一种PSR等温扩增反应检测副溶血性弧菌的引物、试剂盒及其方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的引物、试剂盒及其方法。
背景技术：
：副溶血性弧菌是一种嗜盐性细菌，主要存在于近岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海产品中。人多因食用被副溶血性弧菌污染而又未煮熟的海产品而引起食物中毒，在细菌性食物中毒中比例高，危害大。目前，我国常规检测方法大多数要经过选择性培养，生化鉴定和血清学等反应过程。这些实验操作繁琐，需要耗时5～6天(d)，检出率低、给海产品生产、出入境检验检疫、食品卫生监督等带来困难。我国每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的报道，近年来发病率呈上升趋势。因此，建立副溶血性弧菌快速、准确、特体、灵敏度的检测诊断方法是十分必要的。目前对副溶血性弧菌的检测方法主要有传统的生化鉴定方法，以及分子生物技术的pcr方法，还有以免疫学为主的酶联免疫试剂盒和应用各类生化自动鉴定仪的检测方法，以及最新出现的基因芯片检测手段。近年来发展起来的基因芯片检测及pcr扩增方法具有较强的特异性、快速、灵敏，但是成本较高。免疫学检测方法，如elisa，免疫层析等，灵敏度高，但是操作过程复杂，成本偏高，不宜于大规模检测样品。目前应用最广泛的恒温扩增技术-lamp也有它的局限性，如引物设计复杂、假阳性率高、试剂价高偏高。聚合酶螺旋反应(polymerasespiralreaction,psr)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。因此，建立一种针对副溶血性弧菌新型的具有独立知识产权的等温核酸扩增方法具有重要的意义。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的引物。本发明的另一目的在于提供一种psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的试剂盒。本发明的又一目的在于提供一种psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的方法。该方法具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的引物，包括检测引物ft和检测引物bt，加速引物if和加速引物ib，其核苷酸序列如下所示：检测引物ft:5’-cgtgatgttgtaaccttgcgtgcgaaagtgcttgagat-3’(seqidno.1)；检测引物bt：5’-gcgttccaatgttgtagtgcgatgagcggttgatgtcc-3’(seqidno.2)；加速引物if：5’-tgtgccttgatgaactcgt-3’(seqidno.3)；加速引物ib：5’-ctaacttctgcgcccga-3’(seqidno.4)。所述的副溶血性弧菌优选为副溶血性弧菌atcc17802或副溶血性弧菌atcc27969。一种psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的试剂盒，包括上述psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的引物。所述的psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的引物中的各引物(检测引物ft、bt，以及加速引物if、ib)的浓度均为50μm。所述的psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的试剂盒，还包括如下组分：a、2×反应缓冲液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；b、bstdna聚合酶；c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。组分b中所述的bstdna聚合酶优选为浓度为8u/μl的bstdna聚合酶水溶液。组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液的钙黄绿素与氯化锰的浓度比(摩尔比)为1:8。组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mm的氯化锰水溶液；(ii)取25μl50μm的钙黄绿素溶液与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。所述的psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的引物或psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的试剂盒在检测副溶血性弧菌的应用。一种psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并控制模板dna水溶液的od260/od280值为1.8～2.0；(2)于65℃水浴中保温45～60分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为26μl反应体系：2×反应缓冲液12.5μl，50μm的检测引物ft和50μm的检测引物bt各0.8μl，50μm的加速引物if和ib各0.8ul，dna模板2.0μl，8u/μl的bstdna聚合酶1.0μl，去离子水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有副溶血性弧菌；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有副溶血性弧菌。步骤(2)中所述的检测引物ft的核苷酸序列如seqidno.1所示，检测引物bt的核苷酸序列如seqidno.2所示，加速引物if的核苷酸序列如seqidno.3，加速引物ib的核苷酸序列如seqidno.4所示。步骤(2)中所述的聚合酶螺旋扩增反应的时间优选为45分钟。