一株分解几丁质的类芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株分解几丁质的类芽孢杆菌及其应用。

背景技术

类芽孢杆菌是一种好氧或兼性厌氧的杆状菌，能产生抗逆性芽孢，具有独特的生理特性。据以往的报道，类芽孢杆菌在代谢过程中会产生多种抗菌活性物质，不仅在医疗、环境和植物生物防治等领域中均具有重要的应用价值。本研究的方向是以微生物的细胞壁为作用点，几丁质是真菌细胞壁的重要成分，通过分解病原真菌的细胞壁，破坏细胞膜的完整性，致使细胞内溶物外泄，或与细胞内的靶分子作用从而使病原微生物死亡。灰霉病是一种典型的气传病害，可随空气、水流及农作业传播，可引起多种果蔬，农作物患病。在实际病害防治过程中，难以采取有效措施彻底切断传染源，在病原菌侵入的情况下，也难以彻底消灭病原菌。因此，研发新型、高效、低毒的农用抗生素迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的目的是要解决现有灰霉病主要防治方法存在着农残隐患的问题，提供了一株分解几丁质的类芽孢杆菌及其应用。

本发明一株分解几丁质的类芽孢杆菌为类芽孢杆菌(panenibacillussp.)a10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2018年2月02日，保藏编号为cgmccno.15336。

本发明一株分解几丁质的类芽孢杆菌的应用是指在水稻病害防治上的应用。

本发明采用野生稻根际土壤中进行分解几丁质的类芽孢杆菌菌株的分离纯化：

初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10^-1、10^-2、10^-3浓度的稀释液各80μl，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，nh4cl1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)

复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出分解几丁质的类芽孢杆菌(panenibacillussp.)a10，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定a10菌株的生理生化特征发现，a10菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

利用基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil)提取菌株的基因组，进行16srdna的扩增。pcr扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到genbank。通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用mega5.1软件中neihbor-joinhing构建系统发育进化树。a10菌株与类芽孢杆菌属的同源性最高，达99％，最终命名为类芽孢杆菌(panenibacillussp.)a10。

本发明在野生稻根际土壤中筛选得到不仅可以分解几丁质且对灰霉病有抑制作用的类芽孢杆菌a10菌株，保藏编号为cgmccno.15336，它是在江西东乡的野生稻根际土壤中，经初选得到具有分解几丁质能力较强的菌株后，再反复筛选与灰霉病拮抗效果好的菌株。大量实验证明，菌株a10不仅可以分解灰霉病细胞壁的重要成分几丁质，且菌株a10的发酵液对灰霉病的抑制效果能达到91.8％，从而说明菌株a10对灰霉病有很好的拮抗作用。

本发明利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的的化学防治更加环保，无农药残留，不产生抗药性，为生防微生物资源的开发和有效利用提供了理论依据。从而为绿色有机农业奠定长远发展。

附图说明

图1为a10菌株在pda平板上的形态图；

图2为a10菌株分子鉴定聚类图谱；

图3为a10菌株与灰霉病的拮抗效果图；

图4为a10发酵液和灰霉病特效素对灰霉病抑制效果图；

图5为a10发酵液和灰霉病特效素对灰霉病抑制效果的对比图；其中a为a10发酵液，b为灰霉病特效素。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一株分解几丁质的类芽孢杆菌为类芽孢杆菌(panenibacillussp.)a10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2018年2月02日，保藏编号为cgmccno.15336。

本实施方式采用野生稻根际土壤中进行分解几丁质的类芽孢杆菌菌株的分离纯化：

初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10^-1、10^-2、10^-3浓度的稀释液各80μl，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，nh4cl1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)

复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出分解几丁质的类芽孢杆菌(panenibacillussp.)a10，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定a10菌株的生理生化特征发现，a10菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

利用基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil)提取菌株的基因组，进行16srdna的扩增。pcr扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到genbank。通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用mega5.1软件中neihbor-joinhing构建系统发育进化树。a10菌株与类芽孢杆菌属的同源性最高，达99％，最终命名为类芽孢杆菌(panenibacillussp.)a10。

本实施方式利用生物防治的手段，即利用生物或其代谢产物对植物病害进行有效防治，相比其他传统的的化学防治更加环保，无农药残留，不产生抗药性，为生防微生物资源的开发和有效利用提供了理论依据。从而为绿色有机农业奠定长远发展。

具体实施方式二：本实施方式一株分解几丁质的类芽孢杆菌的应用是指在植物病害防治上的应用。

本实施方式在野生稻根际土壤中筛选得到不仅可以分解几丁质且对灰霉病有抑制作用的类芽孢杆菌a10菌株，保藏编号为cgmccno.15336，它是在江西东乡的野生稻根际土壤中，经初选得到具有分解几丁质能力较强的菌株后，再反复筛选与灰霉病拮抗效果好的菌株，大量实验证明，菌株a10不仅可以分解灰霉病细胞壁的重要成分几丁质，且菌株a10的发酵液对灰霉病的抑制效果能达到91.8％，从而说明菌株a10对灰霉病有很好的拮抗作用。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：分解几丁质的类芽孢杆菌应用在灰霉病防治上。其他与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式分解几丁质的类芽孢杆菌panenibacillussp.a10的筛选方法为：初筛：采用平板稀释涂布法，称取来源于江西东乡野生稻的根际土样5g于45ml无菌水中，120rpm，20min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10^-1、10^-2、10^-3浓度的稀释液各80μl，每个梯度涂布3个几丁质培养基平板上，用无菌水代替稀释液做空白对照。倒置于25℃培养箱中培养2-3天，观察菌落的生长及透明圈产生情况。(几丁质培养基：k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，nh4cl1g，琼脂15g加蒸馏水定容至1000ml，其中每80ml几丁质培养基中加入20ml1％胶体几丁质。)

