长牡蛎糖原含量相关基因与SNP标记鉴定及高糖原个体筛选方法与流程

本发明属于分子生物学与遗传育种领域，涉及到与长牡蛎糖原含量相关的snp鉴定方法和潜在应用。

背景技术：

牡蛎是重要的养殖贝类，中国牡蛎年产量400多万吨，占世界牡蛎产量的80％以上，其中长牡蛎是北方地区主养品种。虽然牡蛎产量较高，但是中国产牡蛎整体品质较差，销售价格仅为国际市场的1/3左右，国际高端市场占有率比较低。牡蛎品质性状主要包括体尺规格，肥满度及糖原含量。尤以糖原含量，对牡蛎非繁殖期奶白色色泽和肥满度贡献较大。因此对牡蛎品质性状，尤其是糖原含量的遗传改良是提高中国牡蛎品质和竞争力的可靠途径。

牡蛎糖原含量具有季节变化的特征，秋冬季含量高，春夏季节为性腺发育供给能量而逐渐降低。而且不同组织间含量差异较大，以性腺，唇瓣，外套膜含量最高。糖原含量性状的遗传力属于中高水平，表明其受遗传控制，且牡蛎个体间糖原含量差异较大，因此对糖原含量的选育是必要和可行的。同时，糖原含量又是屠宰性状，必须在杀死牡蛎后才可以进行测定，这严重制约了传统选育手段进行糖原含量选育。由于糖原含量和生长性状等可活体测量的体尺性状等具有很微弱的相关性，所以通过生长性状间接选育也是行不通的，因此进行分子育种是必不可少的。

牡蛎转录组和全基因组重测序开发出数以千万计的单核苷酸多态性位点(snp)，这些位点为分子标记辅助育种奠定了基础。其中候选基因关联分析和全基因组关联分析是主要的分析方法。随着长牡蛎全基因组测序的完成以及高密度遗传连锁图谱的获取，使得进行全基因组关联分析分析成为可能。课题组利用427个体全基因组重测序，获得大量snp标记，进行糖原等营养品质性状的全基因组关联分析。结果表明，有一串显著性位点与糖原含量显著相关(p<10^-6)。通过对显著位点上下游各100kb的基因组区域扫描，筛选到基因“蛋白磷酸酶1调节亚基3b”，该基因在哺乳动物中具有糖原调节代谢的功能。基因克隆后通过位点精细定位发现3个极显著snp位点位于该基因区。

本发明基于长牡蛎糖原含量全基因组关联分析的结果，获得了影响糖原含量的主效snp位点及关键基因，筛选出与糖原含量极显著相关的3个snp标记并开发得到最优组合，用于糖原含量的预测。与以往开发的snp位点相比，本发明所述位点为全基因组关联分析获得，且经过了位点精细定位，可信度更高，应用范围更广，更容易在群体中得到验证，用于分子育种。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种与长牡蛎糖原含量相关的snp标记，为长牡蛎的分子标记辅助选择育种提供参考。

为实现上述目的，本发明的技术方案为一种与长牡蛎糖原含量相关的snp标记，位于蛋白磷酸酶1糖原靶向亚基启动子区有3个显著关联的(分别位于转录起始位点上游436,202,115碱基处)，突变类型均为t/c，命名为ppr1，ppr2，ppr3。

通过全基因组重测序获得目的ppr1位点其上下游各500bp核苷酸序列为seqidno.1所示,第501位，735位,822位分别为ppr1，ppr2，ppr3。

在全基因组关联分析群体中检测各个个体的基因型和表型数据，通过基因型和糖原含量进行关联分析预测得出ppr1,ppr2,ppr3和长牡蛎糖原含量显著相关(p<10^-6)，可用于长牡蛎的标记辅助选择育种。与长牡蛎糖原含量性状相关的snp标记的检测方法，其筛选步骤是：

a)实验材料的收集及同质化驯养：收集427个长牡蛎野生个体母本，与胶南本地一个父本构建427个半同胞家系，并进行同质化养殖。

b)糖原含量的测定：利用试剂盒(蒽酮比色法)对不同家系长牡蛎个体进行糖原含量测定，以30个后代均值代表母本表型值。

c)基因分型：采用二代测序技术平台，对427个牡蛎母本进行全基因组重测序，筛查snp位点并进行个体分型，获得用于关联分析的有效snp位点。

d)关联分析：利用gapit软件通过混合线性模型进行全基因组关联分析，获得与性状显著关联的蛋白磷酸酶1糖原靶向亚基，该基因区3个极显著snp位点(p<10^-6)。全基因组关联分析曼哈顿图见附图2。随后选取位于蛋白磷酸酶1糖原靶向亚基启动子区snp-ppr1，ppr2,ppr3，作为本项目候选snp位点。

