抗GFAP蛋白单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合gfap蛋白的单克隆抗体umab129、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术

gfap即胶质纤维酸性蛋白，是iii型中间丝蛋白。gfap和波形纤维蛋白形成星形胶质细胞中的中间纤丝，并且调节其运动性和形状。具体而言，波形纤维蛋白纤丝在发育早期阶段存在，而gfap纤丝是分化和成熟的脑星形细胞的特征。

gfap常用作源自星形细胞的颅内和椎管内肿瘤的标记物，gfap中间纤维也存在于周围神经系统内非髓鞘形成的雪旺氏细胞中。目前临床上常用免疫组织化学(ihc)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而ihc实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对gfap蛋白的单克隆抗体对ihc检测gfap表达水平具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的gfap蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测gfap蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc)，保藏日期为2018年4月26日，保藏编号为cgmccno.15598。

本发明还提供了一种特异性结合gfap蛋白的单克隆抗体umab129，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据gfaporf核苷酸序列(gfaporf核苷酸序列如seqidno.1所示，1299bp；gfap氨基酸序列如seqidno.2所示)

设计引物pcr扩增gfaporf第1bp位到第1299bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点sgfi和mlui，插入表达载体pcmv6-entry，构建gfap氨基酸序列第1位到第432位的重组表达质粒pcmv6-rgfap；上游扩增引物序列，seqidno.3:cacgcgatcgcatggagaggagacgcatcacc下游扩增引物序列seqidno.4:accgacgcgtcatcacatccttgtgctcctg

(2)gfap重组蛋白的表达与纯化：将gfap重组表达质粒转化hek293t细胞，裂解离心获得上清，ddk亲和层析柱纯化，获得纯化的gfap重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的gfap重组蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，elisa法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗gfap特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为umab129，亚型鉴定为igg1；通过无血清培养制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得gfap单克隆抗体umab129。分别通过westernblot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

本发明还提供了单克隆抗体umab129在制备用于检测gfap蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体umab129，可检测组织细胞中gfap的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与gfap的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于星形胶质细胞瘤。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为cgmccno.15598)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体umab129。本发明还提供了单克隆抗体umab129在制备用于检测gfap蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体umab129的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体umab129在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与gfap蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了gfap蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内gfap蛋白表达水平，可应用于星形胶质细胞瘤等肿瘤组织中gfap的表达水平。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株umab129的分类命名为：gfap鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：cgmcc；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2018年4月26日；

保藏编号：cgmccno.15598。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1克隆位点设计图，其中底纹部分为orf区；

图2示实施例2重组gfap蛋白westernblot检测结果图，以anti-ddk抗体检测重组gfap蛋白在hek293t细胞中的表达，其中左侧泳道为转染空载体的hek293t细胞裂解液为抗原的检测结果、右侧泳道为转染pcmv6-rgfap质粒的hek293t细胞裂解液为抗原的检测结果；

图3示实施例2重组gfap蛋白sds-page结果图，用抗ddk亲和层析柱纯化重组gfap蛋白，纯化后的蛋白通过sds-page胶电脉、考马斯亮蓝染色；

图4示实施例3以单克隆抗体umab129识别完整的gfap(fulllengthgfap,gfap-fl)蛋白的westernblot检测结果图。泳道1为转染pcmv6-entry的细胞裂解液；泳道2为转染pcmv6-gfap-fl的细胞裂解液；

图5示实施例3以单克隆抗体umab129识别snb19人胶质母细胞瘤细胞中内源gfap蛋白的westernblot检测结果图。

图6示实施例3以单克隆抗体umab129识别10种不同的人组织裂解液中内源gfap蛋白的westernblot检测结果图。从左到右依次为1：睾丸，2：网膜，3：子宫，4：乳腺，5：脑，6：肝，7：卵巢，8：结肠，9：脾，10：甲状腺。

图7示实施例3以单克隆抗体umab129识别小鼠脑组织裂解液中内源gfap蛋白的westernblot检测结果图。

图8示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的成人脑组织免疫组化结果图(一抗为gfap单克隆抗体umab129)；

图9示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人胚胎大脑皮层组织免疫组化结果图(一抗为gfap单克隆抗体umab129)；

图10示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人胚胎小脑组织免疫组化结果图(一抗为gfap单克隆抗体umab129)；

图11示实施例5大鼠原代神经元细胞免疫荧光染色结果图(绿色为一抗gfap单克隆抗体umab129染色，蓝色为dapi染色)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、gfap重组表达质粒的构建

以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒rc204548(含gfaporf1299bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点sgfi和mlui，克隆入表达载体pcmv6-entry，建立gfap重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。

实施例2、gfap重组蛋白的表达与纯化

1、转染hek293t细胞：hek293t细胞以1:3传至培养皿中继续培养；取7.5mldmem(无血清及抗生素)至50ml管中，加入300μlpeimegatran1.0混匀；加入75μggfap重组表达质粒dna至混匀液中，混匀并静置30分钟；分别取515μl至各培养皿中于37℃5％co2培养箱中培养。转染24小时后，每皿细胞添加25μl2m丁酸钠至终浓度5mm。

