基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法。
背景技术：
：李斯特菌是一种兼性厌氧细菌，主要存在于土壤，在土壤中以死亡和正在腐烂的有机物为食用。其中只有单增李斯特菌(listeriamonocytogenes)和伊氏李斯特菌(listeriaivanovii)是具有致病性，而单增李斯特菌是当中唯一一种人畜共患致病菌。单增李斯特菌广泛存在食品中，在肉类、家禽以及生鲜海鲜食品有非常高的检出率，而且它的平均致死率达到30％，远远超过其他普遍食源性致病菌，例如肠炎沙门氏菌(0.38％)、弯曲杆菌菌属(0.02％～0.1％)和霍乱弧菌(0.005％～0.01％)。目前，我国常规检测方法大多数要经过液体选择性培养基富集，固体选择性培养基分离，最后还要对菌株进行生化鉴定和血清学等过程。这些实验操作繁琐，耗时长，检出率低，大大降低了食品加工工厂、出入境检验检疫以及食品卫生监督效率，同时也影响生鲜食品的感官性状，对整个食品行业都造成了很大的损失。因此，建立单增李斯特菌快速、准确、特体、灵敏度的检测诊断方法是十分必要的。目前对单增李斯特菌的检测方法除了传统的生化鉴定方法，还有一些新兴的核酸快速检测方法和免疫学检测，如聚合酶链式反应(pcr)、实时荧光定量pcr法、恒温扩增技术(lamp)以及elisa酶联免疫试剂盒。这些快速检测方法虽然都具有高特异性、时间短以及灵敏度高等特点，然而普遍存在的问题就是检测成本高，其中免疫学检测需要制备昂贵的单克隆抗体以及对样品的要求非常高，而基于聚合酶链式反应的核酸检测则需要昂贵的恒温设备，甚至是目前应用最广泛的恒温扩增技术lamp也逐步暴露了许多局限性，包括引物设计复杂和假阳性高等问题。虽然这些问题在一定程度上都可以避免，但是为了快速检测技术能够得到更大范围普及，必须克服上诉局限性。聚合酶螺旋反应(polymerasespiralreaction，psr)技术，是一种新兴的恒温扩增技术，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，而且仅需要一对引物、不需要精确的变温设备以及操作简单，因此成本低，非常适合在各种工厂和机构进行现场安全性检测和现场护理测试，在食源性微生物检测领域中有非常广阔的发展前景。因此建立一种针对单增李斯特菌的具有独立知识产权的等温核酸扩增方法具有重要的意义。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物。本发明的另一目的在于提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的试剂盒。本发明的又一目的在于提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的方法。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物，包括检测引物ft和检测引物bt，其核苷酸序列如下所示：检测引物ft:5’-acaccaggagttcccattgcaacctcggagactta-3’(seqidno.1)；检测引物bt：5’-ttacccttgaggaccacagtagcctccagagtgat-3’(seqidno.2)。所述的单增李斯特菌优选为单增李斯特菌atcc19115，单增李斯特菌atcc19116，单增李斯特菌15313，单增李斯特菌atcc19114或单增李斯特菌atcc19113。一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的试剂盒，包括上述基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物。所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物中检测引物ft与bt的浓度均为50μm。所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的试剂盒，还包括如下组分：a、2×反应缓冲液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；b、bstdna聚合酶；c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。组分b中所述的bstdna聚合酶优选为浓度为8u/μl的bstdna聚合酶水溶液。组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mm的氯化锰水溶液；(ii)取25μl50μm的钙黄绿素溶液与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物或基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的试剂盒在检测单增李斯特菌的应用。一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并控制模板dna水溶液的od260/od280值为1.8～2.0；(2)于65℃水浴中保温60分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为26μl反应体系：2×反应缓冲液12.5μl，50μm的检测引物ft和50μm的检测引物bt各0.8μl，dna模板2.0μl，8u/μl的bstdna聚合酶1.0μl，去离子水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有单增李斯特菌；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有单增李斯特菌。