一种用于鉴别西洋参的DNA杂交方法与流程

本发明涉及一种用于鉴别西洋参的dna杂交方法。
背景技术：
：中药材人参在分类学上,属于plantae(植物界)，apiales(伞形目)，araliaceae(五加科)，aralioideae(人参亚科)，panax(人参属)。人参属下有三个主要的种分类：panaxginseng(亚洲参/中国人参)，panaxnotoginseng(三七)和panaxquinquefolius(西洋参)。虽然中国人参、三七和西洋参起源于同一属，但三种中药材的用途和性质有不同。如中国人参并不会影响华法林(warfarin)药物的效果，但是西洋参可以显著影响华法林的抗凝血活性性质。由于中国人参、三七和西洋参功效各异、价值相差大，对西洋参快速鉴别的技术和手段对于保护消费者权益显得十分重要。然而三七、中国人参和西洋参三种中药材在外观形态学和化学指纹图谱上都极度相似，鉴别西洋参至今仍然是一个十分大的挑战。基于人参属基因组达玛烯二醇合酶(dammarenediolsynthase)基因的单核苷酸多态性建立的dna条形码技术，为准确鉴别西洋参提供了一种新方法。但是现在用于鉴别西洋参的dna条形码技术，步骤都会包括形成pcr产物和序列鉴别2步，并且都涉及凝胶电泳分离(gelelectrophoreticseparation)，过程涉及电场作用及特殊染色，需要花费大量时间和操作技术上的成本，快速鉴别西洋参的需求仍然无法满足，因此需要提供一种快速鉴别西洋参的技术。微流控芯片，是一种操控流体在微小通道中流动的系统，能够大幅减少样品消耗，减少样品处理时间，提高检测分辨率/灵敏度，在疾病诊断、药物筛选、环境检测、食品安全等领域中有广阔的使用前景。技术实现要素：本发明提供一种用于鉴别西洋参的dna杂交方法。一种用于鉴别西洋参的dna杂交方法，所述方法的探针序列为seqidno：1。所述用于鉴别西洋参的dna杂交方法中使用的洗涤液为金纳米颗粒溶液。所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的粒径为5nm，金纳米颗粒的浓度为5-20nm。所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的浓度为20nm。所述金纳米颗粒溶液中起稳定作用的dna浓度为25nm。所述用于鉴别西洋参的dna杂交方法，为基于微流控芯片的方法，所述微流控芯片包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的的微流道；调整所述流道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样本dna流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本dna流动轨迹交叉处为反应区。所述通道板的数量为不少于1块。所述用于鉴别西洋参的dna杂交方法，其操作步骤包括：(1)探针加入到微流控芯片中，沿探针固定轨迹被固定到所述测试板表面；(2)洗涤微流控芯片后，移除流道板，分别洗涤和吹干流道板和测试板，重新叠放流道板和测试板；(3)将生物素标记的单链待测样本dna加入到微流控芯片中，待测样本dna沿待测样本dna流动轨迹流动，在反应区与固定的探针杂交；(4)除去微流道芯片中的溶液，洗涤微流道芯片，在微流道芯片中加入cy-5标记的链霉亲和素溶液；(5)洗涤和干燥微流道芯片，取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号。一种鉴别西洋参的dna杂交方法试剂盒，所述试剂盒包括微流控芯片、cy-5标记的链霉亲和素溶液、洗涤溶液、溶解液、探针；所述微流控芯片包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的的微流道；调整所述流道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样本dna流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本dna流动轨迹交叉处为反应区；所述探针序列为seqidno：1，所述的溶解液用于溶解和稀释所述探针和待测样本dna。所述的溶解液成分为含0.15mnacl、0.015mph7.0的柠檬酸钠缓冲液、0.15％十二烷基苯磺酸钠的溶液。所述洗涤溶液为nacl-nahco3水溶液、nabh4溶液、1倍pbs缓冲液，金纳米颗粒溶液、含0.15％吐温的1倍pbs缓冲液。本发明提供的鉴别西洋参的dna杂交方法中使用的探针是基于人参属基因组中达玛烯二醇合酶(dammarenediolsynthase)基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)位点设计。