一种对铬III裸眼检测的螺吡喃衍生物探针的合成及其应用的制作方法

本发明属于生物探针材料的制备及其应用技术领域，具体涉及一种对铬iii裸眼检测的螺吡喃衍生物探针的合成及其应用，该生物探针以苯并咪唑作为识别基团，可以对水中铬离子（iii）进行裸眼检测。

背景技术：

近些年来，重金属污染问题受到人们的高度关注，因此设计和研究高灵敏度、高选择性的重金属离子荧光探针，成为了荧光探针研究领域中一个重点和热门方向。

螺吡喃是一种新型的光致变色有机化合物，它可以在紫外光或者加热条件下，可以从闭环无荧光结构异构化成为开环部花菁发荧光结构。近年来，国内外课题组相继报道了一系列在n原子或者7-位上引入金属离子识别基团的螺吡喃衍生物荧光探针。

sakamoto课题组把冠醚接到了螺吡喃的7-位上，得到了一类可以和碱金属作用诱导螺吡喃开环的荧光探针，他们发现紫外线可以加速碱金属离子对该类螺吡喃化合物的诱导开环作用（anal.chem.77（2005）1999-2006.）。邵娜课题组在螺吡喃化合物的7-位上引入了一系列不同的氨基化合物，得到了可以和锌离子和铜离子选择性作用的探针（angew.chem.45（2006）4944-4948.）。这些文献都是报道了在螺吡喃化合物的7-位上引入金属离子识别基团，很少有在5-位上引入金属离子识别基团的，他们的相关结构设计出发点都是金属离子与开环结构氧原子的配位来实现半花菁开环结构的形成，也就是围绕氧原子的配位来设计的，这使得金属离子诱导螺吡喃开环体系因为机理的单一性使得该种体系的发展受到了极大的限制。因此在5-位上引入金属离子识别基团具有很强的创新性和实际应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种对铬iii裸眼检测的螺吡喃衍生物探针的合成及其应用，可以检测水溶液中铬离子的螺吡喃衍生物探针，该探针是利用苯并咪唑作为铬离子识别基团，半花菁作为荧光基团，通过氨基连接而成；铬离子的识别是通过和苯并咪唑络合配位，从而诱导螺吡喃c-o键断裂，开环发荧光实现的。

本发明由如下技术方案实现的：一种对铬iii裸眼检测的螺吡喃衍生物探针，该探针化合物结构式为：，简写为sp。

制备所述的对铬iii裸眼检测的螺吡喃衍生物探针的方法，半花菁与溴乙烷在乙腈溶剂中加热回流，生成深红色固体，深红色固体在碱的作用下生成黄色油状液体，油状液体与5-硝基水杨醛在乙醇中加热回流发生成环反应生成螺吡喃硝基衍生物，螺吡喃硝基衍生物在氯化亚锡和乙酸的作用下还原成螺吡喃氨基衍生物，螺吡喃氨基衍生物与两倍量的2-氯甲基苯并咪唑在碳酸钾与碘化钾的作用下，氨基上的两个氢被苯并咪唑环取代，生成具有两个苯并咪唑环的螺吡喃衍生物sp。

具体步骤如下：

（1）深红色固体的合成：0.02mol溴乙烷和0.02mol半花菁加入43ml乙腈中，在85℃条件下加热回流24小时，反应完成后，冰水浴中冷却至室温，抽滤得到粉色固体，用冷冻过的乙醚洗涤3次，得到深红色的固体；

（2）黄色油状液体的合成：0.006mol深红色的固体加入1m氢氧化钠水溶液中，25℃下搅拌10分钟，反应后溶液用10ml乙醚萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，蒸发浓缩得到黄色油状液体；

（3）螺吡喃硝基衍生物的合成：0.0047mol黄色油状液体和0.007mol的5-硝基水杨醛加入到50ml乙醇中，在80℃条件下搅拌加热回流24小时，反应完后在冰水浴中冷却至室温，抽滤得到紫红色固体，用冷冻后的乙醇洗涤3次，得到暗红色的固体，即为螺吡喃硝基衍生物；

