杉并根结线虫的PCR检测特异性引物及试剂盒的制作方法

本发明属于植物线虫检测鉴定技术领域，具体为杉并根结线虫的pcr检测特异性引物及试剂盒。

背景技术：

根结属线虫(meloidogynegoeldi，1887)为植物根系专性内寄生线虫，是植物病原线虫中种类最多、分布最广、为害最严重的类群之一，具有十分重要的经济意义。我国于2007年将根结线虫(非中国种)列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。

我国口岸出入境检疫实验室或其他相关部门，都面临着对根结线虫进行快速、准确的鉴定这一难题。近年来，虽然在形态学鉴定的基础上，pcr－rflp、荧光pcr、特异性pcr、序列测定、lamp技术等已在线虫鉴定上广泛应用，但多数只能针对南方、花生、爪哇等几种常见的根结线虫进行鉴定。

杉并根结线虫meloidogynesuginamiensis，这是我国口岸首次截获该种线虫。目前，全球仅日本已报道发现该种线虫，其他国家未有确切报道。该种线虫寄主较广，包括桑树、榆树、樱花、黄瓜、辣椒等20多种木本和草本植物，潜在危害显著，还是日本桑树最重要的病原线虫之一。

随着我国经济发展和生态需求，进境种苗数量快速增长，各种外来生物有可能随之入侵。要防止其入侵，首先必须进行准确鉴定，而目前对杉并根结线虫的鉴定仍主要依据传统形态学方法，存在一定的弊端，主要是对鉴定者有较高要求、要求有足够的样本等。因此，发明杉并根结线虫的鉴定方法，可以对进境种苗中的该线虫进行准确鉴定，对于防止根结线虫非中国种入侵、保护我国农林生产安全具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异、准确的杉并根结线虫的pcr检测特异性引物及试剂盒。

本发明系选择参考自行克隆测序获得的杉并根结线虫的核糖体内转录间隔区(internaltranscribedspacer)序列，通过和genbank中近似种的同源基因进行比对，使用tipmt(http://200.131.37.155/tipmt/？pg＝extract)对特异性位点和非特异性位点进行分析，再使用primerexplorerv4(http://primerexplorer.jp)设计特异性引物。经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估(以杉并根结线虫的dna为模板，苹果根结线虫、山茶根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫为阴性对照，水为空白对照，利用引物进行pcr检测。通过观察扩增产物的保守性和特异性，筛选最适引物)，筛选得到扩增效率和特异性好的一对特异性引物。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

本发明采用的技术方案是：

杉并根结线虫的pcr检测特异性引物，所述特异性引物的序列如下：

上游引物msf：5'-tggtcgtgtaacggctaac-3'

下游引物msr：5'-gattttcgcccctcaaacacc-3'。

进一步，本发明还提供一种杉并根结线虫的pcr检测试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物的序列如下：

上游引物msf：5'-tggtcgtgtaacggctaac-3'

下游引物msr：5'-gattttcgcccctcaaacacc-3'。

进一步，所述杉并根结线虫的pcr检测试剂盒的组成如下：

无mg²⁺的10×pcr缓冲液5.0μl，浓度为25mm的mgcl2溶液5.0μl，浓度为0.1mm的dntp溶液4.0μl，浓度5u/μl的taq酶溶液0.6μl，浓度都为10μm的上游引物msf溶液和下游引物msr溶液各3.0μl，待测dna模板1.0～5.0μl，ddh2o补齐至50μl。

本发明还提供一种利用杉并根结线虫的pcr检测试剂盒对杉并根结线虫进行鉴定的方法，所述方法为：

提取待测线虫样品的dna作为pcr模板，利用杉并根结线虫的pcr检测试剂盒中的特异性引物作为扩增引物，进行pcr扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现428bp的特异dna条带，则待测线虫为杉并根结线虫，反之则否。

所述pcr扩增的条件如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸6min。

进一步，所述利用杉并根结线虫的pcr检测试剂盒对杉并根结线虫进行鉴定的方法包括如下步骤：

(1)提取待测线虫样品的dna作为pcr模板；

(2)利用杉并根结线虫的pcr检测试剂盒中的特异性引物作为扩增引物，进行pcr扩增，pcr扩增的反应体系如下：

无mg²⁺的10×pcr缓冲液5.0μl，浓度为25mm的mgcl2溶液5.0μl，浓度为0.1mm的dntp溶液4.0μl，浓度5u/μl的taq酶溶液0.6μl，浓度都为10μm的上游引物msf溶液和下游引物msr溶液各3.0μl，待测dna模板1.0～5.0μl，ddh2o补齐至50μl；

pcr扩增的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸6min；

(3)pcr扩增产物进行电泳检测：取出pcr扩增产物5μl，用10g/l琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在428bp处出现扩增条带的为杉并根结线虫，反之则否。

所述步骤(1)中，提取待测线虫样品的dna可按以下步骤进行：

挑取单条线虫放入200μlpcr管中，其中已加有10μl双蒸水和5μl无mg²⁺的10×pcr缓冲液，然后液氮中放置1min或-70度放置0.5h以上，取出后立即85℃加热2min，然后向pcr管中加入1μl1mg/ml蛋白酶k，56℃加热30min以上，95℃加热10min，将pcr管在微型离心机上微离心，得到dna模板。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种杉并根结线虫的pcr检测特异性引物，该特异性引物对日本短体线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为428bp，对其它短体线虫无特异性条带片段，因此可根据凝胶电泳在428bp处有无扩增条带作为鉴定杉并根结线虫的依据，可以检测单个或者混合杉并根结线虫dna样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好。

