本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种斑鰶微卫星富集文库的构建方法。
技术背景
斑鰶(konosiruspunctatus)隶属鲱形目(clupeiformes)、鲱科(clupeidae)、鰶亚科(dorosomatinae)、斑鰶属(konosirus)，为沿海暖水性中上层鱼类，广泛分布于中国、朝鲜、韩国以及日本沿海，在我国渤海、黄海、东海、南海均有产出，是中国、日本和朝鲜半岛近海渔业的重要捕捞对象。斑鰶对沿海生态系统的沉积物再悬浮以及水-底界面的物质交换有着重要意义；同时又是多种高营养级鱼类的捕食对象，在海洋食物网结构中扮演着承上启下的关键角色。同时，因其含肉率高、肉质细嫩、味道鲜美，是备受青睐的优质水产品之一，近年来人们对斑鰶的需求量也在稳步增长。
近年来，由于受过度捕捞及其他人类活动等因素的影响，我国斑鰶资源个体低龄化、小型化的趋势明显，中国沿海的斑鰶渔业资源正面临全面衰退的严峻现状。因此，有必要继续开发斑鰶的微卫星分子标记，以较高的分辨率解析其群体遗传结构和遗传多样性水平，以便更好的保护利用和合理开发这一重要的海洋渔业资源。
微卫星是当今种群遗传与进化研究中应用最为广泛的分子遗传标记之一，但由于微卫星标记具有物种特异性，故针对任一物种的微卫星研究，必须首先获知该物种的微卫星dna序列，即进行位点筛选。微卫星位点筛选及其引物的获得是微卫星标记研究的第一步，也是最为关键、耗时而复杂的一步。众多研究迟迟不能开展最主要的一个原因就是早期筛选微卫星标记的投入时间及成本相对较大，且获得的可用标记较少。通常，微卫星位点筛选策略主要有以下四种：一是构建小插入片段基因组文库的传统经典方法；二是构建微卫星富集文库筛选微卫星标记；三是从公共数据库中筛选微卫星位点；四是利用近缘物种间引物的通用性，从而获得目的物种的微卫星引物。传统经典方法微卫星阳性克隆率低，在节肢动物中通常为2％左右，而利用公共数据库进行微卫星位点筛选，往往仅限于dna数据较多的一些模式生物。此外，直接利用近缘物种的微卫星引物，位点的多态性往往不好，甚至有时扩增出来的根本不是微卫星dna序列，从而影响结果的准确性。微卫星标记具有高度的多态性和丰富的信息含量、共显性遗传、稳定性高、反应所需模板量少和重复性好等优点，非常适合于群体遗传学研究。
现有技术如授权公告号为cn102174714b的中国发明专利，公开了一种柑橘全爪螨微卫星富集文库的构建方法，采用磁珠富集法，集成已报道的微卫星位点筛选策略，通过基因组dna提取、酶切、接头连接、磁珠富集及文库构建等一系列步骤，建立柑橘全爪螨微卫星富集文库；然而，该方法具有限制性地适合于开发微小昆虫及螨类的微卫星标记，且目标dna获取纯度低，pcr扩增的反应敏感度不高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种斑鰶微卫星富集文库的构建方法，并开发可用于斑鰶遗传多样性检测、种群遗传结构分析和亲权鉴定等研究的微卫星标记；该方法具有简单、高效、成本低、微卫星标记筛选准确度和获取效率高、pcr反应成功率高等优点。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种斑鰶微卫星富集文库的构建方法，包括以下步骤：
酶切：从斑鰶肌肉或鳍条组织中提取基因组dna，采用rsai或msei对斑鰶基因组dna进行酶切；
接头溶液制备：将接头spli-a：5’-gtgactgcaggcgtgtgctcttcacga-3’和接头spli-b：5’-po4-gtgactggagttccgacgtcttcacag-3’分别制成10μm的水溶液，等体积混合，得接头溶液，该接头pcr扩增效率高，不互相干扰，也不会对待扩增微卫星引物产生干扰；
接头连接：将酶切片段与接头溶液混合，从而得到接头-酶切dna连接产物；
连接产物pcr扩增：以连接产物为模板，进行pcr反应，其中pcr扩增反应液包含1.5-5μlbsa，1-3.5μl浓度为10μm的引物，10-15μlpcrmix，5-8μl双蒸水，1-2μl连接产物，该条件下，pcr反应的扩增体积少，多种成分预先混合，大大简化了加样步骤，提高了文库构建的效率；
磁珠富集：将连接产物的pcr扩增产物与生物素探针杂交，接着将杂交产物与包被有链霉素的磁珠混合，接着洗脱磁珠表面的富集片段，以洗脱片段为模板进行pcr扩增反应；
文库构建：将洗脱片段的pcr扩增产物与克隆载体pmd19-t相连接，然后转入大肠杆菌感受态细胞，构建鰶微微卫星富集片段的克隆文库。