本发明通过全基因组关联分析，鉴定出位于长牡蛎染色体上的一串与糖原含量显著相关的snp信号，该区间定位到一个和糖原含量相关基因：蛋白磷酸酶1调节亚基3b(糖原靶向亚基)。该基因启动子区有3个显著关联的snp-ppr1，ppr2，ppr3(分别位于转录起始位点上游436,202,115碱基处)，开发了其相应的检测方法，结果表明利用该方法可以简单迅速检测这些snp位点，并在一个野生的独立群体中验证了这些位点的显著性。同时，拥有3个优势基因型个体糖原含量比劣势基因型组合个体显著提高10％以上。后续可以通过该方法，筛选优势基因型组合的亲贝，用于牡蛎育种。所述长牡蛎ppr1上下游500bp的核苷酸序列如seqidno.1所示,ppr2,ppr3包含在此区间内。

与长牡蛎糖原含量显著相关的snp标记的潜在应用，其优势在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，提高子代糖原含量。本研究结果获得snp标记可信度更高，适应群体的范围更广，效果更稳定。

本发明的优点：

本发明通过检测个体基因型的方法用于预测个体糖原含量的高低，育种中可通过无损取样技术在苗种繁育前取样，选择目标基因型组合个体作为亲本，进行分子标记辅助选择育种。克服屠宰性状难以选育的特点，使操作简便易行。

附图说明

图1是上述包含的ppr1,ppr2,ppr3位点的三种基因型个体峰图。分别位于序列表1的第501位、第735位、第822位；

图2是上述长牡蛎糖原含量全基因组关联分析的曼哈顿图。

具体实施方式

序列表(1)seqidno.1的信息序列特征长度：1001bp，ppr1位点上下游各500bp。

序列表(1)seqidno.1的信息序列特征长度：1001bp

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线形

分子类型：dna

来源：长牡蛎

序列描述：

caagggatgtgtgtgtgttggagggggggggggtagatttgaggttagtcggcggtacttaatttacagagtaattaaagataaagagctagaaatgtagaaattgacctgacatgtagttacaaatgtacatgtatatactacaatgacgtactataattatatttaacgatacggccggtacatgcgcggattttcattaagtgacttttaggtggtatgggacacctccatagtgtggcgtacttccgatcgaaataaacaataaaatcaagcatttaataattttacaaactttttcttctacaaaactttggactaatagcgtagcgcaatgggttgaagcgttaaccacgaatctttaagttatgagttcgaatctcactggggcttttatagtttttacctttcccaaacatttcgaaacatttttggccaaatattgtaaaatttgaaagaaaaaaaaccccgatagtttcgcgcatgcgatacatattttacaaggactgaaaatatgttcagattgttccattttagaggatacatatacatttaagtttcgattaaaaatggcttaacaccccaccaaaatccgcaaaatagaatgtaaaaaaagaaatcgtgtacctttctaattgcattttttacaattagttttccacattattttactcgtaatacttattttttttacgaggtaaacatatttttgttcatctattatgatatttttacacatacatgtacctacattcatggaataaggaaattatttgaccttcatcttatgcacaaaagtaattgggccttatagttgtttattttttaaaccaccttagcaatggaatgctgcattcattctgttctttcctgcaattttgttcaacaacaatgtataaatagacacgtcacgtagactcgacgctcagtcagtggaaatgccgggtcagctgtttacagtcgtctgcaaggtaaggaattatatacccgtacatgtttgt

实施例1

a)样品的采集：采集胶南同期孵苗的野生群体288个个体，分成单体，等密度扇贝笼中养殖，次年2月份，牡蛎达到商品规格，糖原含量高且稳定时对其进行解剖，取闭壳肌和剩余组织，用液氮速冻后于-80℃保存备用。”

b)糖原含量测定

将剩余组织冷冻干燥48小时，使用组织研磨器研磨至细粉，使用近红外光谱模型测定糖原含量。

c)dna的提取：使用月桂酸钠法从闭壳肌中提取每个个体总dna

1)月桂酸钠缓冲液配制：准确称取nacl5.844g，月桂酸钠10g置于1000ml烧杯中，加入100mltris-hcl(1m)以及40mledta(0.5m)、800mlddh2o，用盐酸调节ph至8.0，定容至1000ml，灭菌后室温保存。

