一种PSR检测大肠杆菌I型志贺毒素的引物、试剂盒及其方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的引物、试剂盒及其方法。
背景技术：
：志贺毒素主要是由大肠杆菌产生的，产志贺毒素大肠杆菌(shigatoxin-producingescheriachiacoli，stec)是世界上人类食品中毒的主要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌。stec中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，可引起非出血性腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征等疾病。其致病的特征性毒力因子是i型志贺毒素(stx1)和ii型志贺毒素(stx2)，分别由stx1、stx2编码，由stx1引起的疾病经常被报道。目前对志贺毒素的检测方法主要有常规方法检测、pcr检测方法，免疫学检测方法以及基因芯片检测方法等。常规检测方法主要是根据致病菌的生化试验、血清凝集试验等来达到鉴定的目的，一般需要经过菌株培养、纯菌落分离、生化实验、血清凝集等操作，该过程耗时长，基本在3～5天才能得出实验结果，并且劳动量大、灵敏性不高，一般需要结合其他检测技术。pcr检测方法是根据目的基因片段，设计一对寡核苷酸为引物，在dna聚合酶作用下，经过变性、退火及延伸等步骤，进行20～40个循环，最终特异扩增出目的dna片段。该方法特异性强、灵敏度高，但其成本较高。免疫学检测方法如elisa法是将具有免疫活性的抗原或抗体吸附在固相载体表面，再加一种活性酶标记的抗体或抗原，然后加入酶显色底物，通过活性酶作用于底物产生颜色进行判断，该方法灵敏度高、特异性强，但其操作过程复杂，影响因素较多，并且成本偏高，不适用于大量检测。近年来发展起来的基因芯片检测方法具有高通量、快速、自动化程度高等特点，但由于该技术成本很高，不能普遍应用于常规的检测领域。目前应用最广泛的恒温扩增技术-lamp虽有灵敏度高、特异性强等优点，但也存在引物设计复杂、假阳性率高、试剂价格偏高等不足。聚合酶螺旋反应(polymerasespiralreaction，psr)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。因此，建立一种针对大肠杆菌志贺i型毒素新型的具有独立知识产权的等温核酸扩增方法具有重要的意义。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的引物。本发明的另一目的在于提供一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的试剂盒。本发明的再一目的在于提供一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的方法。其具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的引物，包括检测引物ft与检测引物bt，加速引物if与加速引物ib，其核苷酸序列如下所示：检测引物ft:5’-cagtgttgtacgaaatccccgagcgatgttacggtttg-3’(seqidno.1)；检测引物bt：5’-cccctaaagcatgttgtgacaggcaggacactactcaa-3’(seqidno.2)；加速引物if：5’-ctgtatttgccgaaaac-3’(seqidno.3)；加速引物ib：5’-acattgaactggggaag-3’(seqidno.4)。所述的大肠杆菌为大肠杆菌o157:h7atcc43895，大肠杆菌e019，大肠杆菌e020，大肠杆菌e043和肠杆菌e044中的一种以上。一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的试剂盒，包括上述psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的引物。所述的psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的引物中检测引物ft与bt，加速引物if与ib的浓度均为50μm。所述的psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的试剂盒，还包括如下组分：a、2×反应缓冲液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；b、bstdna聚合酶；c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。组分b中所述的bstdna聚合酶优选为浓度为8u/μl的bstdna聚合酶水溶液。组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液中钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1:8；优选为通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mm的氯化锰水溶液；(ii)取25μl50μm的钙黄绿素溶液与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。所述的psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的引物或所述的psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的试剂盒在检测大肠杆菌i型志贺毒素中的应用。一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的方法，为利用如seqidno.1～seqidno.4所示的检测引物进行psr等温扩增反应，检测待检样品中的大肠杆菌i型志贺毒素。