(2)利用杉并根结线虫pcr检测试剂盒中特异性引物以及pcr反应溶液配方可以制造杉并根结线虫的pcr检测试剂盒；

(3)本发明提供了一种快速、准确鉴定杉并根结线虫的方法，应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成检测，灵敏度高，实用性强，可以对进境种苗中的该线虫进行准确鉴定，对于防止根结线虫非中国种入侵、保护我国农林生产安全具有重要意义。

附图说明：

图1显示的是利用本发明的特异性引物，对9种根结线虫的dna进行pcr扩增后的电泳图，泳道1～9分别为1：杉并根结线虫株系s；2：苹果根结线虫株系m1；3：山茶根结线虫株系c1；4：南方根结线虫株系miyn1；5：北方根结线虫株系mhsd1；6：花生根结线虫majs2；7：爪哇根结线虫mjfj1；8：象耳豆根结线虫mehn2；9：西班牙根结线虫mshm1；泳道m为dna分子量标准，其条带从上至下分别为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。

图2显示的是利用本发明的特异性引物，对梯度稀释的不同浓度的杉并根结线虫幼虫的dna进行pcr扩增后的电泳图。泳道m为dna分子量标准，其条带从上至下分别为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；泳道1～8的杉并根结线虫的dna浓度分别为：1：10ng/μl；2：2ng/μl；3：1ng/μl，4：0.02ng/μl；5：0.01ng/μl；6：0.002ng/μl；7：0.001ng/μl；8：0.0002ng/μl。

具体实施方式：

以下通过具体实验例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1、杉并根结线虫的pcr检测试剂盒

50次或100次反应体系，50μl反应体系包括：无mg²⁺的10×pcr缓冲液5.0μl，浓度为25mm的mgcl2溶液5.0μl，浓度为0.1mm的dntp溶液4.0μl，浓度5u/μl的taq酶溶液0.6μl，浓度都为10μm的上游引物msf溶液和下游引物msr溶液各3.0μl，待测dna模板1.0～5.0μl，ddh2o补齐至50μl。无mg²⁺的10×pcr缓冲液、taq酶液，dntp液购于宝生物工程(大连)有限公司。

实施例2、dna提取方法

挑取单条线虫放入200μlpcr管中[已加有10μl双蒸水和5μl10×pcr缓冲液(无mg²⁺)]，液氮中放置1min(或-70度放置0.5h)，取出后立即85℃加热2min。然后向pcr管中加入1μl1mg/ml蛋白酶k，56℃加热30min，95℃加热10min，将pcr管在微型离心机上微离心，得到dna模板。

实施例3、pcr检测方法

用杉并根结线虫的pcr检测试剂盒进行检测，pcr反应体系为：无mg²⁺的10×pcr缓冲液5.0μl，浓度为25mm的mgcl2溶液5.0μl，浓度为0.1mm的dntp溶液4.0μl，浓度5u/μl的taq酶溶液0.6μl，浓度都为10μm的上游引物溶液和上游引物溶液各3.0μl，dna模板1.0～5.0μl，ddh2o补齐50μl。pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸6min。电泳：将5μlpcr产物用10g/l琼脂糖凝胶电泳分离，经dna染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像，出现大小为428bp的特异性片段，则为杉并根结线虫，在428bp处不出现条带的样品不是杉并根结线虫。

实施例4、准确性和可靠性试验——杉并根结线虫的特异性扩增

用实施例2的提取方法，实施例3的pcr检测方法，分别对表1中的根结线虫群体提取dna，并以dna为模板进行pcr检测，结果只有杉并根结线虫获得特异性扩增产物，其他根结线虫群体均无条带。部分结果如图1所示，其中各泳道分别为：m：dl100分子标记(其条带从上至下分别为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)；1：杉并根结线虫株系s；2：苹果根结线虫株系m1；3：山茶根结线虫株系c1；4：南方根结线虫株系miyn1；5：北方根结线虫株系mhsd1；6：花生根结线虫majs2；7：爪哇根结线虫mjfj1；8：象耳豆根结线虫mehn2；9：西班牙根结线虫mshm1(具体样品信息见表1)。因此，本发明具有很高的特异性，能对杉并根结线虫株系进行有效扩增，而其他近似种均无扩增，保证鉴定结果准确。

实施例5、灵敏度试验——对单条杉并根结线虫幼虫的dna以及梯度稀释dna的特异性扩增

用实施例2的提取方法，提取单条杉并根结线虫的dna，使用测定其浓度，并将模板稀释至10ng/μl，2ng/μl，1ng/μl，0.02ng/μl，0.01ng/μl，0.002ng/μl，0.001ng/μl，0.0002ng/μl，分别以这8种不同浓度的杉并根结线虫的dna作为模板(1.0μl)，按照实施例3的pcr检测方法，同时使用等量的ddh2o为阴性对照，对不同dna浓度下的灵敏度进行测试。实验结果:结果如图2所示，其中各泳道分别为：m：dl100分子标记(其条带从上至下分别为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)；1：10ng/μl；2：2ng/μl；3：1ng/μl，4：0.02ng/μl；5：0.01ng/μl；6：0.002ng/μl；7：0.001ng/μl；8：0.0002ng/μl，结果表明，本发明具有很高的灵敏度，能保证对各种根结线虫虫态进行鉴定，适合在实际应用中推广。

利用本发明提供的方法或试剂盒，可对衫并根结线虫作出快速鉴定，具有很高的可靠性和灵敏度，且操作方便，不依赖操作人员的经验，准确度高，实用性强。

表1实验所用根结线虫群体

序列表

<110>宁波检验检疫科学技术研究院

<120>杉并根结线虫的pcr检测特异性引物及试剂盒

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tggtcgtgtaacggctaac19

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gattttcgcccctcaaacacc21