一种碱蓬多糖提取物及其制备方法和应用与流程

本发明属于医药技术领域领域，具体涉及一种碱蓬多糖提取物及其制备方法和应用。

背景技术：

碱蓬（suaedasalsa），又名翅碱蓬，俗称黄须菜，属黎科，为一年生叶肉质化真盐生草本植物，具有极强的生命力，属于一种典型的盐生结构。盐地碱蓬的药用价值早在《本草纲目拾遗》中就有记载，“盐蓬，味咸性寒，清热消积”。常食用碱蓬有助于人体酸碱平衡，近年来一些研究表明，碱蓬提取物具有降低胆固醇、降血脂、抗免疫、抗衰老、抗肿瘤等功效，对于保健及功能药物的开发具有重要意义。多糖是一种广泛存在于动植物、微生物中的大分子物质，它不仅在生物体的生长发育中发挥重要作用，而且具有多方面的生物活性和功能。随着科学研究的发展，多糖生物功效多样性的研究正日益成为国内外研究的热点。

目前国内外对碱蓬多糖研究较少，对于其功效的研究也多限于抗氧化、清除自由基方面，对免疫活性的研究仅限于血清免疫。王昭晶（碱蓬水溶性多糖spb的分离纯化以及活性的初步研究[j].食品科技,2010,35（09）:236-238）从碱蓬中提取出水溶性粗多糖sp，经deaesepharosecl-6b柱层析分离纯化得到分子量为40万的均一组分多糖spb；spb有超氧阴离子清除作用和羟自由基清除作用。王昭晶（碱蓬多糖spa的分离纯化和抗氧化活性研究[j].辽宁中医药大学学报,2009,11（09）:168-169）从碱蓬中提取出水溶性粗多糖sp，经sevage法脱蛋白、deaesepharosecl-6b柱层析分离纯化得到均一组分多糖spa；并研究了spa的羟自由基清除作用和超氧阴离子清除作用。庞庭才等（响应面分析法优化碱蓬多糖提取工艺及其抗氧化性分析[j].南方农业学报,2015,46（07）:1280-1286）采用naoh溶液提取碱蓬多糖，并研究了其抗氧化性。刘素华（盐地碱蓬中植物盐的提取及其多糖功能性的研究[d].天津科技大学,2017）采用热浸提对碱蓬多糖进行提取，采用葡聚糖凝胶进行分离纯化，得到了平均分子量为2.52×10⁶da的碱蓬多糖；并研究了碱蓬多糖的体外抗氧化活性和对hepg2肿瘤细胞的抑制作用。沙爱龙等（硬枝碱蓬多糖对免疫抑制小鼠血清中no含量及nos活性的影响[j].四川动物,2013,32(01):90-92）采用氢化可的松皮下注射小鼠建立免疫抑制模型，观察不同浓度硬枝碱蓬多糖灌服小鼠后血清中no含量及tnos、inos活性的影响。结果提示，硬枝碱蓬多糖可通过抑制nos并最终抑制no的细胞毒性作用而对正常组织细胞发挥保护作用，并进一步增强小鼠的免疫力。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种非均一组分的碱蓬多糖类提取物。本发明的另一目的是提供一种上述多糖提取物的制备方法。本发明的再一目的是提供上述多糖提取物在制备抗肿瘤、免疫调节或治疗2型糖尿病药物制剂中的应用。本发明还有一目的是提供一种含有上述多糖提取物的药物制剂，及其在抗肿瘤、免疫调节和治疗2型糖尿病中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种碱蓬多糖，其分子量为20000-100000da；由半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸6种单糖组成，其摩尔比为0.6%：7.3%：1.0%：81.2%：4.5%：5.4%。

一种上述碱蓬多糖的制备方法，包括以下步骤：

（1）粉碎：将碱蓬的干燥叶粉碎过筛得粉碎物；

（2）脱脂：将步骤（1）制得的粉碎物用乙醇加热回流，然后干燥残渣；

（3）水提：将步骤（2）所得残渣加水，加热浸提，按料液比，加去离子水进行热水浸提，将提取液浓缩、离心后取上清液；

（4）脱色脱蛋白：将步骤（3）所得上清液加入活性炭脱色，过滤后滤液采用sevage法脱蛋白；

（5）醇沉：将步骤（4）所得液体浓缩，然后在浓缩液中加入乙醇，4℃沉淀过夜，离心弃上清液得沉淀；

（6）洗涤：将步骤（5）所得沉淀物依次用乙醇和丙酮洗涤，干燥至恒重，即为碱蓬粗多糖；

（7）提纯：将步骤（6）所得碱蓬粗多糖加水配成溶液；经deae-52纤维素离子交换柱，采用苯酚-硫酸法跟踪检测收集液的od490，分别依次以0，0.2，0.4，0.6，0.8mol/l氯化钠洗脱1-8个柱体积；然后将0.2mol/l氯化钠洗脱组分过sephadexg-75凝胶柱，采用苯酚-硫酸法跟踪检测收集液的od490，用去离子水做洗脱液，洗脱1-8倍柱体积，所得洗脱液浓缩、干燥，得碱蓬多糖固体。