步骤(2)中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1mm的氯化锰水溶液；(ii)取25μl50μm的钙黄绿素溶液与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明中所提供的针对副溶血性弧菌特异性靶序列tlh所设计的聚合酶螺旋检测鉴定体系，解决现有技术中的方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。(2)本发明的方法可以将检测时间减少到60分钟，同传统环介导等温扩增技术相比速断检测周期，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。同时，本发明还公开了针对副溶血性弧菌的特异性靶序列tlh保守区的特异区域设计了一对检测引物，从而保证了检测结果的可靠性。其次，本发明在等温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，在60分钟就可完成结果判读。此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果，操作简便快捷，检测成本较低。本发明的试剂盒及方法特别适用中小型单位及现场检测。附图说明图1为tlh引物筛选实验的电泳结果图；其中，泳道m为dnamarker，泳道1为副溶血性弧菌atcc17802，泳道2为副溶血性弧菌atcc27969，ng为空白对照。图2为聚合酶螺旋反应技术检测副溶血性弧菌的结果图；其中，ng为空白对照，1为副溶血性弧菌atcc17802，2为副溶血性弧菌atcc27969。图3为通过设计tlh引物加速引物if及ib在扩增时间分别为5min，10min，15min，20min，25min，30min，35min，40min，45min，50min，55min，60min对显色结果判读以及电泳结果的影响图；其中，图a为不同反应时间下电泳图，泳道1～12：反应时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min，泳道m为ds2000marker；图b为不同反应时间下显色反应结果。图4为特异性检测实验结果图；其中，泳道m为dnamarker，泳道1：副溶血性弧菌atcc17802；泳道2：副溶血性弧菌atcc27969；泳道3：大肠杆菌e019；泳道4：大肠杆菌e020；泳道5：大肠杆菌atcc43894；泳道6：大肠杆菌atcc43895；泳道7：沙门氏菌atcc29629；泳道8：沙门氏菌atcc19585；泳道9：沙门氏菌atcc14028；泳道10：沙门氏菌atcc13076；泳道11：单增李斯特菌atcc19116；泳道12：单增李斯特菌atcc15313；泳道13：单增李斯特菌atcc19115；泳道14：单增李斯特菌atcc19113；泳道15：铜绿假单胞菌atcc27853；泳道16：铜绿假单胞菌atcc10145；泳道17：铜绿假单胞菌atcc9027；泳道18：铜绿假单胞菌atcc15442；泳道19：金黄色葡萄球菌atcc23235；泳道20：金黄色葡萄球菌atcc6358；泳道21：金黄色葡萄球菌atcc12600；泳道22：金黄色葡萄球菌atcc27664。图5为敏感性实验结果图；其中，泳道m为dnamarker，泳道1为64ng/μl，泳道2为6.4ng/μl，泳道3为640pg/μl，泳道4为64pg/μl，泳道5为6.4pg/μl，泳道6为640fg/μl，泳道7为64fg/μl，泳道8为阴性对照。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂、材料和菌株均可通过市售获得。实施例1聚合酶螺旋反应检测副溶血性弧菌的引物筛选1.设计引物根据psr扩增反应原理，使用primerpremier软件针对tlh靶点设计如表1所示的多组引物。表1引物名称序列(5’-3’)ft-tlh-1acgccacggttgtagttcattacaaaccagcaaacaccbt-tlh-1tacttgatgttggcaccgcagtccgtcaaacgaatcagft-tlh-2aggtttggttttcttgcgtggaagagccaaccttatcacbt-tlh-2gtgcgttcttttggtttggaccaccagtagccgtcaatft-tlh-3cgtgatgttgtaaccttgcg-tgcgaaagtgcttgagatbt-tlh-3gcgttccaatgttgtagtgc-gatgagcggttgatgtcc加速引物名称序列(5’-3’)if-tlh-1ccaaactcaagcgtaaib-tlh-1agtgaaagcggattatgif-tlh-2atcacttcagacgctgib-tlh-2ctatgttcgctgttggif-tlh-3tgtgccttgatgaactcgtib-tlh-3ctaacttctgcgcccga2.建立聚合酶螺旋反应检测方法(1)反应体系①表1中浓度各为50μm的引物对组合。②2×反应储液：由浓度为40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)的混合液组成。③浓度为8u/μl的bstdna聚合酶(bstdnapolymerase,largefragment，购自neb公司)水溶液；(2)检测方法①提取待检样品的细菌dna作为模板dna：以副溶血性弧菌atcc17802，副溶血性弧菌atcc27969为研究对象对所设计的引物进行筛选。采用dna提取试剂盒(购自广东东盛生物科技有限公司，货号n1152)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od260/od280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为2.0；以去核酸水做空白对照。2○副溶血性弧菌的聚合酶螺旋扩增反应：针对靶点tlh，分别在反应管中配置总体积为25μl的聚合酶螺旋扩增反应体系；加入2×反应储液12.5μl，对应的ft与bt等体积混合引物混合液1.6μl，对应的加速引物if和ib等体积混合液1.6ul，bstdna聚合酶1μl，dna模板2.0μl，用去离子水补充体积至25μl。此时各物质浓度为：tris-hcl20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween200.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bstdna聚合酶8u，引物ft、bt各1.6μm，加速引物if、ib各1.6μm。