基于免疫磁珠标记细胞的分级筛选方法与流程

本发明属于细胞分选技术领域，具体涉及一种基于免疫磁珠标记细胞的分级筛选方法。

背景技术

免疫磁珠在分子及细胞生物学方面已得到了广泛应用，包括核酸提取、特定蛋白质与细胞的分选和富集等。现有基于免疫磁珠的细胞筛选技术直接通过磁力对磁珠进行吸引，导致其对于与细胞结合的免疫磁珠和未结合的免疫磁珠没有区分能力，在对磁珠进行表面增强拉曼、杂散磁场测量等进一步定性/定量检测时无法除去由未结合的磁珠引起的噪声信号，限制了免疫磁珠的进一步应用。

在实验室研究中，国际顶尖研究单位已通过在磁传感器上表面制备特异性抗体的方式，与目标细胞表面抗原结合，从而将目标细胞成功捕获在磁传感器上方。再通过流体冲洗，就可以实现磁标记细胞的筛选。

但是，现有实验室磁传感器的检测方案中，依靠目标细胞表面抗原和传感器上方抗体的结合来实现目标细胞的捕获，并依靠流体冲刷来除去未结合的磁珠。该方案可以除去其它细胞与未结合的磁珠，但难以保证微量目标细胞被成功捕获。并且，这一方案使用了化学结合的方式，对循环肿瘤细胞等极微量的细胞难以保证成功捕获，这样就会在诊断中引起误诊。另外，这种通过抗体-抗原结合捕获目标细胞的方法需要人工参与，而且必须需要专业的技术人员才能够完成，不利于集成，无法满足大数据时代的信息化需求。

另外，采用免疫磁珠对目标细胞上特有的抗原或受体进行标记，这种方法只能分选出一种目标细胞。但是在实际应用中，例如对全血样品进行肿瘤细胞检测时，只分离出一种肿瘤细胞，但是却不能确认全血样品中是否还含有其他种类的肿瘤细胞，无法为肿瘤细胞的检测提供全面准确的结果。虽然，不同的肿瘤细胞上可能存在相同的抗原或受体，用免疫磁珠标记后可以一次分选出多种肿瘤细胞，但是进一步确定肿瘤细胞种类的问题却得不到解决，无法为癌症诊断提供准确的结果。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于免疫磁珠标记细胞的分级筛选方法，该方法采用物理的方式实现细胞筛选，能够极大的提高目标细胞的捕获率，而且能够在一次筛选过程中，通过分级筛选将多种目标细胞均筛选出来。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于免疫磁珠标记细胞的分级筛选方法，包括若干级级联的细胞筛选装置，所述细胞筛选装置的主体结构被一层细胞筛分割成上层、下层腔体；通过硅胶管彼此连接,待检测样品中包含有n种目标细胞，n种目标细胞之间都携带与其他细胞所不同的特有的表面受体为x’，与表面受体x’配对的抗体为x，每级细胞筛选装置内充满了修饰有x抗体的单一免疫磁珠的悬浊液，其中n大于等于2；所述分级筛选方法包括如下步骤，

s1.注入样本，将检测样品从进样口输入到第一级的细胞筛选装置的腔体内，关闭两侧阀门，使细胞与腔体内的免疫磁珠充分的结合；

s2.冲洗免疫磁珠，待结合一定时间段后，对细胞筛选装置施加纵向水流，由于免疫磁珠尺寸远小于筛孔，免疫磁珠将会被冲入到下层腔体，与免疫磁珠结合的目标细胞和其他细胞由于尺寸远大于筛孔，将留在上层腔体；

s3.施加磁场：在腔体周围加入纵向脉冲磁场，与免疫磁珠结合的目标细胞将吸附到细胞筛表面，其他细胞的悬浊液将仍在上层腔体作自由运动；

s4.冲洗其他细胞：打开与下一级腔体连接的阀门，从进样口通入横向水流，将在上层腔体的其他细胞冲入到下一级的上层腔体，其中充满着另外一种特异性极强的免疫磁珠悬浊液；