（4）螺吡喃氨基衍生物的合成：0.0034mol螺吡喃硝基衍生物和0.0138mol氯化亚锡加入40ml乙醇中，再加入3滴乙酸，氮气保护条件下搅拌回流3小时，反应结束后，未反应完的氯化亚锡过滤除去，往过滤残渣中加入5%的氢氧化钠50ml，用25ml三氯甲烷萃取三次，最终合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，过滤后蒸发浓缩，用硅胶柱纯化得到黄色油状液体即螺吡喃氨基衍生物；

（5）sp的合成：0.0021mol螺吡喃氨基衍生物和0.0064mol碳酸钠溶解在10ml乙腈中，于冰水浴中加入0.0053mol2-氯甲基苯并咪唑，搅拌等待10分钟，然后升温至室温，在室温下搅拌30分钟，最后升温至85℃加热回流24小时，反应结束后加入水溶解未反应完的碳酸钠，用30ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，最后蒸发浓缩得到黑色油状液体，然后用硅胶柱纯化得到翠绿色固体，即为sp。

步骤（4）中柱纯化的洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚v/v为1:4。步骤（5）中柱纯化的洗脱剂为乙酸乙酯：石油醚：甲醇v/v/v为50:25:1。

该荧光探针在cr³⁺的检测过程中的应用。

本发明中所制备探针sp能够对铬离子进行选择性检测，从探针与不同金属离子作用后溶液的紫外光谱图可以看出，只有探针与铬离子结合后其紫外光谱的变化最为明显，从溶液颜色变化来看，也只有铬离子与探针的溶液的颜色由无色变为明显的红色。

附图说明

图1为化合物5螺吡喃硝基衍生物的核磁氢谱图；图2为化合物6螺吡喃氨基衍生物的核磁氢谱图；图3为化合物sp的核磁氢谱图；图4为化合物sp的核磁碳谱图；图5为探针和金属离子选择性作用的紫外-可见(uv-vis)吸收光谱；图6为探针分子与铬离子作用的选择性结果图（铬离子1eq，其他金属离子10eq）；图7为铬离子滴定探针分子溶液的紫外-可见(uv-vis)吸收光谱图；图8为铬离子滴定探针分子溶液的荧光发射光谱图；图9为不同ph值对探针影响的紫外-可见(uv-vis)吸收光谱图；图10为探针分子和铬离子作用的检出限；图11为化合物3黄色油状液体的合成路线图；图12为化合物5螺吡喃硝基衍生物的合成路线图；图13化合物6为螺吡喃氨基衍生物的合成路线图；图14为化合物6合成sp的路线图。

具体实施方式

一种对铬iii裸眼检测的螺吡喃衍生物探针，该探针化合物结构式为：，简写为sp。

制备所述的对铬iii裸眼检测的螺吡喃衍生物探针的方法，半花菁与溴乙烷在乙腈溶剂中加热回流，生成深红色固体，深红色固体在碱的作用下生成黄色油状液体，油状液体与5-硝基水杨醛在乙醇中加热回流发生成环反应生成螺吡喃硝基衍生物，螺吡喃硝基衍生物在氯化亚锡和乙酸的作用下还原成螺吡喃氨基衍生物，螺吡喃氨基衍生物与两倍量的2-氯甲基苯并咪唑在碳酸钾与碘化钾的作用下，氨基上的两个氢被苯并咪唑环取代，生成具有两个苯并咪唑环的螺吡喃衍生物sp。具体步骤如下：

（1）深红色固体的合成：把溴乙烷（2.2克，0.02mol）和半花菁（3.2克，0.02mol）加入43ml乙腈中，在85度条件下加热回流24小时，待反应完后，放在冰水浴中快速冷却至室温，抽滤得到粉色固体。用冷冻过的乙醚洗涤3次，得到深红色的固体，即化合物2；

（2）黄色油状液体的合成：把化合物2（1.65克，0.006mol）加入30ml（1m）氢氧化钠水溶液中，25度下搅拌10分钟，反应后溶液用10ml乙醚萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，再蒸发浓缩得到黄色油状液体，即化合物3；