优选地，提取基因组dna过程，加入环状dna和甲壳质，并采用冻融循环技术处理。
更优选地，环状dna为高纯度的细菌质粒dna；可根据需要选用不同大小的环状dna，只要所加环状dna与所构建的目标dna文库能够有效分离即可；冷冻的温度为-196至-20℃，融化的温度为40-70℃；环状dna和甲壳质的特殊存在，一方面能够促进斑鰶组织细胞中水分子与非离子表面活性剂结合，发生水合作用，从而对斑鰶组织细胞蛋白质表层的水化膜构成破坏，致使蛋白质易于聚集形成沉淀，同时由于其存在能够降低提取液i的介电常数，增加被提取斑鰶组织细胞中相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀，有效提高了斑鰶组织细胞蛋白质的脱除率，提高了被提取组织dna的纯度；另一方面，当样品中混有大量微生物(或其他异种生物)基因组污染，环状dna和甲壳质具有识别污染并破坏其结构的功效，使得提取目标dna可不受干扰地进行后续的建库，因而微卫星标记筛选准确度高、获取效率高。
优选地，酶切反应体系为：1-5μlneb10×连接缓冲液，0.1-0.5μl100×bsa，0.1-0.5μl5mnacl溶液，1-2μl限制性内切酶，10-30μl浓度为100ng/μl的基因组dna，该条件下，内切酶稳定性好，星号活性低，且所获得的dna片段主要分布范围为100-1500bp，达到了构建斑鰶微卫星富集文库的要求。
优选地，在配置pcr扩增反应液过程中加入甲壳质流体，甲壳质的质量百分比为0.01％～0.5％，溶剂为l-氨基酸乙酯，甲壳质流体的特殊存在，对dna具有极强的吸附力，能够提高pcr成功率，同时甲壳质流体是由许多微小球体组成，可以包裹反应体系，使pcr扩增反应在一个个微小的独立空间完成，从而提高pcr扩增的反应敏感度，使反应更加充分，提高微量dna的pcr扩增效果；此外，甲壳质流体能提高反应体系的沸点使体系缓冲液不易蒸发，降低了pcr扩增过程中试剂的用量，从而降低了构建成本。
优选地，pcr反应条件为：90-100℃变性10s，55-70℃退火30s，50-80℃延伸30s，进行15-20个循环，最后50-80℃延伸5min。该条件下，模板dna解链完全，引物与模板复性效果好，能够显著提高pcr扩增的效率。
优选地，磁珠富集过程中杂交反应液体系为：10-30μl2×hybsolution，5-15μl生物素标记的dna探针tg12溶液，5-10μl连接dna片段，2-8μl双蒸水。该条件下，生物素标记的dna探针与dna片段的互补程度高，提高了包被有链霉素的磁珠对杂交产物的吸附，从而避免了dna片段的浪费，降低了成本。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明在提取目标基因组dna时加入环状dna和甲壳质，能够提高获取dna的纯度，以及识别目标dna中污染物并破坏其结构，从而有利于提取目标dna可不受干扰地进行后续的建库；2)所采取的杂交反应液中生物素标记的dna探针与dna片段的互补程度高，提高了包被有链霉素的磁珠对杂交产物的吸附；3)在pcr扩增反应液中加入甲壳质流体，能够有效提高pcr扩增效果，同时降低构建成本。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种斑鰶微卫星富集文库的构建方法，包括以下步骤：
1)酶切：从斑鰶肌肉或鳍条组织中提取基因组dna，使用限制性内切酶msei对斑鰶基因组dna进行酶切，酶切反应体系为：1.5μlneb10×连接缓冲液，0.1μl100×bsa，0.1μl5mnacl溶液，1μl限制性内切酶msei，10μl浓度为100ng/μl的基因组dna；
提取基因组dna步骤为：将斑鰶肌肉或鳍条组织样品剪碎，置于提取液i：70ml浓度为120mm的tris-hcl和磷酸氢二钠，0.3g脂肪醇醚硫酸铵，30ml浓度为120mm的氯化钠溶液；加入0.5μg质粒dna和0.1μg甲壳质，冻融2-3次，冷冻的温度为-126℃，融化的温度为45℃，离心，收集上清液后加入提取液ii：10ml浓度为100mm的tris-hcl和磷酸氢二钠和30ml浓度为0.5ppm的阳离子聚丙烯酰胺，颠倒混匀后，离心产生白色沉淀，洗涤沉淀得dna样品，待用；环状dna和甲壳质的特殊存在，一方面能够促进斑鰶组织细胞中水分子与非离子表面活性剂结合，发生水合作用，从而对斑鰶组织细胞蛋白质表层的水化膜构成破坏，致使蛋白质易于聚集形成沉淀，同时由于其存在能够降低提取液i的介电常数，增加被提取斑鰶组织细胞中相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀，有效提高了斑鰶组织细胞蛋白质的脱除率，提高了被提取组织dna的纯度；另一方面，当样品中混有大量微生物(或其他异种生物)基因组污染，环状dna和甲壳质具有识别污染并破坏其结构的功效，使得提取目标dna可不受干扰地进行后续的建库，因而微卫星标记筛选准确度高、获取效率高；