所述的psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的方法，具体包括如下步骤：(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并控制模板dna水溶液的od260/od280值为1.8～2.0；(2)于65℃水浴中保温40分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为26μl反应体系：2×反应缓冲液12.5μl，50μm的检测引物ft、50μm的检测引物bt各0.8μl，50μm的加速引物if、50μm的加速引物ib各0.4μl，dna模板2.0μl，8u/μl的bstdna聚合酶1.0μl，去离子水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有大肠杆菌i型志贺毒素；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有大肠杆菌i型志贺毒素。步骤(2)中所述的检测引物ft的核苷酸序列如seqidno.1所示，检测引物bt的核苷酸序列如seqidno.2所示，加速引物if的核苷酸序列如seqidno.3所示，加速引物ib的核苷酸序列如seqidno.4所示。步骤(2)中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mm的氯化锰水溶液；(ii)取25μl50μm的钙黄绿素溶液与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明中所提供的针对i型志贺毒素异性靶序列stx1所设计的聚合酶螺旋检测鉴定体系，解决现有技术中的方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。(2)本发明的方法可以将检测时间减少至40分钟，同传统环介导等温扩增技术相比缩短了检测周期，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。同时，本发明还公开了针对i型志贺毒素的特异性靶序列stx1保守区的特异区域设计了一对检测引物，从而保证了检测结果的可靠性。其次，本发明在等温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，在40分钟就可完成结果判读。此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果，操作简便快捷，检测成本较低。本发明的试剂盒及方法特别适用中小型单位及现场检测。附图说明图1是stx1引物筛选实验的电泳结果图；其中，stx1-1为第一套引物(ft-stx1-1、bt-stx1-1、if-stx1-1、ib-stx1-1)的电泳结果；stx1-1为第二套引物(ft-stx1-2、bt-stx1-2、if-stx1-2、ib-stx1-2)的电泳结果；stx1-3为第三套引物(ft-stx1-3、bt-stx1-3、if-stx1-3、ib-stx1-3)的电泳结果(图中，泳道m为dnamarker，泳道1为大肠杆菌o157:h7atcc43895，泳道2为大肠杆菌e019，泳道3为大肠杆菌e020，泳道4为大肠杆菌e043，泳道5为大肠杆菌e044，泳道ng为阴性对照)。图2是聚合酶螺旋反应技术检测i型志贺毒素的结果图(ng为空白对照；1为大肠杆菌o157:h7atcc43895，2为大肠杆菌e019，3为大肠杆菌e020，4为大肠杆菌e043，5为大肠杆菌e044)。图3是特异性检测实验结果图；其中，泳道m为dnamarker；泳道1：大肠杆菌o157:h7atcc43895；泳道2：大肠杆菌e019；泳道3：大肠杆菌e020；泳道4：大肠杆菌e043；泳道5：大肠杆菌e044；泳道6：金黄色葡萄球菌atcc23235；泳道7：金黄色葡萄球菌atcc6358；泳道8：金黄色葡萄球菌atcc12600；泳道9：金黄色葡萄球菌atcc25923；泳道10：金黄色葡萄球菌atcc19095；泳道11：沙门氏菌atcc29629；泳道12：沙门氏菌atcc19585；泳道13：沙门氏菌atcc14028；泳道14：沙门氏菌atcc13076；泳道15：沙门氏菌700155；泳道16：沙门氏菌atcc9115；泳道17：单增李斯特菌atcc19118；泳道18：单增李斯特菌atcc19116；泳道19：单增李斯特菌atcc19114；泳道20：单增李斯特菌atcc19115；泳道21：单增李斯特菌atcc15313；泳道22：副溶血性弧atcc27969；泳道23：副溶血性弧菌atcc17802。图4是敏感性实验结果图；其中，泳道m为dnamarker；泳道1为112ng/μl；泳道2为11.2ng/μl；泳道3为1.12ng/μl；泳道4为112pg/μl；泳道5为11.2pg/μl；泳道6为1.12pg/μl；泳道7为112fg/μl；ng为阴性对照。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均可通过市售获得。实施例1聚合酶螺旋反应检测stx1引物筛选1.设计引物根据psr扩增反应原理，使用primerpremier软件针对stx1靶点设计如表1所示的三套引物。表1引物信息引物名称序列5’-3’ft-stx1-1cctctgtatttgccgaaaac-gcaagagcgatgttacggbt-stx1-1caaaagccgtttatgtctcc-aggcaggacactactcaaccif-stx1-1gcttcagctgtcacagtib-stx1-1tcttacattgaactggggaft-stx1-2cagtcattacataagaacgcc-ttcggcaaatacagagggbt-stx1-2ccgcaagaatacattactgac-aggcaggacactactcaaccif-stx1-2gatcatccagtgttgtaib-stx1-2tacattgaactggggaft-stx1-3cagtgttgtacgaaatcccc-gagcgatgttacggtttgbt-stx1-3cccctaaagcatgttgtgac-aggcaggacactactcaaif-stx1-3ctgtatttgccgaaaacib-stx1-3acattgaactggggaag2.