（3）螺吡喃硝基衍生物的合成：把化合物3（0.9克，0.0047mol）和5-硝基水杨醛即化合物4（1.17克，0.007mol）加入50ml乙醇中，在80度条件下搅拌加热回流24小时，反应完后在冰水浴中快速冷却至室温，抽滤得到紫红色固体，用冷冻后的乙醇洗涤3次，得到暗红色的固体螺吡喃硝基衍生物，即化合物5。¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.01(m,2h),7.19(td,j=7.7,1.2hz,1h),7.09(d,j=6.5hz,1h),6.84~6.91(m,2h),6.74(d,j=8.6hz,1h),6.58(d,j=7.8hz,1h),5.85(d,j=10.4hz,1h),3.18–3.35(m,2h),1.28(s,3h),1.14-1.20(m,6h).

（4）化合物6的合成：把化合物5（1.16克，0.0034mol）和氯化亚锡（3.11克，0.0138mol）加入40ml乙醇中，再加入3滴乙酸，氮气保护条件下搅拌回流3小时，反应结束后，未反应完的氯化亚锡通过过滤除去，往过滤残渣中加入50ml5%的氢氧化钠，用25ml三氯甲烷萃取三次，最终合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，过滤后蒸发浓缩，用硅胶柱纯化得到黄色油状液体螺吡喃氨基衍生物，即化合物6，其中洗脱剂乙酸乙酯：石油醚1:4v/v。¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.14(t,j=7.5hz,1h),7.10-7.00(m,2h),6.78(t,j=7.4hz,1h),6.71(d,j=10.0hz,1h),6.52(d,j=7.8hz,2h),6.47(d,j=8.4hz,1h),5.66(d,j=10.1hz,2h),3.34-3.31(m,1h),3.16(dd,j=14.7,7.0hz,1h),1.28(s,3h),1.16(dd,j=14.2,7.2hz,3h),1.13(s,3h).

（5）sp的合成：把化合物6（0.65克，0.0021mol）和碳酸钠（0.65克，0.0064mol）溶解在10ml乙腈中，再把2-氯甲基苯并咪唑即化合物7（0.88克，0.0053mol）于冰水浴中加入，搅拌等待10分钟，然后升温至室温，在室温下搅拌30分钟，最后升温至85度加热回流24小时，反应结束后加入水溶解未反应完的碳酸钠，用30ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，最后蒸发浓缩得到黑色油状液体。用硅胶柱纯化得到翠绿色固体sp，其中洗脱剂乙酸乙酯：石油醚：甲醇50:25:1v/v/v。¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.43(s,2h),7.27(d,j=9.5hz,4h),7.13(s,4h),7.03(s,2h),6.78(s,1h),6.53(s,1h),6.44(s,1h),6.38(s,2h),5.54(t,j=8.7hz,1h),4.70(s,2h),4.52(s,2h),3.19(dt,j=20.9,6.7hz,1h),3.03(s,1h),1.23(s,3h),1.20-1.12(m,3h),1.07(s,3h).

实验例1：探针母液和相关金属离子溶液的配制

取11.34毫克的探针分子sp，溶解于10ml的dmso中，配制成浓度为2mm的母液。用二次蒸馏水配制金属离子溶液，浓度均为100mm。金属离子溶液包括如下：氯化铬溶液，硫酸锰溶液，氯化亚铁溶液，氯化钴溶液，氯化镍溶液，氯化铜溶液，氯化锌溶液，硝酸银溶液，氯化汞溶液，硫酸镉溶液。

实验例2：探针分子对cr³⁺在紫外-可见(uv-vis)吸收光谱中的选择性（图5和图6）

先取探针分子的母液（2mm）用乙醇溶液(蒸馏水：乙醇1:1(v/v))把浓度稀释至60um，取2ml稀释后的探针分子的溶液测量紫外-可见(uv-vis)吸收光谱。