步骤（1）中，所述粉碎物的细度为过20-40目筛。

步骤（2）中，所述乙醇质量百分含量为80-95%；所述回流温度为65-85℃；时间为1-2h；优选的，脱脂次数为2-3次。可通过过滤或者离心的方式获得残渣。优选的，离心速度为3000-5000rpm，离心时间为10-15min。

步骤（3）中，所述残渣与水的料液比为1:10-20。浸提温度为60-90℃，浸提时间为2-4h；优选的，浸提次数为2-3次。浓缩优选为60-90℃减压浓缩。离心速度为3000-5000rpm，离心时间为10-15min。

步骤（4）中，所述活性炭的质量体积百分数为1%-4%。脱色条件为：温度50-65℃，ph3-6；脱色时间为0.5-2h。优选的，脱色次数为2-3次。

步骤（5）中，所述乙醇的质量百分含量为30-50%，加入量为浓缩液体积的2-5倍。浓缩优选为60-90℃减压浓缩。离心速度为3000-5000rpm，离心时间为10-15min。

步骤（6）中，干燥方法优选为冷冻干燥。

步骤（7）中，所述碱蓬粗多糖溶液的浓度为10-50mg/ml，干燥方法优选为冷冻干燥。

一种上述碱蓬多糖在制备抗肿瘤、免疫调节和治疗2型糖尿病药物中的应用。

一种含有上述碱蓬多糖的药物。所述药物的剂型可以为口服、注射或者外用剂型；选自但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸、糖浆、缓释剂、注射液、水针剂、粉针剂、气雾剂、喷雾剂、橡胶膏、凝胶剂、巴布剂；优选为口服制剂和注射制剂。

上述液体注射制剂中碱蓬多糖的含量为0.03-4.5w/v%，优选1-3w/v%；渗透摩尔浓度为200-400mosmol/l；ph值为4-9，优选为6-8。

本发明的有益效果为：

本发明研究了碱蓬多糖的提取，并对其结构组成及其活性进行了初步探讨，发现碱蓬多糖结构较为均一，单糖组成简单并具有一定活性，这为进一步深入研究其作用机理，开发多糖类新药物提供了理论依据。本发明从碱蓬中提取出的多糖，其药效物质基础明确，是由具有抗肿瘤、免疫调节和治疗2型糖尿病作用的多糖组分组成。本发明提供的多糖提取物制备方法多糖提取率高，稳定可行，适合工业化生产。

附图说明

图1是多糖经deae-52所得ssp-1和ssp-2洗脱曲线；

图2是ssp-2经sephadexg-75洗脱曲线；

图3是碱蓬多糖分子量测定图谱；

图4是十一种单糖标准图谱；

图5是碱蓬多糖单糖组成图谱；

图6是碱蓬多糖红外图谱；

图7是碱蓬多糖对mcf-7细胞活力的影响；

图8是不同浓度碱蓬多糖对mcf-7表达的相关蛋白的westernblot；

图9是不同浓度碱蓬多糖对mcf-7细胞相关蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1碱蓬多糖提取物的制备方法

（1）取干燥碱蓬叶粉碎后，过20目筛，得碱蓬粗粉；

（2）称取碱蓬粗粉以80%乙醇回流脱脂2次，每次2h；提取完毕，3500rpm离心15min后，取沉淀物置于烘箱内45℃烘干；

（3）沉淀物加10倍量水于80℃水浴锅中加热回流提取2次，每次3h。取滤液，合并两次滤液；将滤液在60℃下减压浓缩，3000rpm离心15min后取上清液；

（4）将上清液的ph调至4，加入3%hc-767型活性炭于温度65℃下脱色50min，采用硅藻土助滤，脱色重复2次；滤液按sevag法脱蛋白后获得滤液；

（5）滤液加3倍量的50%乙醇，4℃下沉淀过夜，离心（3000r/min，15min）弃上清得沉淀；所得沉淀物依次用乙醇和丙酮洗涤，冷冻干燥至恒重，即为碱蓬粗多糖；

