本发明属于肥料开发技术领域，具体涉及一种ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂。
背景技术
农业用微生物菌剂的使用大大减少了化肥的用量及其带来的污染。农业用微生物菌剂作为一种生物肥料能够通过其中微生物的生命活动来改善作物的营养条件和养分供应状况，加速养分的吸收和转化、抑制有害微生物的活动等，在现代农业生产中，被大量使用。
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，是一种内生抗逆孢子的杆状细菌，广泛存在于自然界中如土壤、湖泊、海洋和动植物的体表，自身没有致病性。该菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用，能减少肥料和农药的使用量，是一种较理想的生防微生物，因此，如何能进一步提高其利用效率是目前急需解决的问题之一。
通常，我国各地气候差异较大，随着可持续现代农业的规模化发展，肥料的过度使用以及人类的活动到导致土壤酸碱化程度的问题越来越严重。土壤的理化性质对于植物的生长环境和肥料本身的利用效率有着显著地影响。盐碱化的土壤不利于作物的生长，而酸性土壤中存在的大量氢离子，又导致部分肥料的流失，极大的降低了肥料的利用效率。对于上述问题的解决，目前还没有一个有效的手段提出。
技术实现要素：
本发明提供了一种ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂，为上述问题的有效解决提供了一个新的思路。本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂可根据环境的ph值调节其包裹的活菌的释放量，在盐碱化土壤中，施用本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂，可以快速释放其中的活菌，从而加速改善土壤盐碱化问题；而在酸化的土壤中施用本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂，可以有效减缓其中的活菌的释放速率，防止活菌分解产生的有机肥料在酸性土壤中的流失，提高肥料的利用效率。
本发明的一个目的是提供一种ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂，所述菌剂包括枯草芽孢杆菌和/或其芽孢、多巴胺或其盐、ph敏感型高聚物分子；所述ph敏感型高聚物分子包括：以氧化石墨烯为交联剂，由丙烯酸聚合而成的高聚物分子。
具体的，所述菌剂还包括：所述多巴胺或其盐覆盖在枯草芽孢杆菌和/或其芽孢的表面，所述ph敏感型高聚物分子覆盖在所述多巴胺或其盐的表面。
具体的，所述菌剂由下述方法制备而成：
将枯草芽孢杆菌和/或其芽孢，于ph值8～8.5的tris-hcl缓冲液中，与盐酸多巴胺一起室温搅拌12h以上，抽滤后，将产物置于反应容器中，加超纯水，通n2，向溶液中加入丙烯酸单体的钠盐、交联剂氧化石墨烯、催化剂，避光继续通n2，室温下搅拌，然后将反应容器转移至冰浴中搅拌，加入引发剂，搅拌后转移至密闭模具中，在室温下聚合24h，将产物粉碎即得。
具体的，按质量计，所述方法中，所述枯草芽孢杆菌和/或其芽孢1-10份、盐酸多巴胺1-10份、丙烯酸单体的钠盐9-30份、氧化石墨烯交联剂0.2-40份；
再具体的，按质量计，所述方法中，所述枯草芽孢杆菌和/或其芽孢10份、盐酸多巴胺1份、丙烯酸单体的钠盐9-20份、氧化石墨烯交联剂0.2-0.4份。
本发明的另一个目的是提供一种菌剂的制备方法，所述方法包括：将枯草芽孢杆菌和/或其芽孢，于ph值8～8.5的tris-hcl缓冲液中，与盐酸多巴胺一起室温搅拌12h以上，抽滤后，将产物置于反应容器中，加超纯水，通n2，向溶液中加入丙烯酸单体的钠盐、氧化石墨烯交联剂、催化剂，避光继续通n2，室温下搅拌，然后将反应容器转移至冰浴中搅拌，加入引发剂，搅拌后转移至密闭模具中，在室温下聚合24h，将产物粉碎即得。
具体的，所述方法还包括下述1)-2)中所述的至少一种：
1)按质量计，所述方法中，所述枯草芽孢杆菌和/或其芽孢1-10份、盐酸多巴胺1-10份、丙烯酸单体的钠盐9-30份、氧化石墨烯交联剂0.2-40份；
再具体的，按质量计，所述方法中，所述枯草芽孢杆菌和/或其芽孢10份、盐酸多巴胺1份、丙烯酸单体的钠盐9-20份、氧化石墨烯交联剂0.2-0.4份；
2)将枯草芽孢杆菌和/或其芽孢，于ph值8～8.5的tris-hcl缓冲液中，与盐酸多巴胺一起室温搅拌12h以上，抽滤后，将产物置于反应容器中，加超纯水，通n2，向溶液中加入交联剂go、单体丙烯酸钠sa和羟甲基丙烯酰胺hmam，用量分别为sa9.4g/100gh2o、hmam10.1g/100gh2o，go200mg/100gh2o，将混合物在锡纸包覆下避光继续通n2，室温下快速搅拌15min，然后将反应容器转移至冰浴中缓慢搅拌5min，用移液枪加入催化剂temed和引发剂kps，用量分别为temed8μl/100gh2o、kps2g/100gh2o，搅拌30s后迅速转移至密闭模具中，在20℃下聚合24h。
本发明的还一个目的是提供本发明任一所述方法制备得到的菌剂。
本发明的还一个目的是提供本发明任一所述菌剂的应用。
具体的，所述应用包括下述1)-3)中所述的至少一种：
1)作为枯草芽孢杆菌和/或其芽孢的缓释或控释产品；
2)作为有益植物生长的产品；
3)作为土壤微生物生态或营养状况的调节产品。
本发明的还一个目的是提供本发明任一所述方法的应用。
具体的，所述应用包括下述1)-3)中所述的至少一种：
1)在制备具有缓释或控释枯草芽孢杆菌和/或其芽孢的产品或其相关产品中的应用；
2)在制备具有有益植物生长的产品或其相关产品中的应用；
3)在制备具有调节土壤微生物生态或营养状况的产品或其相关产品中的应用。
本发明提供的一种枯草芽孢杆菌菌剂，至少具有以下优点：
(1)通过包覆活菌来改善作物的营养条件和养分供应状况，抑制有害微生物的活动，从而提高作物的抗病抗逆能力。
(2)通过在加入ph敏感性单体丙烯酸(aa)，以氧化石墨烯(go)为交联剂，原位自由基聚合后经过水解等处理在活菌表面包覆ph敏感型聚合物，得到具有ph敏感性的枯草芽孢杆菌菌剂。