2、裂解细胞：转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入1mlpbs进行漂洗，吸去pbs。加入1ml裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂pi和pmsf。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中的裂解液，4℃离心，收集上清。取少量上清采用wb鉴定重组gfap的表达，结果图2。

3、ddk亲和层析柱纯化：以0.45μm，33mmpvdf膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管，加入混合好的beads1ml，封口后放入360度混匀器中，于4℃结合2小时；取出15ml管，将裂解液倒入bio-rad层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样wb检测；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用tbst冲洗beads3次，滴尽后用0.1mglycineph3.5洗脱，第一次200μl，滴尽不收集，第二、三次各500μl，第四次250μl，收集至一个1.5ml离心管中，并迅速加入nah2po4(ph＝11.0)中和至ph7.0左右，每管加入甘油至终浓度为10％，tween-80至终浓度为0.1％。纯化后的重组gfap蛋白用sds-page鉴定，见图3。

由图2结果可见，转染pcmv6-rgfap质粒的hek293t细胞裂解液中wb检测后在52kd处有明显的特异条带，与多肽的理论分子量50kd基本相符。表明细胞中重组gfap蛋白特异表达。

由图3结果可见，纯化的蛋白在page胶49kd处有明显的特异条带，与多肽的理论分子量50kd基本相符。表明已获得了纯度较好的gfap重组蛋白。

实施例3、gfap单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的gfap蛋白片段对balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的gfap抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下注射方法免疫6-8周龄balb/c小鼠，免疫剂量为30μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为30μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；骨髓瘤细胞与小鼠脾淋巴细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培养基终止液及其余终止液，离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀，mc定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用gfap纯化重组蛋白进行elisa测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定elisa值，挑取od280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为umab129。

4、无血清培养上清单抗的制备与纯化：单克隆抗体杂交瘤细胞株在转瓶中扩大培养，当细胞上清体积扩培到任务量及细胞死亡率达到60％-70％时，收取细胞悬液6000prm高速离心20min，用0.45um的滤膜过滤，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株umab129产生的单抗为igg1，采用proteing进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、wb检测、分装、冻存在-20℃。其中wb检测结果见图4-7。

由图4结果可见，umab129能够很好的识别gfap全长蛋白；由图5结果可见，umab129识别snb19人胶质母细胞瘤细胞中的内源gfap蛋白；由图6-7结果可见，umab129特异识别人及小鼠组织中的内源gfap蛋白，分子量与预期分子量大小一致，表明单克隆抗体umab129能特异地westernblot检测完整的gfap蛋白。

实施例4、单克隆抗体umab129为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、取福尔马林固定的成人脑组织，人胚胎大脑皮层组织与人胚胎小脑组织进行石蜡包埋，使用finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次。

3、加入抗原修复液(0.01m，ph6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(pbs+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入gfap单抗(umab129)，稀释比：1:100，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。pbst(0.02％tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加polink-试剂盒2(catlogno.d37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用pbs洗涤3次，每次5min。滴加polink-2试剂盒(catlogno.d37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用pbs洗涤3次，每次5min。

8、应用dab溶液(中杉金桥zli-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图8-10。

(2)、实验结果：

由图8-10结果可见，在成人脑组织，人胚胎大脑皮层组织与人胚胎小脑组织中可见到特异性胞质染色。结果与gfap在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体umab129可用于免疫组织化学检测gfap蛋白的水平。

实施例5、单克隆抗体umab129为一抗的免疫荧光检测

1)、实验方法：

1、细胞铺版：取体外培养的大鼠原代神经元细胞平铺到24孔板中，放置培养箱培养24小时。

2、去除培养基，用预热的pbs洗涤一次，制作细胞单层培养物。

3、固定：4％的多聚甲醛(pbs配制)室温固定10分钟。

4、去除固定液，pbs洗涤3次。

5、穿透：室温下用0.1％triton-x-100(pbs配制)穿透打孔5分钟，pbs洗涤3次。

6、加上封闭液(pbs+2％bsa)，37℃孵育60分钟。

7、加入gfap单抗(umab129)，稀释比：1:100，使用封闭液进行稀释，37℃孵育60分钟。pbs洗涤3次。

8、加入alexa-488affinipuregoatanti-mouseigg(h+l)，稀释比：1:500，使用封闭液进行稀释，室温避光孵育60分钟。pbs洗涤3次。

9、dapi(hh3342)复染细胞核3分钟，镜检。

结果如图11所示，在大鼠原代神经元细胞中可见到特异性胞质染色，表明单克隆抗体umab129可用于免疫荧光检测gfap蛋白的水平。

<110>无锡傲锐东源生物科技有限公司

<120>抗gfap蛋白单克隆抗体及其用途

<210>1

<211>1299

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<211>432

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

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61gfketraseraemmelndrfasyiekvrfleqqnkalaaelnqlrakeptkladvyqael

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