步骤(2)中所述的检测引物ft的核苷酸序列如seqidno.1所示，检测引物bt的核苷酸序列如seqidno.2所示。步骤(2)中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mm的氯化锰水溶液；(ii)取25μl50μm的钙黄绿素溶液与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明中所提供的针对单增李斯特菌特异性靶序列hyla所设计的聚合酶螺旋检测鉴定体系，解决现有技术中的方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。(2)本发明的方法可以将检测时间减少到60分钟，同传统环介导等温扩增技术相比速断检测周期，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。同时，本发明还公开了针对单增李斯特菌的特异性靶序列hyla保守区的特异区域设计了一对检测引物，从而保证了检测结果的可靠性。其次，本发明在等温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，在60分钟就可完成结果判读。此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果，操作简便快捷，检测成本较低。本发明的试剂盒及方法特别适用中小型单位及现场检测。附图说明图1为hlya引物筛选实验的电泳结果图；其中，图a为第一套引物(hlya-1)和第二套设计的引物(hlya-2)的扩增结果，图b为第三套引物(hlya-3)的扩增结果；图中，泳道m为dnamarker，泳道1为单增李斯特菌atcc19115，泳道2为单增李斯特菌atcc19116，泳道3为单增李斯特菌atcc15313，泳道4为单增李斯特菌atcc19114，泳道5为单增李斯特菌atcc19113，ng为空白对照。图2为聚合酶螺旋反应技术检测单增李斯特菌的结果图；其中，1为单增李斯特菌atcc19115，2为单增李斯特菌atcc19116，3为单增李斯特菌atcc15313，4为单增李斯特菌atcc19114，5为单增李斯特菌atcc19113，ng为空白对照。图3为特异性检测实验结果图；其中，泳道m：dnamarker，泳道1：单增李斯特菌atcc19115；泳道2：单增李斯特菌atcc19116；泳道3：单增李斯特菌atcc15313；泳道4：单增李斯特菌atcc19114；泳道5：单增李斯特菌atcc19113；泳道6：沙门氏菌atcc29629；泳道7：沙门氏菌atcc19585；泳道8：沙门氏菌atcc14028；泳道9：沙门氏菌atcc13076；泳道10：大肠杆菌e019；泳道11：大肠杆菌e020；泳道12：大肠杆菌e043；泳道13：大肠杆菌atcc43894；泳道14：大肠杆菌atcc43895；泳道15：铜绿假单胞菌atcc27853；泳道16：铜绿假单胞菌atcc10145；泳道17：铜绿假单胞菌atcc9027；泳道18：铜绿假单胞菌atcc15442；泳道19：铜绿假单胞菌atcc19429；泳道20：金黄色葡萄球菌atcc23235；泳道21：金黄色葡萄球菌atcc6358；泳道22：金黄色葡萄球菌atcc12600；泳道23：金黄色葡萄球菌atcc27664；泳道24：金黄色葡萄球菌atcc13565；泳道25：副溶血性弧菌atcc17802；泳道26：副溶血性弧菌atcc27969。图4为敏感性检测实验电泳图；其中，泳道m为dnamarker，泳道1为41ng/μl，泳道2为4.1ng/μl，泳道3为410pg/μl，泳道4为41pg/μl，泳道5为4.1pg/μl，泳道6为410fg/μl，泳道7为41fg/μl，泳道8为阴性对照。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂、材料和菌株均可通过市售获得。实施例1聚合酶螺旋反应检测单增李斯特菌的引物筛选1.设计引物根据psr扩增反应原理，使用primerpremier软件针对hlya靶点设计如表1所示的多组引物。表1引物名称序列(5’-3’)ft-hlya-1ccattcccaagctaaaccgccaggtaacgcaagaaabt-hlya-1ccaaatcgaacccttacccggataaagcgtagtgccft-hlya-2ttacggctttgaaggaagatttgacgctgccgtaagtgbt-hlya-2agaaggaagtttcggcattggttaccgtcgatgatttgft-hlya-3acaccaggagttcccattgcaacctcggagacttabt-hlya-3ttacccttgaggaccacagtagcctccagagtgat加速引物名称序列(5’-3’)if-hlya-1cattctttggcgtaaacib-hlya-1atgaccggaacttaccaif-hlya-2gttctacatcacctgagib-hlya-2ctccgcaaaagatgaag2.建立聚合酶螺旋反应检测方法(1)反应体系①表1中浓度各为50μm的引物对组合。②2×反应储液：由浓度为40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)的混合液组成。③浓度为8u/μl的bstdna聚合酶(bstdnapolymerase,largefragment，购自neb公司)水溶液；(2)检测方法①提取待检样品的细菌dna作为模板dna：以单增李斯特菌atcc19115，atcc19116，atcc15313，atcc19114，atcc19113，共五株菌为研究对象对所设计的引物进行筛选。