(3)所述ph敏感型聚合物可根据外界土壤环境的ph值来调节其释放速率：在酸性介质中，pdop-g-paa-co-hmam作为营养物质释放的屏障，其释放速率受到限制；而在碱性介质中，pdop-g-paa-co-hmam中的活性基团(酚羟基和羧基)被去质子化，去质子化的包膜使得包裹组分可以快速地释放出来。
(4)本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂可以根据ph的不同，调节其包裹的活菌的释放速度，在一个具体的实施例中，当ph值为碱性时，本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂活菌的释放量最大，当ph值为酸性时，活菌的释放量最小。这一实验结果表明本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂可根据环境的ph值调节其包裹的活菌的释放量，在盐碱化土壤中，施用本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂，可以快速释放其中的活菌，从而加速改善土壤盐碱化问题；而在酸化的土壤中施用本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂，可以有效减缓其中的活菌的释放速率，防止活菌分解产生的有机肥料在酸性土壤中的流失，提高肥料的利用效率。
(5)本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂，其制备工艺简单、环保，不使用有机溶剂，适合于工业大量生产应用。
具体实施方式
下述实施例中所使，用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例及其具体说明用于解释和理解本发明，并不构成对本发明的不当限定。
实施例1、ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂的制备
(一)枯草芽孢杆菌表面包裹附着多巴胺
称取1.5gtris置于烧杯中，加入约的900ml去离子水，用6m的hcl将tris-hcl溶液ph调至8～8.5；将枯草芽孢杆菌(含芽孢率50％以上)50g加入上述tris-hcl溶液中，并将溶液定容至1l；加入5g盐酸多巴胺，室温搅拌2h以上，抽滤得表面包裹附着有多巴胺的枯草芽孢杆菌。
(二)ph敏感型高聚物(pdop-g-paa-co-hmam)的包覆
称取2.0gnaoh固体于20ml超纯水中，室温下磁力搅拌至naoh全部溶解。待溶液降至室温，向其中滴入3.6g丙烯酸(aa)，室温下磁力搅拌1h(锡纸包覆避光)，得到2.5mol/l的丙烯酸钠溶液(sa)。
将5-10g上述制备的表面包裹附着有多巴胺的枯草芽孢杆菌置于100ml的反应容器中，用超纯水稀释至100ml。通n20.5h除去其中的溶解氧，向溶液中加入交联剂(go)、单体丙烯酸钠(sa)和羟甲基丙烯酰胺(hmam)，用量分别为sa9.4g/100gh2o、hmam10.1g/100gh2o，go200mg/100gh2o，将混合物在锡纸包覆下避光继续通n2，室温下快速搅拌15min。然后将反应容器转移至冰浴中缓慢搅拌5min，用移液枪加入催化剂temed和引发剂kps，用量分别为temed8μl/100gh2o、kps2g/100gh2o，搅拌30s后迅速转移至密闭模具中，在20℃下聚合24h。最后将其粉碎后浸入弱酸溶液中48h，蒸馏水中24h，然后将得到的产物在37℃下干燥至恒重，得到ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂。
实施例2、ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂的活菌释放实验
取按照实施例1所述方法制备的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂6g，平均分为3份，分别于ph值为5、7、9的无菌水中放置1天，然后检测不同ph值的情况下，ph敏感型菌剂的活菌释放量。
平板检测法检测活菌释放量检测方法：
1)按照放置后的样品：无菌水的质量体积比为1∶10的比例配制成溶液，将所述溶液抽滤过3微米滤膜，以滤去未释放活菌的表面包裹附着有多巴胺的菌剂微粒以及表面包覆高聚物分子的菌剂微粒；
2)收集滤液，加入玻璃珠，静置20min，在旋转式摇床上200r/min振荡30min，即得母液菌悬液；
3)用无菌移液管分别吸取5.0ml上述母液菌悬液加入45ml无菌水中，按体积比为1∶10的比例进行系列稀释，分别得到不同稀释倍数的一系列稀释菌悬液；
4)每个样品取3个连续适宜的稀释度，用无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1ml，加至固体琼脂培养基上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度的菌悬液均匀涂于固体琼脂培养基上；每个稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，于37℃的恒温培养箱中培养12-36h；
5)菌落计数和样品中活菌数目的计算：按照国家标准gb20287-2006中的方法进行。
检测结果如表1所示。表1结果表明，按照实施例1所述方法制备得到的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂可以根据ph的不同，调节其包裹的活菌的释放速度，当ph值为碱性时，活菌的释放量最大；当ph值为酸性时，活菌的释放量最小。这一实验结果表明本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂可根据环境的ph值调节其包裹的活菌的释放量，在盐碱化土壤中，施用本发明提供的ph敏感型菌剂，可以快速释放其中的活菌，从而加速改善土壤盐碱化问题；而在酸化的土壤中施用本发明提供的ph敏感型枯草芽孢杆菌菌剂，可以有效减缓其中的活菌的释放速率，防止活菌分解产生的有机肥料在酸性土壤中的流失，提高肥料的利用效率。
表1
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。