本发明人实验中发现中国人参、西洋参和三七的达玛烯二醇合酶基因相似性高，为了更加准确的鉴别西洋参，发明人设计了多种探针序列，最后筛选出了可以准确鉴别西洋参的探针序列。本发明提供的鉴别西洋参的dna杂交方法将微流控芯片和基因多态性检测相结合，一方面保留了微流控芯片无需电泳、可以使用体积小(0.5μl)和低浓度(为0.1nm)样品、可同时检测多个样品、以及反应速度快的优点，另一方面也保留了基因多态性检测准确度高的优点，因此本发明的鉴别西洋参的dna杂交方法检测性能优越。附图说明图1微流控芯片示意图其中1为测试板，2为通道板。图2微流控芯片使用原理示意图其中3为探针固定轨迹；4为待测样品dna轨迹；5为反应区；图2-a为探针加入微流控芯片时，测试板1和通道板2的叠放位置示意图；图2-b为探针固定轨迹3示意图；图2-c为待测样品dna加入微流控芯片时，测试板1和通道板2的叠放位置示意图；图2-d为探针固定轨迹3和待测样品dna轨迹4交叉状态示意图；图2-e为测试板用激光扫描仪扫描荧光信号下的示意图。图3探针筛选结果pgin为中国人参的待测样本dna反应区，pquin为西洋参的待测样本dna反应区；a为n2q探针的反应区，b为n1q探针的反应区。图4金纳米颗粒溶液的实验结果组别1的洗涤液为：1倍pbs缓冲液；组别2的洗涤液为：金纳米颗粒浓度为5nm的溶液；组别3的洗涤液为：金纳米颗粒浓度为10nm的溶液；组别4的洗涤液为：金纳米颗粒浓度为15nm的溶液；组别5的洗涤液为：金纳米颗粒浓度为20nm的溶液；1、3、5、7、9为中国人参的待测样本dna反应区；2、4、6、8、10为西洋参的待测样本dna反应区。图5金纳米颗粒溶液的实验结果柱形图组别1的洗涤液为：1倍pbs缓冲液；组别2的洗涤液为：金纳米颗粒浓度为5nm的溶液；组别3的洗涤液为：金纳米颗粒浓度为10nm的溶液；组别4的洗涤液为：金纳米颗粒浓度为15nm的溶液；组别5的洗涤液为：金纳米颗粒浓度为20nm的溶液。图6金纳米颗粒在不同浓度以及不同dna浓度下的紫外-可见光吸收光谱。图7不同组分的金纳米颗粒溶液的实验结果图图7-a为组别a的实验结果图，图7-b为组别b的实验结果图。具体实施方式为了更好理解本发明的技术方案和优点，以下通过具体实施方式，并结合附图对本发明做进一步说明。实施例11、各种溶液配置探针溶液的配置取溶解液与探针，配置探针溶液，其中配置成的探针溶液成分如下：(1)25μm胺标记的寡核苷酸单链(2)1.5mnacl(3)0.15m碳酸氢钠(4)0.15％十二烷基磺酸钠(sds)待测样本dna溶液的配置取溶解液与待测样本dna，配置待测样本dna溶液，其中配置成的待测样本dna溶液成分如下：(1)25nm生物素标记的寡核苷酸单链(2)0.15mnacl(3)0.015m柠檬酸钠(ph7.0)(4)0.15％十二烷基磺酸钠(sds)金纳米颗粒(aunp)溶液的配置实验前将aunp储存液加至ad6(注：ad6为一条单链dna，序列为cgccgattggacaaaacttaaa)及pbs等混合溶液中，进行如下操作：(1)以8000rpm离心5秒(离心分离至管底)，然後振荡数秒；(2)将离心管置于95℃上加热10min，取出在室温下冷却90min；(3)加入1倍pbs溶液，随后进行离心和振荡，该溶液需在1h内使用。2、实验操作步骤(1)1μl探针溶液加入到微流控芯片中，室温反应1小时，让探针沿探针固定轨迹被固定到测试板表面；(2)移除探针溶液，用nacl-nahco3水溶液(含1.5mnacl，0.15mnahco3)洗涤微流控芯片，移除流道板，放测试板在2.5mg/ml的nabh4溶液，室温反应15min,再以1倍pbs溶液清洗测试板,分别吹干流道板和测试板，重新叠放流道板和测试板；(3)将1μl已变性且生物素标记的待测样本dna溶液加入到微流控芯片中，待测样本dna沿待测样本dna流动轨迹流动，等待待测样本dna在反应区与固定探针杂交1小时；(4)除去微流道芯片中的溶液，洗涤微流道芯片，移除微流道芯片中的液体，然后在微流道芯片中加入0.6μl50μg/ml的cy-5标记的链霉亲和素溶液，室温反应15min；(5)除去cy-5标记的链霉亲和素溶液，用含0.15％吐温的1倍pbs缓冲液洗涤干燥微流道芯片，移开通道板，再以1倍pbs溶液清洗测试板，干燥测试板；(6)取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号。