建立聚合酶螺旋反应检测方法(1)反应体系①表1中浓度各为50μm的引物对组合。②2×反应储液：由浓度为40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)的混合液组成。③浓度为8u/μl的bstdna聚合酶(bstdnapolymerase,largefragment，购自neb公司)水溶液。(2)检测方法①提取待检样品的细菌dna(dna提取试剂盒购自广东东盛生物科技有限公司，货号n1152)作为模板dna：以大肠杆菌o157:h7atcc43895(美国菌种保藏中心)，大肠杆菌e019，大肠杆菌e020，大肠杆菌e043，大肠杆菌e044为研究对象，对所设计的引物进行筛选。其中，大肠杆菌e019、e020、e043和e044可根据参考文献获得(周蓉.低温储藏对肠出血大肠杆菌vbnc状态的诱导及毒素表达量的影响研究[d].华南理工大学,2015.)。采用dna提取试剂盒提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od260/od280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8；以去核酸水做空白对照。(2)大肠杆菌的聚合酶螺旋扩增反应：针对靶点stx1，分别在反应管中配置总体积为25μl的聚合酶螺旋扩增反应体系；加入2×反应储液12.5μl，对应的检测ft与bt等体积混合引物混合液1.6μl，对应的加速引物if和ib等体积混合液1.6ul，bstdna聚合酶1μl，dna模板2.0μl，用去离子水补充体积至25μl。此时各物质浓度为：tris-hcl20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween200.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bstdna聚合酶8u，检测引物ft、bt各1.6μm，加速引物if、ib各1.6μm。将反应管置于65℃水浴中保温反应40分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。对扩增结束后的产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，图1为靶点stx1引物筛选的结果，靶点stx1所设计的第一套引物(ft-stx1-1、bt-stx1-1、if-stx1-1、ib-stx1-1；stx1-1)中泳道2，泳道3，和泳道4均未检出，泳道5和泳道6的效果不佳。第二套引物(ft-stx1-2、bt-stx1-2、if-stx1-2、ib-stx1-2；stx1-2)中全部未检出。第三套引物(ft-stx1-3、bt-stx1-3、if-stx1-3、ib-stx1-3；stx1-3)中全部检出，加入去核酸水无条带，此引物的效果较好，因此在后续实验中采用第三套引物。实施例2基于聚合酶螺旋反应等温扩增技术检测e.colio157:h7的微生物方法1、基于聚合酶螺旋等温扩增技术检测病原微生物的方法，本实施例以e.colio157:h7为例，其使用试剂如下：a.浓度各为50μm的检测引物ft水溶液、bt水溶液、加速引物if水溶液、ib引物水溶液引物序列如下(5’-3’)：检测引物ft:5’-cagtgttgtacgaaatccccgagcgatgttacggtttg-3’(seqidno.1)；检测引物bt：5’-cccctaaagcatgttgtgacaggcaggacactactcaa-3’(seqidno.2)；加速引物if：5’-ctgtatttgccgaaaac-3’(seqidno.3)；加速引物ib：5’-acattgaactggggaag-3’(seqidno.4)。b.2×反应储液：由浓度为40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)的混合液组成；c.浓度为8u/μl的bstdna聚合酶(大片段，neb公司)水溶液；d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配置浓度为50μm的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)；然后取25μl50μm的钙黄绿素溶液，与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。2、使用上述试剂利用聚合酶螺旋反应扩增技术检测i型志贺毒素，包括如下步骤:(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna：本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为五株大肠杆菌o157:h7atcc43895，e019，e020，e043，e044；采用dna提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od260/od280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。(2)大肠杆菌i型志贺毒素的聚合酶螺旋扩增反应：在反应管中配置总体积为26μl的聚合酶螺旋扩增反应体系；加入2×反应储液12.5μl，检测引物ft与检测引物bt等体积混合液1.6μl，加速引物if与加速引物ib等体积混合液0.8μl，bstdna聚合酶1μl，dna模板2.0μl，用去离子水补充体积至25μl，最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μl，混匀即可。此时各物质浓度为：tris-hcl20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween200.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bstdna聚合酶8u，引物ft、bt各1.6μm，引物if、ib各0.8μm。