2)取1.5ml，灭菌的离心管，先加入200μl月桂酸钠提取缓冲液，取5-20mg的牡蛎闭壳肌组织，用研磨棒将组织匀浆。然后再加入500μl月桂酸钠提取缓冲液。

3)加入700μl苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)反复缓慢摇匀至上层白浊。

4)12000转，4℃离心15min两次后取出，立即小心吸取上清液400μl于新的1.5ml离心管中。

5)加入280μl(0.7*400μl)-20℃预冷的异丙醇；将离心管放入-20℃冰箱内，30分钟。然后上下缓慢颠倒6次，有白色絮状沉淀析出，颠倒时朝一个方向，防止沉淀散开。

6)12000转，4℃离心10分钟，管底出现沉淀，吸尽上清。

7)向离心管中加入500μl预冷的体积浓度70％乙醇，反复震荡洗涤沉淀，12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，重复两次。

8)将沉淀12000转，4℃短暂离心8秒，洗出残余乙醇，在超净台中通风抽干残存乙醇。

9)沉淀透明后，加入80μlte缓冲液(ph8.0)，65℃轻弹溶解(金属浴)。

10)加入1μlrna酶(0.1mg/ml),37℃水浴30分钟消化rna，即得到dna溶液。-20℃备用。

d)利用snapshot(多重单碱基延伸snp分型技术)进行snp位点基因型检测：

采用三种特异引物序列对三个snp位点进行分别分型检测；

1)利用特异引物，进行外围扩增。反应体系如下表；

引物序列为：

正向引物f：5’-agttcgaatctcactggggcc-3’

反向引物r：5’-ccggcatttccactgactga-3’

pcr扩增的反应程序为：

2)模板dna制备。在15μlpcr产物中加入5usap(虾碱性磷酸酶)和2uexoi(核酸外切酶i)震荡混匀37℃保温1小时然后75℃保温15分钟以灭活sap和exoi。

3)snapshotpcr

模板：以pcr产物作为snapshotpcr的模板，产物纯化后，每个个体各取3μl混合进行一个位点的检测，三个位点共分三次进行。

snapshotpcr：

特异引物序列分别为：ppr1:5’-

tttttttttttttttgagaattgtaaaccacacacgg-3’，ppr2:5’-ttttttttttttttttcatctattatgatatttttac-3’；

ppr3:5’-ttttttttttttgcacaaaagtaattgggccttatagttgttta-3’

4)snapshotpcr产物的纯化

在10μl上述snapshotpcr产物中加入1usap，震荡混匀，37℃保温1小时，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24小时或-20℃长期保存。

5)毛细管电泳。

电泳样品制备：首先将snapshot产物稀释20倍：

电泳条件：

95℃变性5min，后迅速冰冷4min。使用3730xldna分析仪对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号。环境条件：实验室温度：18-25℃；毛细管长度：50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kv。结果使用genemapperv4.0对实验结果进行分析,对每个个体的三个位点分别判断不同基因型。

e)关联分析：将糖原含量数据和基因型数据导入spss22.0软件，通过线性回归方法进行关联分析。结果表明snp位点ppr1,ppr2,ppr3均与糖原含量显著相关(p<0.001)。统计得到288个个体的糖原含量，ppr1位点tt>tc>cc,ppr2位点tt>tc>cc,ppr3位点cc>tc>tt，具体含量信息如表1。三个位点优势基因型组合个体含量显著高于劣势基因型组合个体，其中只有两类优势基因型组合(tt+tt+cc，tt+tc+cc)在该群体中存在3个及以上个体，具体信息如表2.

表1：288个个体糖原含量和基因分型分析。

糖原含量是各基因型个体平均值，其中糖原含量为其占干重比例。

表2：三个位点(依次对应snp位点ppr1,ppr2,ppr3)优势基因型组合糖原含量

序列表

<110>中国科学院海洋研究所

<120>长牡蛎糖原含量相关基因与snp标记鉴定及高糖原个体筛选方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1001

<212>dna

<213>长牡蛎(crassostreagigas)

<400>1

caagggatgtgtgtgtgttggagggggggggggtagatttgaggttagtcggcggtactt60

aatttacagagtaattaaagataaagagctagaaatgtagaaattgacctgacatgtagt120

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