实施例2探针序列的筛选探针设计了两种，分别记为n1q和n2q，两种探针的序列分别为：n1q：ctaaaaaaaaagtatttctcatctaaattttgaa(seqidno：1)n2q：gaatttgaaagtgttttaaattgattttcaa(seqidno：2)待测样本dna制备2份，分别来源于中国人参和西洋参，中国人参的待测dna样本记为pgin，西洋参的待测dna样本记为pquin。按照实施例1的操作进行实验，其中实施例1中步骤(4)洗涤微流道芯片中洗涤液使用1倍pbs缓冲液，实验结果如图3所示。从图3上可以看到，探针n2q固定的反应区，中国人参和西洋参的荧光反应无显著性差异，探针n2q无法很好的区分出中国人参和西洋参；而在探针n1q固定的反应区，西洋参的反应信号高于中国人参的反应信号，探针n1q可以很好的区分出中国人参和西洋参。所以探针n2q被排除，选择探针n1q作为鉴别西洋参的探针。实施例3金纳米颗粒溶液的筛选实验a待测样本dna制备2份，分别来源于中国人参和西洋参。按照实施例1的操作进行实验，其中实施例1中步骤(4)洗涤微流道芯片中洗涤液为：(1)组别1使用1倍pbs缓冲液；(2)组别2使用的金纳米颗粒浓度为5nm的溶液；(3)组别3使用的金纳米颗粒浓度为10nm的溶液；(4)组别4使用的金纳米颗粒浓度为15nm的溶液；(5)组别5使用的金纳米颗粒浓度为20nm的溶液；实验结果如图4所示。其中纵向的1、3、5、7和9为人参反应区，2、4、6、8和10为西洋参反应区。组别1-5，在n1q实验区中pgin(中国人参)和pquin(西洋参)各个反应区的校正荧光值根据图4的绘制图5。从图5可以看到，使用金纳米颗粒溶液清洗的组别2-5获得的区分效果比使用1倍pbs缓冲液清洗的组别1获得的区分效果好，并且组别5的区分效果最好。实验b金纳米颗粒溶液成分的筛选配置5组溶液，溶液的成分如下表所述：组别成分组别1：nopbs20nm金纳米颗粒(5nm)组别2：1倍pbs20nm金纳米颗粒(5nm),1倍pbs组别3：20nmdna1倍pbs20nm金纳米颗粒(5nm),20nmad6,1倍pbs组别4：25nmdna1倍pbs20nm金纳米颗粒(5nm),25nmad6,1倍pbs组别5：30nmdna1倍pbs20nm金纳米颗粒(5nm),30nmad6,1倍pbs按照表格中的成分配置好5组溶液，将5种溶液中的每一种放入塑料试管中，进行光谱扫描(300～800nm)。用光谱仪hp8453记录dna的紫外吸收光谱。实验结果如图6所示。从图6可以看出，对于20nm的aunps混合物，在pbs和dna不存在的情况下，aunp将聚集，导致峰值吸光度红移。在20nmdna的存在下，峰值位移不太明显，但是峰值扩大。在dna浓度为25和30nm，红移和峰值变化是最小的，为了留下更多的金颗粒表面与微流控芯片上的dna双链相互作用，因此选择较低浓度的dna25nm进行实验。实施例4(1)1μl序列为seqidno：1和seqidno：2的两种探针溶液沿通道板上不同的微流道加入到微流控芯片中，室温反应1小时，让两种探针分别沿探针固定轨迹被固定到测试板表面；(2)移除探针溶液，用nacl-nahco3水溶液(含1.5mnacl，0.15mnahco3)洗涤微流控芯片，移除流道板，放测试板在2.5mg/ml的nabh4溶液，室温反应15min,再以1倍pbs溶液清洗测试板,分别吹干流道板和测试板，重新叠放流道板和测试板；(3)将1μl已变性且生物素标记的中国人参、西洋参两种待测样本dna沿通道板上不同的微流道加入到微流控芯片中，待测样本dna沿待测样本dna流动轨迹流动，等待待测样本dna在反应区与固定探针杂交1小时；(4)除去微流道芯片中的溶液，用金纳米颗粒溶液洗涤微流道芯片，移除微流道芯片中的液体，然后在微流道芯片中加入0.6μl50μg/ml的cy-5标记的链霉亲和素溶液，室温反应15min；(5)除去cy-5标记的链霉亲和素溶液，用含0.15％吐温的1倍pbs缓冲液洗涤干燥微流道芯片，移开通道板，再以1倍pbs溶液清洗测试板，干燥测试板；(6)取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号，各个反应区的校正荧光值见图6所示。其中步骤(4)洗涤微流道芯片中洗涤液为：(1)组别a：20nm金纳米颗粒(5nm),25nmad6,使用1倍pbs缓冲液；(2)组别b：20nm金纳米颗粒(5nm),30nmad6,使用1倍pbs缓冲液。图7-a为组别a的实验结果图；图7-b为组别b的实验结果图。如图7所示，使用金纳米颗粒溶液清洗的组别a获得的区分效果比组别b获得的区分效果好，说明金纳米颗粒溶液中的dna(ad6)含量并不是越高越好，当金纳米颗粒溶液中20nm粒径为5nm的金纳米颗粒浓度为20nm时，dna(ad6)浓度含量为25nm时，本发明的鉴别的区分效果最好。当前第1页12