将反应管置于65℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。③对扩增结束后的产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，图1为靶点tlh引物筛选的电泳图，靶点tlh对应第一套(ft-tlh-1、bt-tlh-1、if-tlh-1和ib-tlh-1；tlh1)和第二套(ft-tlh-2、bt-tlh-2、if-tlh-2和ib-tlh-2；tlh2)设计的引物中均未出现扩增条带，而设计的第三套引物泳道1和2均出现了扩增条带，加入去核酸水的泳道ng无条带出现，说明此引物的效果最佳。因此选用第三套引物(ft-tlh-3、bt-tlh-3、if-tlh-3和ib-tlh-3；tlh3)作为检测tlh靶点的最佳引物。本发明的引物对于两种不同的副溶血性弧菌均可实现快速、准确的检出，说明引物适用性好。实施例2基于聚合酶螺旋反应等温扩增技术检测副溶血性弧菌(v.parahaemolyticus)atcc27969的微生物方法1、基于聚合酶螺旋等温扩增技术检测病原微生物的方法，本实施例以副溶血性弧菌(v.parahaemolyticus)atcc27969为例，其使用试剂如下：a.浓度各为50μm的检测引物ft水溶液和bt水溶液引物、以及加速引物if水溶液、加速引物ib水溶液，其序列如下(5’-3’)：检测引物ft:cgtgatgttgtaaccttgcgtgcgaaagtgcttgagat(seqidno.1)；检测引物bt：gcgttccaatgttgtagtgcgatgagcggttgatgtcc(seqidno.2)；加速引物if：tgtgccttgatgaactcgt(seqidno.3)；加速引物ib：ctaacttctgcgcccga(seqidno.4)。b.2×反应储液：由浓度为40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)的混合液组成；c.浓度为8u/μl的bstdna聚合酶(大片段，neb公司)水溶液；d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配置浓度为50μm的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)；然后取25μl50μm的钙黄绿素溶液，与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。2、使用上述试剂利用聚合酶螺旋反应扩增技术检测副溶血性弧菌，包括如下步骤:(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna：本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为两株副溶血性弧菌atcc17802和atcc27969(美国菌种保藏中心)；采用dna提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od260/od280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为2.0。(2)副溶血性弧菌的聚合酶螺旋扩增反应：在反应管中配置总体积为26μl的聚合酶螺旋扩增反应体系；加入2×反应储液12.5μl，检测引物ft与bt等体积混合引物混合液1.6μl，对应的加速引物if和ib等体积混合液1.6ul，bstdna聚合酶1μl，dna模板2.0μl，用去离子水补充体积至25μl，最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μl，混匀即可。此时各物质浓度为：tris-hcl20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween200.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bstdna聚合酶8u，检测引物ft、bt各1.6μm，加速引物if、ib各1.6μm。将反应管置于65℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。(3)显色检测：待反应结束后，用肉眼观察颜色变化结果如图2所示，结果显示：空白对照组的颜色为黄色，说明检测菌株不含有副溶血性弧菌基因；实验组的颜色变为绿色，说明含有副溶血性弧菌基因，随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，阳性组呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。实施例3反应时间对psr扩增体系的影响psr扩增反应是一种高效、快速的基因检测分析手段，通过设计相应的加速引物可以在1h内获得检测结果。目前对psr反应结果判断的方法主要有肉眼观察法和凝胶电泳验证。而凝胶电泳由于仅可在实验室操作，无法达到现场检测的目的，因此希望构建一种可视化反应体系来拓展psr扩增技术的运用范围。故本实验通过可视化颜色变化辅助电泳验证，确定该反应最佳检测的最佳时间。以副溶血性弧菌tlh靶点构建psr扩增反应体系，探讨在65℃条件下，反应时间对psr扩增体系的影响。(1)参考实施例1的步骤，选择引物ft-tlh-3、bt-tlh-3、if-tlh-3和ib-tlh-3对副溶血性弧菌atcc17802和副溶血性弧菌atcc27969进行psr扩增反应；其中，反应温度为65℃，反应时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min。对扩增结束后的产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图3a所示。(2)参考实施例2的步骤，对副溶血性弧菌atcc17802和副溶血性弧菌atcc27969进行psr扩增反应；其中，反应温度为65℃，反应时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min。待反应结束后，用肉眼观察颜色变化，显色结果如图3b所示。(3)结果分析：结合图3a和3b可知，当扩增反应的时间为40min以上进行psr扩增时，可以发生明显的颜色变化(颜色逐渐变为绿色)，此时反应结果为阳性。