s5.收集目标细胞：从下层腔体的下入口加入纵向水流，并撤掉纵向脉冲磁场，此时目标细胞将脱离细胞筛表面顺着水流反向向上运动，从上腔体的上出口收集到目标细胞；

重复步骤s2-s5，直到筛选出所有的目标细胞，且目标细胞将在不同级的细胞筛中筛选出来。

进一步地，所述的免疫磁珠悬浊液是根据目标细胞间具有高度特异性不同的免疫结合位点制作形成。

进一步地，所述纵向脉冲磁场由磁场线圈和控制线圈中通入电流的直流电源、软磁体或者电磁体和控制其磁场发生的信号发生器产生。

进一步地，所述细胞筛结构为在10*10mm²硅基底上形成5*5mm²的筛孔阵列，单个筛孔大小为5μm或8μm圆孔，或为5*15μm的方孔。

进一步地，所述样品输入以及冲洗的操作是通过注射器或者微流泵来实现的。

进一步地，细胞筛上层腔体的左侧设置有样本进样口，顶部设置有细胞收集口和纵向水流注入口，右侧设有下一级连接口；而在下层腔体的底部设置有出入口，可用于免疫磁珠的收集和反冲水流的注入。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

(1)本发明使用物理方式实现细胞筛选，目标细胞的捕获率可达95％以上，将大大提高了循环肿瘤细胞等微量细胞的筛选效果。同时，自由免疫磁珠的筛出率可达99％，可实现高信噪比磁性细胞检测；

(2)本发明的方法能够在同一个筛选装置中，通过多次分级筛选将多种目标细胞筛选出来，从而可以实现多种类型肿瘤细胞的同时诊断并提供准确的检测结果，剩余的自由免疫磁珠还可进行再一次的使用，提高了免疫磁珠在临床检测上的应用；

(3)本发明的方法操作简便，难度小，而且便于与下游分析的设备(比如基因测序和流式计数)集成，用于完成本发明方法的数据分析和生物分析，能够满足现代生物医疗器械的高度智能化，自动化要求。

附图说明

图1为细胞筛选装置的一种结构示意图；

图2为三种类型的肿瘤细胞及其上的表面受体示意图；

图3为分级筛选步骤操作示意图；

图中：a、b、c、d为阀门。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明的基于免疫磁珠标记细胞的分级筛选方法，包括若干级级联的细胞筛选装置。如图2所示为其中的三级细胞筛选装置的结构示意图，细胞筛选装置参考图1，包括内部中空的长方体状壳体，腔体内部水平设置一层细胞筛将壳体分割成上层腔体和下层腔体。细胞筛选装置的上层腔体的左侧设置有进样口，对应上层腔体的右侧设置有与下一级的连接口；上层腔体的顶侧设置有一个冲洗磁珠口也是目标细胞收集口，对应下层腔体的底侧设置有磁珠收集口和反冲目标细胞口。

在本实施例中，将细胞筛选装置的腔室设置为立方体状，仅作为一种选择方式，细胞筛选装置的腔室可是斜圆锥，球形，圆柱形和组合体等形状，本领域的技术人员可根据实际的需要来进行具体选择和控制。

其中，细胞筛可由硅片制成，也可由聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯等高分子材料制成。对于细胞筛网孔的形状、尺寸和排布无硬性要求，主要的参数未筛孔的直径的大小。只要筛孔和的尺寸远小于于目标细胞的直径且远大于免疫磁珠的直径之间即可，筛孔的形状一般为圆形或者是狭缝型，筛孔可通过纳米压印或者光刻技术制备而成。在本实施例中，细胞筛选用650μm厚的si片经光刻技术制备而成。单个筛片为10×10mm²的si片面积，在其中央有5×5的0.8*0.8mm²方形窗口阵列，每个方形窗口中含有6422个筛孔。筛孔选用狭缝型，具体采用长为15μm，宽5μm的矩形网孔，网孔间的水平间距为7.5μm，垂直间距为7.5μm，角间距为12.7μm。当然也可采用直径为5μm或8μm圆孔。

细胞筛选装置的主体结构被一层细胞筛分割成上层、下层腔体；通过硅胶管彼此连接。待检测样品中包含有n种目标细胞，n种目标细胞之间都携带与其他细胞所不同的特有的表面受体为x’，与表面受体x’配对的抗体为x，每级细胞筛选装置内充满了修饰有x抗体的单一免疫磁珠的悬浊液，其中n大于等于2；要分选一种类型的肿瘤细胞就需要找到这种细胞表面与其他肿瘤细胞所不具有的抗体，这种抗体具有高度特异性，本实施例免疫磁珠悬浊液是根据目标细胞间具有高度特异性不同的免疫结合位点制作形成。免疫磁珠的材料可为金、铜、四氧化三铁等，磁珠外层设置有包被，包被的材料可为聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、多糖等，在本实施例中，磁珠采用四氧化三铁制成，直径为200nm，磁珠外层由聚苯乙烯包被。

分级筛选方法参考图3，包括如下步骤，

s1.注入样本，将检测样品从进样口输入到第一级的细胞筛选装置的腔体内，关闭两侧阀门，使细胞与腔体内的免疫磁珠充分的结合

s2.冲洗免疫磁珠，待结合一定时间段后，对细胞筛选装置施加纵向水流，由于免疫磁珠尺寸远小于筛孔，免疫磁珠将会被冲入到下层腔体，与免疫磁珠结合的目标细胞和其他细胞由于尺寸远大于筛孔，将留在上层腔体；

s3.施加磁场：在腔体周围加入纵向脉冲磁场，与免疫磁珠结合的目标细胞将吸附到细胞筛表面，其他细胞的悬浊液将仍在上层腔体作自由运动；

s4.冲洗其他细胞：打开与下一级腔体连接的阀门，从进样口通入横向水流，将在上层腔体的其他细胞冲入到下一级的上层腔体，其中充满着另外一种特异性极强的免疫磁珠悬浊液。

s5.收集目标细胞：从下层腔体的下入口加入纵向水流，并撤掉纵向脉冲磁场，此时目标细胞将脱离细胞筛表面顺着水流反向向上运动，可以从上腔体的上出口收集到目标细胞；

重复步骤s2-s5，直到筛选出所有的目标细胞，且目标细胞将在不同级的细胞筛中筛选出来；

参考图3，在第一级中含有充满与表面受体e’配对的抗体为e的悬浊液，根据图2示意图，e抗体只有丙癌细胞所具有相对应的受体，因此可以使用e抗体将丙癌细胞从所有细胞中分选出来。所以通过s1-s5可以将丙癌细胞从第一级的上层腔体的顶口处筛选出来。同理，在第二级根据图2重复s2-s5的步骤，可使用c抗体筛选出乙癌细胞，在第三级中使用b抗体可筛选出甲癌细胞。以此类推，该装置可以实现更多种的肿瘤细胞的分选。

上述样品的输入，以及对上、下层腔体的冲洗和反冲操作是通过微量泵来实现的。本实施例微量泵采用注射泵，该泵由电机驱动螺杆(导向螺杆)慢慢旋转，将注射器的活塞推入，并且将注射液推出。电机反方向旋转可以回吸液体。优点:从非常小到非常大的注射量均可精确分配；容易消毒；可以注射和回吸；具有多种可以方便地编程实现的注射表。当然也可采用蠕动泵或膜式泵。