（6）将粗多糖加双蒸水配成浓度为20mg/ml的溶液，离心，取上清经deae-52纤维素离子交换柱，采用苯酚-硫酸法跟踪检测收集液的od490，分别依次以0，0.2，0.4，0.6，0.8mol/l氯化钠洗脱3个柱体积，流速为1ml/min，每10ml收集一管。其中水洗脱部分得组分ⅰ（ssp-1），如图1所示；0.2mol/l氯化钠洗脱部分得组分ⅱ（ssp-2），由于组分ⅱ含量较高，收集合并其单一洗脱峰。将组分ⅱ（ssp-2）过sephadexg-75凝胶柱，采用苯酚-硫酸法跟踪检测收集液的od490，用去离子水做洗脱液，洗脱3倍柱体积，流速为0.5ml/min，每5ml收集一管，所得ⅱ’（ssp-2’）组分洗脱峰为单一峰，将其浓缩，冷冻干燥，得ⅱ’（ssp-2’）多糖固体，如图2所示。

实施例2碱蓬多糖的结构鉴定

1.高效凝胶排阻色谱法检测其分子量

通过测定右旋糖酐标准溶液制作的标准曲线，以标准右旋糖酐溶液的浓度为横坐标，其分子量的对数为纵坐标。碱蓬多糖的色谱图如图3所示。由图3可知，碱蓬多糖在12.35min左右出峰，通过gpc计算其分子量为20000-100000da。

2.柱前衍生化法检测其单糖组成

分别取2mg样品于安瓿瓶中，加入2ml10mol/l的盐酸，充氮气后酒精喷灯封管，置于80℃烘箱中水解30min，30℃下减压蒸干除去盐酸，然后加入甲醇蒸干，重复3次以完全除去残留的盐酸。60℃下真空干燥1h使水解产物完全干燥后，采用三甲基硅醚化衍生方法对水解产物进行衍生化，样品进气相进行检测。

图4为十一种单糖标准图谱，图中标注1-11分别为甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖。图5为碱蓬多糖单糖组成图谱，根据图5中样品中单糖的峰形及出峰时间，可以比对判断出样品由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖和木糖6种单糖组成。经过计算可得甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖和木糖摩尔比为0.6%：7.3%：1.0%：81.2%：4.5%：5.4%。

3.红外光谱分析

经干燥的碱蓬多糖ssp-2’，取2.0mg，以kbr压片，在4000~400cm^-1的范围内进行红外光谱扫描。ssp-2’扫描结果见图6，由图6可知，在3371.57cm^-1处有一个较强的宽峰，为羟基（-oh）的伸缩振动，存在着分子间氢键形成；在2918.29cm^-1处的吸收峰为c-h的伸缩振动，1409.96cm^-1处的吸收峰是c-h的变角振动，上述峰为多糖的特征吸收峰。1604.77cm^-1出现的吸收峰为c=o的伸缩振动，其中在1739.79cm^-1出现的吸收峰为糖醛酸中c=o的伸缩振动。在1160-1010cm^-1之间的三个特征吸收峰，分别是1014.56cm、1124.49cm和1153.01cm⁻¹，为吡喃环上c-o-c和c-o-h的伸缩振动，表明存在吡喃糖苷。893.04cm⁻¹处有明显的β-糖苷键吸收峰。由红外图谱图6可知，ssp-2’主要含有β-糖苷键，为吡喃糖环结构。

实施例3碱蓬多糖提取物注射剂的制备

组方：

取上述组方中各组分，加入组方量80%注射用水，使多糖溶解，搅匀，补充注射用水至全量，以0.22μm滤膜过滤，以5ml为计量单位灌装，制成100支，至121℃下灭菌15min，即得。

实施例4碱蓬多糖提取物口服液的制备

组方：

取上述组方中各组分，加入80%注射用水，使多糖溶解，搅匀，调节ph，补充注射用水至全量，以0.22μm滤膜过滤，流通蒸汽灭菌30min，灌装至20ml安瓿中，封口，制成25瓶。

实施例5碱蓬多糖提取物的抗肿瘤活性的体外研究

1.mtt法检测不同浓度的碱蓬多糖对肿瘤细胞生长的抑制作用

对数期mcf-7细胞消化下来后进行计数，调整细胞密度为1×10⁴个/ml接种到96孔板上，100μl/孔。置于co2恒温培养箱过夜培养，待细胞贴壁后加入不同浓度的碱蓬多糖（终浓度为0，50，200，500，800，1000μg/ml），每个孔做5个重复，分别培养24h和48h后，每孔加入20μl（0.5mg/ml）mtt反应4h后弃上清，加入200μldmso，避光震荡溶解10min后用酶标仪检测570nm处的吸光值，计算细胞凋亡率。

采用mtt法检测不同浓度碱蓬多糖对mcf-7细胞的抑制作用，以碱蓬多糖浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标作图7。由图7可知，结果表明mcf-7细胞活力随着多糖浓度的增加而降低，表现出良好的剂量依赖关系。