扩增产物经2％的琼脂糖电泳结果验证，发现在35min后可以产生梯状条带，表现为阳性结果。如此说明通过设计相应的加速引物if及ib，建立的psr扩增反应体系在60min以内即可获得对反应结果的判读。但通过电泳结果判断反应是否进行以此说明是否含有待检菌株需要耗时约50min，同时在现场检测中无法使用，这与建立快速便捷反应体系的目的不符。因此，开发的建立的psr扩增反应体系以颜色变化来判断反应是否进行。通过设计相应的加速引物及添加钙黄绿素与氯化锰的混合溶液，确定最佳的psr反应扩增时间为45min。实施例4聚合酶螺旋反应检测副溶血性弧菌特异性试验将副溶血性弧菌(副溶血性弧菌atcc17802，副溶血性弧菌atcc27969)与其他菌株(大肠杆菌e019；大肠杆菌e020；大肠杆菌atcc43894；大肠杆菌atcc43895；沙门氏菌atcc29629；沙门氏菌atcc19585；沙门氏菌atcc14028；沙门氏菌atcc13076；单增李斯特菌atcc19116；单增李斯特菌atcc15313；单增李斯特菌atcc19115；单增李斯特菌atcc19113；铜绿假单胞菌atcc27853；铜绿假单胞菌atcc10145；铜绿假单胞菌atcc9027；铜绿假单胞菌atcc15442；金黄色葡萄球菌atcc23235；金黄色葡萄球菌atcc6358；金黄色葡萄球菌atcc12600；金黄色葡萄球菌atcc27664)的基因组dna按照实施例1中反应体系(引物：ft-tlh-3、bt-tlh-3、if-tlh-3和ib-tlh-3)和条件建立聚合酶螺旋反应检测方法，进行特异性试验。设置含有副溶血性弧菌的基因组为阳性对照，超纯水为阴性对照(阴性对照与图1中的空白对照的结果相同)。其中，上述大肠杆菌e019和大肠杆菌e020可参考文献(周蓉.低温储藏对肠出血大肠杆菌vbnc状态的诱导及毒素表达量的影响研究[d].华南理工大学,2015.)获得。结果如图4所示。结果表明，只有含有副溶血性弧菌基因组出现阳性反应，其余均呈现阴性反应。实施例5psr检测副溶血性弧菌的敏感性试验将副溶血性弧菌atcc27969的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为64ng/μl，6.4ng/μl，640pg/μl，64pg/μl，6.4pg/μl，640fg/μl，64fg/μl，同时设置阴性对照(去离子水)，按照上述实施例1中的反应体系构建聚合酶螺旋反应扩增方法(引物：ft-tlh-3、bt-tlh-3、if-tlh-3和ib-tlh-3)，以确定检测方法的敏感性，结果如图5所示。结果表明：建立的副溶血性弧菌聚合酶螺旋反应方法可检测样品中6.4pg/μl的副溶血性弧菌dna。结论：从上述实验结果可以看出，聚合酶螺旋反应扩增方法与常规pcr和荧光pcr具有如下优点：操作和鉴定简便快捷：常规pcr整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量pcr需要1～1.5小时，本发明所提供的检测方法在60分钟就可出现阳性结果。其次对仪器要求低，仅需要一个普通水浴锅，并可以通过荧光染料直接观测检测结果，省去了传统的电泳检测步骤。在快速检测及现场检测的实践中有广泛的应用前景。特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，从而完成了细菌的定性检测。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南理工大学<120>一种psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌的引物、试剂盒及其方法<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>检测引物ft<400>1cgtgatgttgtaaccttgcgtgcgaaagtgcttgagat38<210>2<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>检测引物bt<400>2gcgttccaatgttgtagtgcgatgagcggttgatgtcc38<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>加速引物if<400>3tgtgccttgatgaactcgt19<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>加速引物ib<400>4ctaacttctgcgcccga17<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ft-tlh-1<400>5acgccacggttgtagttcattacaaaccagcaaacacc38<210>6<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>bt-tlh-1<400>6tacttgatgttggcaccgcagtccgtcaaacgaatcag38<210>7<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ft-tlh-2<400>7aggtttggttttcttgcgtggaagagccaaccttatcac39<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>bt-tlh-2<400>8gtgcgttcttttggtttggaccaccagtagccgtcaat38<210>9<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>if-tlh-1<400>9ccaaactcaagcgtaa16<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ib-tlh-1<400>10agtgaaagcggattatg17<210>11<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>if-tlh-2<400>11atcacttcagacgctg16<210>12<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ib-tlh-2<400>12ctatgttcgctgttgg16当前第1页12