采用dna提取试剂盒(购自广东东盛生物科技有限公司，货号n1152)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od260/od280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8；以去核酸水做空白对照。②单增李斯特菌的聚合酶螺旋扩增反应：针对靶点hlya，分别在反应管中配置总体积为25μl的聚合酶螺旋扩增反应体系；加入2×反应储液12.5μl，对应的ft与bt(ft-hlya-1与bt-hlya-1、ft-hlya-2与bt-hlya-2、或ft-hlya-3与bt-hlya-3)等体积混合引物混合液1.6μl(如有加速引物，则对应的加速引物if和ib等体积混合液1.6ul)，bstdna聚合酶1μl，dna模板2.0μl，用去离子水补充体积至25μl。此时各物质浓度为：tris-hcl20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween200.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bstdna聚合酶8u，引物ft、bt各1.6μm(如有加速引物，则加速引物if、ib各1.6μm)。将反应管置于65℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。③对扩增结束后的产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，图1为靶点hlya引物筛选的电泳图，靶点hlya对应第一套引物(ft-hlya-1与bt-hlya-1；hlya-1)中只有第五个泳道没有出现扩增条带，第二套设计的引物(ft-hlya-2与bt-hlya-2；hlya-2)只有第三条泳道出现扩增条带。而设计的第三套引物(ft-hlya-3与bt-hlya-3；hlya-3)5条泳道均出现了扩增条带，并且加入去核酸水的泳道ng无条带出现，说明此引物的效果最佳。因此选用第三套引物作为检测hlya靶点的最佳引物。本发明的引物对于五种不同的单增李斯特菌均可实现快速、准确的检出，说明引物适用性好。实施例2基于聚合酶螺旋反应等温扩增技术检测单增李斯特菌(l.monocytogenes)atcc19113的微生物方法1、基于聚合酶螺旋等温扩增技术检测病原微生物的方法，本实施例以单增李斯特菌(l.monocytogenes)atcc19113为例，其使用试剂如下：a.浓度各为50μm的检测引物ft水溶液和bt水溶液引物序列如下(5’-3’)：检测引物ft:acaccaggagttcccattgcaacctcggagactta(seqidno.1)；检测引物bt：ttacccttgaggaccacagtagcctccagagtgat(seqidno.2)；b.2×反应储液：由浓度为40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)的混合液组成；c.浓度为8u/μl的bstdna聚合酶(大片段，neb公司)水溶液；d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配置浓度为50μm的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)；然后取25μl50μm的钙黄绿素溶液，与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。2、使用上述试剂利用聚合酶螺旋反应扩增技术检测单增李斯特菌，包括如下步骤:(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna：本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为五株单增李斯特菌atcc19115(美国菌种保藏中心)，atcc19116，atcc15313，atcc19114，atcc19113；采用dna提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od260/od280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。(2)单增李斯特菌的聚合酶螺旋扩增反应：在反应管中配置总体积为26μl的聚合酶螺旋扩增反应体系；加入2×反应储液12.5μl，检测引物ft与bt等体积混合引物混合液1.6μl，bstdna聚合酶1μl，dna模板2.0μl，用去离子水补充体积至25μl；最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μl，混匀即可。此时各物质浓度为：tris-hcl20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween200.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bstdna聚合酶8u，检测引物ft、bt各1.6μm。将反应管置于65℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。