本发明属于生物技术领域，具体涉及一种臂尾轮属轮虫线粒体cytb基因的部分dna测序方法及鉴定臂尾轮属轮虫的方法。
背景技术：
轮虫(rotifera)是一类营浮游、底栖或周丛生活的小型水生无脊椎动物，一般体长大小在50-2000um之间，属于轮虫动物门。早期的轮虫研究集中于形态学和超微结构，由于轮虫外形的多样，生态习性各不相同，其超微结构和生化性质也缺乏深入的了解，致使其进化途径一直难以定论，随着轮虫研究的深入，已形态学数据已经不能满足轮虫部分种类鉴别和系统进化研究。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种臂尾轮属轮虫线粒体cytb基因的部分dna测序方法及鉴定臂尾轮属轮虫的方法。利用六种臂尾轮属轮虫线粒体基因cytb的部分dna测序来对臂尾轮属轮虫进行鉴定，丰富利用线粒体基因组部分dna测序进行鉴定的方法。解决了利用形态学和超微结构存在的鉴定困难，使得在大规模培养轮虫的过程中，减少种群混杂带来的种群竞争而造成轮虫减产甚至大量死亡的可能性。
本发明采取的技术方案为：
一种臂尾轮属轮虫线粒体cytb基因的部分dna测序方法，包括以下步骤：
(1)提取臂尾轮属轮虫dna；
(2)pcr引物扩增及序列测定，所述pcr引物为cytb1s：5’-twgatytwccttctcchgc-3’；cytb1r：5’-ggwgaygcwgcwggacadcthcc-3’；
(3)系统发生分析。
步骤(2)中，扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火50s，68℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
所述pcr引物中的碱基w、y、h、d均为简并碱基，四者分别代表的正常碱基依次为a/t、c/t、a/t/c、g/a/t，“/”代表“或”的关系。
本发明还提供了根据臂尾轮属轮虫线粒体cytb基因的部分dna序列鉴定臂尾轮属轮虫的方法。
本发明通过对六种臂尾轮属轮虫线粒体基因cytb的部分dna测序来对臂尾轮属轮虫进行鉴定，通过对臂尾轮属轮虫线粒体基因cytb序列的比对，包括a、c、g、t碱基的含量、变异位点、简约信息位点等来对臂尾轮属轮虫进行鉴别，可以在大规模培养轮虫的过程中，减少种群混杂带来的种群竞争而造成轮虫减产甚至大量死亡的可能性，可对红臂尾轮虫、剪形臂尾轮虫、方形臂尾轮虫、镰形臂尾轮虫、裂足臂尾轮虫、矩形臂尾轮虫等臂尾轮虫可进行精确鉴定。
具体实施方式
本鉴定臂尾轮属轮虫的方法所用生物材料为红臂尾轮虫、方形臂尾轮虫、镰形臂尾轮虫、矩形臂尾轮虫、剪形臂尾轮虫、裂足臂尾轮虫，挑取每种轮虫单个个体，单克隆培养，其中红臂尾轮虫、方形臂尾轮虫采用gilbert(1963)配方，其余几种采用原地方水样过滤后作培养液，温度与采集时环境温度基本保持一致，所用食物为以hb-4培养液培养的，处于指数生长期的斜生栅藻，当单个克隆轮虫个体数目达到一定多的量的时候，用25μm孔径滤网滤出轮虫，并以无菌蒸馏水冲洗，eppendof管收集，置于-20℃冰箱保存。
总dna提取：
采用wizardtm基因组dna纯化试剂盒(pormega，usa)提取轮虫dna。将冻存的轮虫从-20℃冰箱中取出，离心数秒，吸去多余水分。加入60μl核裂解液(nuclearlysissolution)，轻弹离心管以使轮虫悬浮均匀，在4℃放置10min，取出。65℃水浴40min。取出冷却至室温，加入20μl蛋白沉降液(proteinprecipitationsolution)，剧烈震荡10s，冰浴5min，13000g离心4min。小心吸取上清，加入60μl异丙醇，2.5μl糖原(20mg/ml，sigma，usa)，小心混匀。-70℃放置30min，13000g离心20min，然后弃去上清，用70％酒精洗涤两次。在无菌室将其吹干，然后加入50μl无菌双蒸水，4℃放置过夜以溶解dna。
pcr扩增及序列测定：
扩增反应在pcr扩增仪上进行。合成pcr引物并将引物送于上海invitrogen公司合成。
pcr设计引物如下cytb1s：5’-twgatytwccttctcchgc-3’、cytb1r：5’-ggwgaygcwgcwggacadcthcc-3’，其中碱基w、y、h、d均为简并碱基，四者分别代表的正常碱基依次为a/t、c/t、a/t/c、g/a/t，“/”代表“或”的关系。
pcr反应体系的总体积为25μl，包括1×lapcrbufferⅱ(mg2+plus)，0.4mmol/ldntp，1.5μmol/l引物，dna模板2μl，1u的takaralataq酶，超纯水补至25μl。扩增反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火50s，68℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增完成后，用bbi试剂盒纯化pcr产物，取6μl于1％的琼脂糖凝胶电泳上检查，其余-20℃保存备用。将纯化产物用takarapmd18-tvector克隆。最后送上海生工测序。
(4)系统发生分析：对测序结果进行处理并分析，序列编辑使用clustalx软件(thompson1999)进行dna序列比对。
(5)通过引物测得轮虫线粒体cytb部分dna序列如下：
红臂尾轮虫(brachionus_rubens)：