2.westernblot分析

取对数期mcf-7细胞，制成3×10⁵个/ml单细胞悬液，接种于25mm细胞培养瓶中，置于co2恒温培养箱过夜培养，待细胞长满后加入不同浓度的碱蓬多糖（终浓度为0，0.25，0.5，1.0mg/ml），培养24h后收集细胞。提取细胞总蛋白并用bca法测定总蛋白浓度。根据所测结果确定上样量和pbs的用量，进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据目的蛋白的大小，参照蛋白mark的指示适时终止电泳。采用半干法转膜，封闭，洗膜，按照对应分子质量切割后分别置于1:1000稀释的一抗溶液中，4℃杂交过夜，第2天用洗膜液漂洗后加入1:1000稀释的二抗，摇床上杂交1h，然后取出用洗膜液冲洗，然后加ecl显色剂进行显色，如图8所示；检测，以碱蓬多糖浓度为横坐标，以蛋白caspase-3/β-acting比值、bax/β-acting比值、bcl-2/β-acting比值为纵坐标，分别作图9a、9b、9c。

由图9可知，westernblot实验结果表明：促凋亡蛋白bax在碱蓬多糖作用24h后，表达显著升高；抑制凋亡蛋白bcl-2在碱蓬多糖作用24h后，表达下降（bax/bcl-2的比值明显变化），直接参与线粒体凋亡途径的caspase-3，在药物作用24h后即被活化。这些蛋白表达变化表明，碱蓬多糖诱导mcf-7细胞凋亡，和线粒体途径有关。

实施例6碱蓬多糖提取物对mcf-7荷瘤小鼠的抗肿瘤及免疫调节活性

取昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重20±5g。无菌条件下取接种7天的mcf-7荷瘤小鼠腹水，以无菌9%氯化钠溶液稀释，细胞数为3×10⁶/ml，每只小鼠右腋皮下接种1ml。接种后24h后称重，小鼠按照体重随机分组，每组10只，灌胃给药，连续给药7天，每天一次，其中荷瘤对照组每日0.4ml生理盐水，环磷酰胺组、碱蓬多糖提取物组每日按表1中的剂量给药。给药7天后停止给药，次日脱颈椎处死小鼠，称取小鼠体重，解剖得瘤体、脾、胸腺，分别称重，计算抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数，结果见表1、表2。

表1对mcf-7荷瘤小鼠抑瘤作用结果

注：*与对照组比较，p<0.05，**与对照组比较，p<0.01

由表1结果可以看出，碱蓬多糖提取物具有抑制mcf-7荷瘤小鼠肿瘤生长的作用，且抑瘤率随着剂量的增加而增加，具有一定的量效关系。

表2对mcf-7荷瘤小鼠免疫器官调节作用结果

注：*与对照组比较，p<0.05，**与对照组比较，p<0.01

由表2结果可以看出，不同剂量的碱蓬多糖提取物与环磷酰胺组比较，其胸腺及脾脏指数均具有显著差异，中、高剂量组与荷瘤对照组比较，具有显著性差异，说明碱蓬多糖提取物具有促进胸腺和脾脏增长的作用，表明其可以改善免疫功能，具有免疫调节作用。

实施例7碱蓬多糖提取物对2型糖尿病大鼠降血糖作用

1.糖尿病动物模型的制作

取体重150-250g的6周龄sd雄性大鼠适应性饲养三天后，禁食12h，按30mg/kg腹腔注射ph4.5的柠檬酸溶液配制的链脲佐菌素（stz），并给予高糖高脂饲料，4周后禁食12h，尾静脉取血检测空腹血糖水平，选用血糖值大于11.1mmol/l的大鼠作为糖尿病大鼠。

2.实验分组及处理

雄性sd大鼠10只，作为正常对照组，将建模成功的2型糖尿病大鼠随机分为4组，每组10只，一组作为糖尿病模型对照组，碱蓬多糖提取物组每日按表3中的剂量给药。分别按组对实验大鼠灌胃给药，每天一次，各实验对照组给予相同体积的生理盐水，连续给药14天后，尾静脉取血测定血糖，结果见表3。

表3对2型糖尿病大鼠的降血糖作用结果

注：*与对照组比较，p<0.05，**与对照组比较，p<0.01

由表3结果可以看出，不同剂量的碱蓬多糖提取物连续灌胃2周后，低、中、高剂量组与糖尿病模型对照组比较均可以显著降低糖尿病大鼠的空腹血糖，说明碱蓬多糖提取物可以用于制备治疗糖尿病的药物，尤其是2型糖尿病。