(3)显色检测：待反应结束后，用肉眼观察颜色变化结果如图2所示，结果显示：空白对照组的颜色为黄色，说明检测菌株不含有单增李斯特菌基因；实验组的颜色均变为绿色，说明含有单增李斯特菌基因，随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，阳性组呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。实施例3聚合酶螺旋反应检测单增李斯特菌特异性试验将单增李斯特菌(atcc19115，atcc19116，atcc15313，atcc19114，atcc19113)与其他菌株(沙门氏菌atcc29629；沙门氏菌atcc19585；沙门氏菌atcc14028；沙门氏菌atcc13076；大肠杆菌e019；大肠杆菌e020；大肠杆菌e043；大肠杆菌atcc43894；大肠杆菌atcc43895；铜绿假单胞菌atcc27853；铜绿假单胞菌atcc10145；铜绿假单胞菌atcc9027；铜绿假单胞菌atcc15442；铜绿假单胞菌atcc19429；金黄色葡萄球菌atcc23235；金黄色葡萄球菌atcc6358；金黄色葡萄球菌atcc12600；金黄色葡萄球菌atcc27664；金黄色葡萄球菌atcc13565；副溶血性弧菌atcc17802；副溶血性弧菌atcc27969)的基因组dna按照实施例1中的反应体系(反应体系中引物为ft-hlya-3与bt-hlya-3，即检测引物ft和bt)和条件建立聚合酶螺旋反应检测方法，进行特异性试验。设置含有单增李斯特菌的基因组为阳性对照，超纯水为阴性对照(阴性对照与图1中的空白对照的结果相同)。其中，上述大肠杆菌e019，大肠杆菌e020和大肠杆菌e043可参考文献(周蓉.低温储藏对肠出血大肠杆菌vbnc状态的诱导及毒素表达量的影响研究[d].华南理工大学,2015.)获得。结果如图3所示。结果表明，只有含有单增李斯特菌基因组出现阳性反应，其余均呈现阴性反应。实施例4psr检测单增李斯特菌的敏感性试验将单增李斯特菌的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为41ng/μl，4.1ng/μl，410pg/μl，41pg/μl，4.1pg/μl，410fg/μl，41fg/μl，同时设置阴性对照(去离子水)，按照上述实施例1中的反应体系(反应体系中引物为ft-hlya-3与bt-hlya-3，即检测引物ft和bt)构建聚合酶螺旋反应扩增方法，以确定检测方法的敏感性。结果如图4所示。结果表明：建立的单增李斯特菌聚合酶螺旋反应方法可检测样品中41pg/μl的单增李斯特菌dna。结论：从上述实验结果可以看出，聚合酶螺旋反应扩增方法与常规pcr和荧光pcr具有如下优点：操作和鉴定简便快捷：常规pcr整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量pcr需要1～1.5小时，本发明所提供的检测方法在60分钟就可出现阳性结果。其次对仪器要求低，仅需要一个普通水浴锅，并可以通过荧光染料直接观测检测结果，省去了传统的电泳检测步骤。在快速检测及现场检测的实践中有广泛的应用前景。特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，从而完成了细菌的定性检测。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南理工大学<120>基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>检测引物ft<400>1acaccaggagttcccattgcaacctcggagactta35<210>2<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>检测引物bt<400>2ttacccttgaggaccacagtagcctccagagtgat35<210>3<211>36<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ft-hlya-1<400>3ccattcccaagctaaaccgccaggtaacgcaagaaa36<210>4<211>36<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>bt-hlya-1<400>4ccaaatcgaacccttacccggataaagcgtagtgcc36<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ft-hlya-2<400>5ttacggctttgaaggaagatttgacgctgccgtaagtg38<210>6<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>bt-hlya-2<400>6agaaggaagtttcggcattggttaccgtcgatgatttg38<210>7<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>if-hlya-1<400>7cattctttggcgtaaac17<210>8<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ib-hlya-1<400>8atgaccggaacttacca17<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>if-hlya-2<400>9gttctacatcacctgag17<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ib-hlya-2<400>10ctccgcaaaagatgaag17当前第1页12