ttgatcttccttctccagcaaatttatctgtaaattgaaattatggttctcttcttggtttagtgttagtaattcaattagtttcaggtattgttcttgctactcgtttttctggtcattctgatatttcttttgattctgttattacaatttatcaagatgctaattatggttggcttcttcgattagttcattctactggtgcttcttttttctttttattcatttatttacatattggacgtggtttatactatggttcttatgtgtatcctgaagtttgaaacattggtgttgttatttatcttattttaataggtacagcttttttaggttatgtattaccttgagggcaaatgtcttattgagctgctactgttattactaatcttctttctgctattccttgattaggtcctactttagtagagtgagtttgaggtggttttgctgttggaaatcctactcttactcgtttttttgctttacactatttattaccttttgttgttacagctttagttattttacatattttttatcttcatgtttatggtagatctaatcctttaggggtctcttctaatactaataaagtttctttccattattactattcagttaaagatttatatgtatattttgtttttatgtttgtttttatgttttttactcttaaatatggttattcttttatagatgcagaaaatttcattcctgctaatcctttagttactcctactcatattcaacctgaatggtattttttatttgcttatgctattttacgttctattcctaataaattaggtggtgttttaggattagttcttgcagttatggttttattcttgtttagtatttcttctagaaaattattatttaggggtactatttattctcctttagctcgtttaactttttgatctttagtatctaattttttattattgacttgattgggaagttgtccagctgagtctcc
方形臂尾轮虫(brachionus_quadridentatus)：
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矩形臂尾轮虫(brachionus_leydigi)：
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剪形臂尾轮虫(brachionus_forficula)：
ttgatttaccttctcctgcaaatttgtctgttaattgaaattatggttcgttattaggcctaattttagtcatccaattagtgtcgggtattattttagcgactcgtttttctggtcattctgacctatcttttgattctgttattagaatctaccaagactctaactatggttggcttttacgtttaattcactctacaggtgcttccttttttttctttttcatttatttacatattggtcgtggtttatactacggttcttatatttacacagaagtgtggaacattggtgttctaatttatttagttttaatgggtactgcttttttagggtatgttttaccttgaggtcaaatatcttattgggcagctactgtcattactaatttgttatcagccattccttggcttggttctgttttagttgaatgagtttgaggagggttcgctgttggtaatccaactcttacgcgtttttttgctcttcactacttgcttccttttgttgttactgttatagttctcctacatattttttatctacatttatatggtagatctaacccattaggggtgtcttccaattctaataaggtttcctttcattattattattctgttaaagatttattcgtttattttgtatttttatttatttttatattttttactttaaaatatggttatatttttatagatgcagagaattttattcctgctaatcctttagttactcctactcatattcaacctgaatggtatttcttatttgcatatgctattttgcgttctatccccaacaaattgggtggggtagttgggctattattggctgtttgtgtgttatttgttttcagtgtctcttctagcaaattgttgtttactggaataatatactctcctatttcccgtttagtcttttggtcgttagtttctaattttttattactaacatggttaggtagctgtcctgctgagtctcc
裂足臂尾轮虫(brachionus_diversicornis)：
tagatcttccttctcctgctaatctgtctgttaattgaaattatggttccttactaggccttattttaattattcagttgctatctggtattattttagctacacgtttttcgggtcattcagatatttcttttgactcagttatttccatttaccaagattctaattacggttggttgcttcgtttggtccactcgacaggagcatcttttttctttctttttatttatttgcatattggtcgtggtttgtattatgggtcttatatttaccctgaagtttgaaatattggtgtagttatttatcttattcttatgggcactgcctttttaggctatgttttaccttgagggcaaatgtcctattgagctgctactgtcattactaaccttttatctgctattcctatcttaggttctattttagttgaatgggtttgaggaggttttgctgttgggaaccctacactcactcgtttttttgctttgcactacttgctgccctttttagtttctgctttagttattcttcatattttctatttacacgagtatggtagatctaatcctttagggatctcgtctaatactaataaagtgtcttttcattattactactcagttaaagatctgtatgtttatttcgtatttatatttgtttttatatttttcactttaaagtatggctattcttttatagatgcagagaattttattccagccaacccattggttaccccaactcatattcagccagagtgatatttcttgtttgcttatgcaattcttcgttctattcctaataagctcggtggggtagttggtcttcttttagctgttttagtcttattcgcatttagtgtttcttcaagtaaccttctttttaggggtatgctttattctccattagctcgtcttacattttgatccttagtttctgtgtttcttttattaacctgattagggagatgtcctgctgaatctcc
镰形臂尾轮虫(brachionus_falcatus)：
ttgatttaccttctcctgcaaatttgtctgttaattgaaattatggttcgttattaggcctaattttagtcatccaattagtgtcgggtattattttagcgactcgtttttctggtcattctgacctatcttttgattctgttattagaatctaccaagactctaactatggttggcttttacgtttaattcactctacaggtgcttccttctttttcttttttatttatttacatattggtcgtggtttatactacggttcttatatttacacagaagtgtggaacattggtgttctaatttatttagttttaatgggtactgcttttttagggtatgttttaccttgaggtcaaatatcttattgggcagctactgtcattactaatttgttatcagccattccttggcttggttctgttttagttgaatgggtttgaggagggttcgctgttggtaatccaactcttacgcgtttttttgctcttcactacttgcttccttttgtggttactgttatagttctcctacatattttttatctacatttatatggtagatctaacccattaggggtgtcttccaattctaataaggtttcctttcattattattattctgttaaagatttattcgtttattttgtatttttatttattttcatattttttactctaaaatatggttatatttttatagatgcagagaattttatccctgctaatcctttagtcactcctactcatattcaacctgaatggtatttcttatttgcatatgctattttgcgttctatccccaacaaattgggtggggtagttgggctattattggctgtttgtgtgttatttgttttcagggtctcttctagtaaattgttgtttactgggataatatactctcctatttcccgtttagtcttttggtcgttagtttctaattttttattactaacatggttaggtagctgtcctgctgagtctcc
上述参照实施例对一种臂尾轮属轮虫线粒体cytb基因的部分dna测序方法及鉴定臂尾轮属轮虫的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>安徽师范大学
<120>一种臂尾轮属轮虫线粒体cytb基因的部分dna测序方法及鉴定臂尾轮属轮虫
的方法
<130>1
<160>8
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>19
<212>dna
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<210>2
<211>23
<212>dna
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<400>2
5’-ggwgaygcwgcwggacadcthcc-3’23
<210>3
<211>985
<212>dna
<213>红臂尾轮虫（brachionus_rubens）
<400>3
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<213>方形臂尾轮虫（brachionus_quadridentatus）
<400>4
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<213>矩形臂尾轮虫（brachionus_leydigi）
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<211>985
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<213>剪形臂尾轮虫（brachionus_forficula）
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<213>裂足臂尾轮虫（brachionus_diversicornis）
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<213>镰形臂尾轮虫（brachionus_falcatus）
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