将反应管置于65℃水浴中保温反应40分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。(3)显色检测：待反应结束后，用肉眼观察颜色变化。结果如图2所示，结果显示：空白对照组的颜色为黄色，说明检测菌株不含i型志贺毒素基因；实验组(大肠杆菌o157:h7atcc43895，大肠杆菌e019，大肠杆菌e020，大肠杆菌e043，大肠杆菌e044)的颜色均变为绿色，说明含有i型志贺毒素基因。实施例3聚合酶螺旋反应检测i型志贺毒素特异性试验将含有i型志贺毒素的大肠杆菌(大肠杆菌o157:h7atcc43895，大肠杆菌e019，大肠杆菌e020，大肠杆菌e043，大肠杆菌e044)与不含i型志贺毒素其他菌株(金黄色葡萄球菌atcc23235，金黄色葡萄球菌atcc6358，金黄色葡萄球菌atcc12600，金黄色葡萄球菌atcc25923，金黄色葡萄球菌atcc19095，沙门氏菌atcc29629，沙门氏菌atcc19585，沙门氏菌atcc14028，沙门氏菌atcc13076，沙门氏菌atcc700155，沙门氏菌atcc9115，单增李斯特菌atcc19118，单增李斯特菌atcc19116，单增李斯特菌atcc19114，单增李斯特菌atcc19115，单增李斯特菌atcc15313，副溶血性弧atcc27969，副溶血性弧菌atcc17802)的基因组dna按照上述实施例1中的反应体系和条件建立聚合酶螺旋反应检测方法，进行特异性试验。设置含有i型志贺毒素大肠杆菌的基因组为阳性对照(含有i型志贺毒素大肠杆菌的基因组dna可从大肠杆菌中提取，并经pcr验证)，超纯水为阴性对照，结果如图3所示。结果表明，只有含有i型志贺毒素大肠杆菌基因组出现阳性反应，其余均呈现阴性反应。实施例4psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的敏感性试验将大肠杆菌o157:h7atcc43895的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为112ng/μl，11.2ng/μl，1.12ng/μl，112pg/μl，11.2pg/μl，1.12pg/μl，112fg/μl。同时设置阴性对照(去离子水)，按照上述实施例1中的反应体系构建聚合酶螺旋反应扩增方法，以确定检测方法的敏感性，结果如图4所示。结果表明：建立的大肠杆菌i型志贺毒素聚合酶螺旋反应方法可检测样品中1.12pg/μl的大肠杆菌dna。结论：从上述实验结果可以看出，聚合酶螺旋反应扩增方法与常规pcr和荧光pcr具有如下优点：操作简便：操作过长较为简单，同时，不需要复杂的设备，仅需要一个普通水浴锅，并可以通过荧光染料直接观测检测结果，省去了传统的电泳检测步骤。快速：常规pcr整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量pcr需要1～1.5小时，本发明所提供的检测方法在40分钟就可出现阳性结果。特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，从而完成了大肠杆菌i型志贺毒素的定性检测。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南理工大学<120>一种psr检测大肠杆菌i型志贺毒素的引物、试剂盒及其方法<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>检测引物ft<400>1cagtgttgtacgaaatccccgagcgatgttacggtttg38<210>2<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>检测引物bt<400>2cccctaaagcatgttgtgacaggcaggacactactcaa38<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>加速引物if<400>3ctgtatttgccgaaaac17<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>加速引物ib<400>4acattgaactggggaag17<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ft-stx1-1<400>5cctctgtatttgccgaaaacgcaagagcgatgttacgg38<210>6<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>bt-stx1-1<400>6caaaagccgtttatgtctccaggcaggacactactcaacc40<210>7<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>if-stx1-1<400>7gcttcagctgtcacagt17<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ib-stx1-1<400>8tcttacattgaactgggga19<210>9<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ft-stx1-2<400>9cagtcattacataagaacgccttcggcaaatacagaggg39<210>10<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>bt-stx1-2<400>10ccgcaagaatacattactgacaggcaggacactactcaacc41<210>11<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>if-stx1-2<400>11gatcatccagtgttgta17<210>12<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ib-stx1-2<400>12tacattgaactgggga16当前第1页12