaatacgtatgtcccgagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcagacggtttattaagtctgatgtgaaagcccggagctcaactccggaatggcattggaaactggttaacttgagtgcagtagaggtaagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggcttactggactgcaactgacgttgaggctcgaaagtgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacaccgtaaacgatgaacactaggtgttaggaggtttccgcctcttagtgccgaagctaacgcattaagtgttccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaagcttttagagatagaagtgttctcttcggagacaaagtgacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattgttagttgccagcattcagatgggcactctagcgagactgccggtgacaaaccggaggaaggcggggacgacgtcagatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggcgtatacaacgagttgccaacccgcgagggtgagctaatctcttaaagtacgtctcagttcggattgtagtctgcaactcgactacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgtaatgcccaaagccggtggcctaacctt。八、菌株k12的16srdna序列为：cgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagcttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgca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