复筛：在几丁质培养基上，将60多株透明圈较大但形态、颜色等不同形状的菌落分别挑选出来，进行平板划线，直至菌落单一，筛选出分解几丁质的类芽孢杆菌(panenibacillussp.)a10，a10菌株在pda平板上的形态图如图1所示，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定a10菌株的生理生化特征发现，a10菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

具体实施方式五：本实施方式类芽孢杆菌panenibacillussp.a10的鉴定：

1.生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基和方法，鉴定a10菌株的生理生化特征发现，a10菌株的接触酶阳性，甲基红反应为阴性，v-p反应阴性，淀粉水解阳性，明胶液化，不产生硫化氢，吲哚阴性，对nacl的耐受性为10％。

表1菌株a10的生理生化特性

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

2.分子鉴定

利用基因组提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil)提取菌株的基因组，进行16srdna的扩增。pcr通用引物为：27f(5ˊ-agagtttgatcctggctcag-3ˊ)，1492r(5ˊ-ggttaccttgttacgactt-3ˊ)，反应体系25μl，premixversion2.012.5μl，27f(10nm)1μl，1492r(10nm)1μl，dna模板1μl，无菌水不足至25μl。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸10min。

pcr扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，结果在1500bp处有明显的特征条带。既而将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到genbank。dna序列如seqidno：1所示。通过blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用mega5.1软件中neihbor-joinhing构建系统发育进化树(图2)。a10菌株与类芽孢杆菌属的同源性最高，达99％，最终命名圈为卷产色链霉菌(panenibacillussp.)a10。

对本实施方式的类芽孢杆菌panenibacillussp.a10在灰霉病防治上的功能性验证：

试验1：平板对峙法对灰霉病拮抗作用

采用平板对峙法，测定拮抗菌株对灰霉病的抑菌活性。先将灰霉病在pda平板上进行活化，挑选长势旺盛的病原菌平板。用打孔器制成直径为7mm的菌饼，倒置于pda平板，将拮抗菌菌株的菌饼接种在距病原菌约2cm处，其中以不接拮抗菌的平板为对照，每组3个重复，置于26℃下恒温培养箱中培养2-6天，观察抑菌圈的大小(图3)。并在第2，4，6天的时候记录病原菌的菌落最小半径以及对照菌落的半径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落半径-病原菌菌落半径)/对照菌落半径×100

从不同天数的抑菌率数据来看，a10菌株在第4天时对灰霉病的抑制效果最佳，达85.9％，在第六天时会有下降趋势，但仍能达到85％。

试验2：a10发酵液和灰霉病特效素对灰霉病的抑制效果

a10发酵液的制备：250ml三角瓶中装入100ml发酵培养基(发酵培养基：葡萄糖10.0g，酵母浸膏7.5g加蒸馏水定容至1000ml)，121℃下高压灭菌。在超净工作台中将a10菌饼接入到冷却的液体培养基中，于160rpm恒温震荡摇床中发酵培养3天后，得到发酵液，将发酵液3500rpm离心5分钟收集菌体，无菌水洗涤2次后重悬浮无菌水中，血球计数板测定浓度并将其稀释浓度为10⁶cfu/ml，备用。

农药稀释液制备：将市售灰霉病特效素(北美农大)按照使用说明稀释500-1000倍，为了验证a10对病原菌的抑制效果，对灰霉病特效素稀释了250倍和500倍。

拮抗试验：分别取100μla10发酵滤、250倍灰霉病特效素稀释液、500倍灰霉病特效素稀释液涂布于pda平板，平皿中央分别接种7mm灰霉病病原菌菌饼，以无菌水为对照(图4)，每组3个重复，26℃下恒温培养，在第2，3，4，5天测量病原菌的直径，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌落直径-病原菌菌落直径)/对照菌落直径×100％

结果显示：由于500倍稀释的灰霉病特效素几乎对灰霉病无抑制效果，因此仅在图中比较了a10发酵液和250倍灰霉病特效素的抑制作用(图5)，其中随着天数的增加a10发酵液对灰霉病抑制效果逐渐增强，在第5天时，a10发酵液对灰霉病的抑制效果达到91.8％，而灰霉病特效素的效果在逐渐降低，灰霉病特效素在第2天的抑制效果最好为68％。

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>一株分解几丁质的类芽孢杆菌及其应用

<160>3

<210>1

<211>1438

<212>dna

<213>类芽孢杆菌（panenibacillussp.）

<400>1

ggcctgtggggtgctatacatgcaagtcgagcggacccttcggggttagcggcggacggg60

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<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物27f的核苷酸序列。

<400>2

agagtttgatcctggctcag20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物1492r核苷酸序列。

<400>3

ggttaccttgttacgactt19