2)接头溶液制备：将合成的接头spli-a：5’-gtgactgcaggcgtgtgctcttcacga-3’和接头spli-b：5’-po4-gtgactggagttccgacgtcttcacag-3’分别制成10μm的水溶液，然后各取50μl混合，加入2μl5mnacl溶液，95℃反应5min；之后缓慢降至室温，4℃静置3h，-20℃冷冻保存；
3)接头连接：将酶切片段与制备好的接头混合均匀，16℃过夜孵育8小时以上进行连接，其中连接反应液体系为：7μl接头序列溶液，1μl10×连接缓冲液，2μldna连接酶，20μl酶切dna产物；
4)连接产物pcr扩增：以连接产物为模板，以和接头spli-a序列互补的序列为引物，进行pcr反应，其中pcr反应体系为：1.5μlbsa，1.3μl浓度为10μm的引物，10μlpcrmix，5μl双蒸水，5μl质量浓度为0.3％的甲壳质流体，2μl连接产物；pcr反应条件为：90℃变性10s，60℃退火30s，55℃延伸30s，进行16个循环，最后55℃延伸5min；甲壳质流体的特殊存在，对dna具有极强的吸附力，能够提高pcr成功率，同时甲壳质流体是由许多微小球体组成，可以包裹反应体系，使pcr扩增反应在一个个微小的独立空间完成，从而提高pcr扩增的反应敏感度，使反应更加充分，提高微量dna的pcr扩增效果；此外，甲壳质流体能提高反应体系的沸点使体系缓冲液不易蒸发，降低了pcr扩增过程中试剂的用量，从而降低了构建成本。
5)磁珠富集，包括如下步骤：
a1.连接产物的pcr扩增产物与生物素探针杂交：首先将合成的生物素标记探针(本研究所用的探针为(tg)12)配成溶液，杂交反应液体系为：25μl2×hybsolution，10μl生物素标记的dna探针(tg)12溶液，10μl连接dna片段，5μl双蒸水；杂交反应条件为：首先95℃持续5min，然后迅速降至70℃，后面每个循环(5s)依次降低0.2℃，直到50℃，共100个循环，接着50℃持续10min，然后每个循环每5s依次减低0.5℃，直到40℃，共20个循环；
a2.磁珠预处理：将250μlte溶液和50μl链霉亲和素包被的磁珠加入到1.5ml离心管中，上下颠倒2min清洗磁珠，然后将离心管放在磁珠分离架上约1min，将上清液吸去，重复上述步骤：te溶液1次，1×hybsolution两次，将清洗好的磁珠置于150μl2×hybsolution中；
a3.磁珠富集：将杂交产物加入经过预处理的磁珠溶液中，混匀，室温放置1h，期间轻柔颠倒离心管使磁珠均匀悬浮；
a4.磁珠洗涤：洗涤分两个阶段进行：首先是松弛性洗涤：将悬浮均匀的磁珠液放置于磁性分离架上，静置1min，将上清液小心吸除，然后加入400μl洗脱液a(2×ssc0.1％sds)，轻柔颠倒混匀5min，重复上述步骤3次(可用计数器计数)，然后进行严谨性洗涤；接着是严谨性洗涤：加入400μl严谨性洗脱液b(1×ssc0.1％sds)，轻柔颠倒混匀5min，后将磁珠液放置于磁性分离架上，静置1min，将上清液小心吸除，重复上述步骤3次；
a5.富集片段洗脱：第一次洗脱：向洗涤好的磁珠中加入200μltle缓冲液，混匀。95℃水浴加热5min，用磁性分离架迅速分离出上清液，小心吸取上清液，转移至另一1.5ml离心管中，该上清液为第一次洗脱液；第二次洗脱：向磁珠中加入12μl0.15mmol/l的naoh溶液，混匀，放置20min，期间轻柔混匀，之后用磁性分离架迅速分离出上清液，转移上清液至另一1.5ml离心管中，然后在上清液中加入1.8μl1mmol/l的hcl溶液和36.2μlte缓冲液，使体积补足为50μl，该溶液为第二次洗脱液；
a6.洗脱片段扩增：以两次洗脱产物为底物，互补接头序列spli-a为引物，pcr扩增体系为：2.5μlbsa，1.3μl浓度为10μm的互补接头序列spli-a，12.5μlpcrmix，6.7μl双蒸水，6μl质量浓度为0.3％的甲壳质流体，2μl洗脱dna片段；pcr反应程序为：98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，进行18个循环，最后72℃延伸5min；