冲洗磁珠的作用是通过流体将没有结合的免疫磁珠冲洗到下层腔体，由于免疫磁珠的尺寸远小于筛孔的大小，游离的免疫磁珠直径通常小于500nm，细胞筛孔的大小为5μm和8μm因此可顺利通过网孔进入到下层腔体，所以通过冲洗的操作使细胞与磁珠实现分离。避免在施加磁场后，细胞先堵住筛孔使剩余免疫磁珠无法被收集，进入下一级的腔室。

纵向脉冲磁场的作用是通过磁场对免疫磁珠吸引，使得被免疫磁珠标记的目标细胞向上运动，纵向磁场一般由磁场线圈和控制线圈中通入电流的直流电源、软磁体或者电磁体和控制其磁场发生的信号发生器产生。在本实施例中，选定纵向磁场由亥姆霍兹线圈和可控直流电源产生，在使用线圈的过程中仅使用单侧线圈产生一个梯度磁场，最小处磁场强度约为0.5t。电磁铁结构简单，容易控制，并且可通过调整磁力线圈的匝数和缠绕直径来调整磁场的大小，通常电流信号设置在1a以内。在本实施例中，选用0.5a，间隔时间为10s的间断式方波信号，用于向磁珠施加横向磁力，提高筛出率。

在进行步骤s2之前，在细胞筛选装置的两侧，分别设置磁力线圈，并通电，在细胞筛选装置上层腔体的一侧放置亥姆霍兹线圈，线圈的电流由可编程直流电源进行控制，磁场方向一直保持不变，电流信号的波形为间断式方波，其间断时间的长短要与进入下一级的时间相匹配，及与流速和连接两级之间的管子长度有关。

施加磁场后，被免疫磁珠标记的目标细胞在磁场的作用力下，均朝向细胞筛运动，而被免疫磁珠标记的目标细胞直径通常在10μm以上(如肿瘤细胞)大于细胞筛的网孔，因此被细胞筛所阻挡。在本实施例中，细胞筛如果选用圆形设计，那么有一部分细胞筛的网孔就会被目标细胞完全所阻挡，可能有一部分游离的磁珠就会滞留在下层腔体中，而选用矩形网孔则不会出现这个问题，被免疫的磁珠标记的目标细胞虽然由于磁场的作用而吸附在细胞筛上，但是因为形状不同，不会将矩形的网孔完全阻塞，由于免疫磁珠的体积相对于被免疫磁珠标记的目标来说要小得多，因此免疫磁珠能够顺利的通过网孔，提高了磁珠的筛出率。

撤销纵向磁场，被免疫磁珠标记的目标细胞受到的磁场作用力消失，通过对下层腔体冲洗，即可得到只包含有被免疫磁珠标记的目标细胞的悬浊液。

相对于现有技术的化学筛选方式，该步骤使用免疫磁珠和细胞筛结合的方式实现细胞的多级筛选，通过对磁场梯度、冲洗流速、腔体尺寸的调整，目标细胞的捕获率可达95％以上，将大大提高了多种类型肿瘤细胞等微量细胞的筛选和富集效果。同时，游离的免疫磁珠的筛出率可达99％，可实现免疫磁珠的重复循环利用。而且能够在同一个装置中，通过分级筛选将多种不同类型的肿瘤细胞均筛选出来，从而可以在同一血样下提供多种类型的肿瘤检测结果，提高了肿瘤早期诊断的速度，缩短了病人的治疗周期。

实施例2

实施例2与实施例1的不同之处在于，本实施例中为避免磁珠停在筛孔间的硅片连接处，选用由微波发生器产生的横向振荡微波，免疫磁珠在横向微波的作用力下，轻微晃动，落入筛孔中。免疫磁珠经过细胞筛的速率和通过率都很高。

实施例3

实施例3与实施例1的不同之处在于，为提高细胞的收集率，在本实施例中选用超声振荡的方式。卡在筛缝中的细胞在超声的作用下，轻微晃动并释放出来，在细胞收集过程中的速率和效率会显著提高。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有和变换都应属于本明所附权利要求的保护范围。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。