取2毫升浓度为60um的探针分子8溶液于比色皿中，测量其紫外-可见(uv-vis)吸收光谱，随后分别加入浓度为100mm的各类金属离子溶液（氯化铬溶液，硫酸锰溶液，氯化亚铁溶液，氯化钴溶液，氯化镍溶液，氯化铜溶液，氯化锌溶液，硝酸银溶液，氯化汞溶液，硫酸镉溶液。），使溶液中探针分子8：金属离子=1:1，等待5分钟，再次测量紫外-可见吸收光谱，测量结果表明，探针8的主要吸收峰有2个，第一个是在240nm左右的近紫外区，第二个是在275nm左右。加入金属离子以后可以发现，吸收光谱发生了明显变化，近紫外区275nm的峰不断下降，而400nm左右出现了一个新的宽峰，这个峰随着金属离子浓度的提高而不断增强。其中铬离子对探针的响应最为明显，其他金属离子响应比较微弱。说明探针对铬离子有较好的选择性。

实验例3：铬离子滴定探针分子溶液的光谱研究

取2ml浓度为60m探针分子8的溶液于比色皿中，测量其紫外-可见(uv-vis)吸收光谱。此后，测量铬离子滴定探针分子8过程中的紫外-可见吸收光谱变化，每次滴入6ul的氯化铬溶液（20mm），使得最终铬离子浓度达到探针分子8浓度的1.5倍当量，每次滴加过程中铬离子的总浓度分别为6，12，18，24，32，36，42，48，54，60，66，72，78，84，90um。测量结果显示探针分子8的紫外-可见吸收峰变化主要是在400nm左右，滴入铬离子后，其总浓度的不断增大，导致吸收光谱发生变化，400nm处的峰吸收强度不断增强，当铬离子总浓度达到60um时，吸收峰变化基本达到最大值。如图7中照片所示，我们也可以观察到向探针加入铬离子前后颜色变化十分明显，由无色变为浅红色，这可以从紫外-可见吸收光谱的变化解释，当加入铬离子后，近紫外区的吸收峰减弱，而可见光区吸收峰急剧增强，这就是由无色变浅红色的原因。

实验例4：ph值对探针影响的紫外-可见(uv-vis)吸收光谱研究

首先配制ph为4，5,6,7,8,9,10的pb缓冲溶液，取60微升的探针分子8的母液于比色皿中，另取940微升无水乙醇和1000微升各个ph值的缓冲溶剂，搅拌均匀后，等待5分钟测量紫外-可见(uv-vis)吸收光谱变化。测量结果表明在酸性条件下（ph4，5，6），探针分子8的测量紫外-可见吸收光谱主要出现了两个峰的变化，第一个峰变化是在近紫外区275nm，第二个峰变化是在400nm，随着酸性的不断增强，近紫外区275nm的峰不断下降，而400nm的峰进一步增强，当ph值等于4的时候400nm的峰增加到最强，同时也可以发现溶液的颜色在不断加深变红。颜色变化可以通过紫外-可见吸收光谱进行解释说明，当ph值等于7时，400nm不存在峰，而当ph值不断下降时，400nm（可见光区域）的吸收峰不断增加，我们推测探针分子8在酸性条件下异构化成为开环部花菁，这也就是溶液变红的原因。经紫外-可见吸收光谱发现，探针分子8在酸性环境中不稳定，在中性或碱性环境中稳定，探究出ph值为7时，是最佳测量条件。

实验例5：探针分子和铬离子作用的检出限

取2毫升浓度为60um探针分子8的溶液于比色皿中，测量探针分子8的紫外-可见(uv-vis)吸收光谱。连续测量10次，求历次测量结果中390nm处紫外-可见(uv-vis)吸收光谱吸收强度的标准偏差（经计算=0.001401）。此外，在之前的探针分子8和铬离子的紫外-可见(uv-vis)吸收光谱滴定实验中测量了铬离子从0-60um范围内连续变化的紫外-可见吸收光谱，现以铬离子浓度为横坐标，以紫外-可见(uv-vis)吸收强度为纵坐标，绘制如图10所示的曲线图，我们发现当铬离子浓度处于6-30um范围内时，紫外-可见(uv-vis)吸收强度与铬离子浓度之间存在很好的线性相关关系，经过origin线性方程拟合后，得线性方程为a=0.0065[cr3+]+0.0567，发现线性相关系数为r2=0.9932。再根据检出限的计算公式：cdl=3σ/k。（k为之前拟合得到的直线斜率，σ为探针分子8溶液的标准偏差，两者前面都已经通过计算得到），因此，探针分子6的检出限为0.65um，检出限低于大多数报道过的类似探针。