6)二次富集：从琼脂糖凝胶电泳结果中，选取扩增亮度和片段大小合适的扩增产物作为模板，重复上述步骤，进行第二次富集，以提高微卫星片段的富集效率；
7)洗脱片段扩增产物纯化：使用dna纯化试剂盒(takaraminibest)，参照该试剂盒使用说明书进行操作，对第二次富集所得到的洗脱片段扩增产物进行纯化，获得的产物放置于4℃保存；
8)文库构建：将洗脱片段的pcr扩增产物与克隆载体pmd19-t相连接，然后转入大肠杆菌感受态细胞，构建斑鰶微卫星富集片段的克隆文库。
实施例2：
一种斑鰶微卫星富集文库的构建方法，包括以下步骤：
1)酶切：从斑鰶肌肉或鳍条组织中提取基因组dna，使用限制性内切酶msei对斑鰶基因组dna进行酶切，酶切反应体系为：2.5μlneb10×连接缓冲液，0.25μl100×bsa，0.25μl5mnacl溶液，1μl限制性内切酶msei，20μl浓度为100ng/μl的基因组dna；
提取基因组dna步骤为：将斑鰶肌肉或鳍条组织样品剪碎，置于提取液i：70ml浓度为120mm的tris-hcl和磷酸氢二钠，0.3g脂肪醇醚硫酸铵，30ml浓度为120mm的氯化钠溶液；加入0.5μg质粒dna和0.1μg甲壳质，冻融2-3次，冷冻的温度为-166℃，融化的温度为50℃，离心，收集上清液后加入提取液ii：10ml浓度为100mm的tris-hcl和磷酸氢二钠和30ml浓度为0.5ppm的阳离子聚丙烯酰胺，颠倒混匀后，离心产生白色沉淀，洗涤沉淀得dna样品，待用；
2)接头溶液制备：将合成的接头spli-a：5’-gtgactgcaggcgtgtgctcttcacga-3’和接头spli-b：5’-po4-gtgactggagttccgacgtcttcacag-3’分别制成10μm的水溶液，然后各取50μl混合，加入2μl5mnacl溶液，95℃反应5min；之后缓慢降至室温，4℃静置3h，-20℃冷冻保存；
3)接头连接：将酶切片段与制备好的接头混合均匀，16℃过夜孵育8小时以上进行连接，其中连接反应液体系为：7μl接头序列溶液，1μl10×连接缓冲液，2μldna连接酶，20μl酶切dna产物；
4)连接产物pcr扩增：以连接产物为模板，以和接头spli-a序列互补的序列为引物，进行pcr反应，其中pcr反应体系为：2.5μlbsa，1.3μl浓度为10μm的引物，12.5μlpcrmix，6.7μl双蒸水，6μl质量浓度为0.3％的甲壳质流体，2μl连接产物；pcr反应条件为：98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，进行18个循环，最后72℃延伸5min；
5)磁珠富集：将连接产物的pcr扩增产物与生物素探针杂交，接着将杂交产物与包被有链霉素的磁珠混合，接着洗脱磁珠表面的富集片段，以洗脱产物为底物，互补接头序列spli-a为引物，pcr扩增体系为：2.5μlbsa，1.3μl浓度为10μm的互补接头序列supersnx-24，12.5μlpcrmix，6.7μl双蒸水，6μl质量浓度为0.3％的甲壳质流体，2μl洗脱dna片段；pcr反应程序为：98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，进行18个循环，最后72℃延伸5min；pcr反应结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳对产量产物长度分布范围进行检测；
6)二次富集：从琼脂糖凝胶电泳结果中，选取扩增亮度和片段大小合适的扩增产物作为模板，重复上述步骤，进行第二次富集，以提高微卫星片段的富集效率；
7)洗脱片段扩增产物纯化：使用dna纯化试剂盒(takaraminibest)，参照该试剂盒使用说明书进行操作，对第二次富集所得到的洗脱片段扩增产物进行纯化，获得的产物放置于4℃保存；
8)文库构建：将洗脱片段的pcr扩增产物与克隆载体pmd19-t相连接，然后转入大肠杆菌感受态细胞，构建斑鰶微卫星富集片段的克隆文库。
对比例1：
提取基因组dna过程中不加入环状dna和甲壳质，其余部分和实施例2完全一致；基于此过程获取的斑鰶微卫星标记密度较低，说明加入环状dna和甲壳质能有效提高提取dna的完整度，提高斑鰶微卫星标记筛选密度。
对比例2：
pcr扩增反应液中不加入甲壳质流体，其余部分和实施例2完全一致；基于此过程的pcr反应成功率降低，表明甲壳质流体的特殊存在能够提高pcr扩增的反应敏感度。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。