一种百香果醋的制备方法与流程

本发明涉及果醋的制备方法，尤其是一种百香果醋的制备方法。

背景技术

百香果(passifloraceae)，学名西番莲，又称巴西果、鸡蛋果，是西番莲科多年生木质藤本植物果实的通称，因其香气浓郁，可散发出菠萝、香蕉等多种水果香味，故得名百香果。它是世界上已知最香的水果之一，被国内外誉为“果汁之王”。研究表明，百香果富含天然活性成分类黄酮是减除烦躁和缓减压力的基本元素，能生津止渴，提神醒脑，食用后能增进食欲，促进消化腺分泌，有助消化。果实中含有多种维生素，能降低血脂，防治动脉硬化，降低血压，其果汁需求量在国际市场上呈供不应求的趋势。

果醋抗氧化作用对预防和治疗高血脂、糖尿病和心血管等疾病具有重要的意义，果醋中不仅有来自水果原料的活性成分，如维生素、黄酮类化合物、多酚、花色苷、胡萝卜素、鞣质类和皂苷类等，还有来自微生物自身的抗氧化酶系和作用产物如抗氧化活性多肽、多糖和一些氨基酸，还有在发酵过程中抗氧化活性物质的转化，都会使其抗氧化活性增强。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种具有良好抗氧化活性百香果醋的制备方法。

为了上述技术目的，本发明提供的技术方案是这样的：一种百香果醋的制备方法，在酒精度4～9％vol的百香果酒接入醋酸菌种子液后，在26～34℃、90～210r/min条件下发酵8～12d后，即得百香果醋。

优选地，所述醋酸菌种子液的加入量为百香果酒体积的4～12％。

优选地，所述醋酸菌种子液的加入量为百香果酒体积的8～11％。

优选地，所述醋酸菌种子液中醋酸菌总数为5.7×10⁶cfu/ml。

优选地，所述百香果酒的酒精度为6～7％vol。

优选地，所述发酵温度为30～32℃。

优选地，所述发酵转速为150～180r/min。

优选地，所述发酵时间为10d。

本发明的有益效果为：百香果醋具有很好的抗氧化性，对dpph、羟自由基有很好的清除能力，并且还原能力高。百香果酒对dpph、羟自由基清除能力弱于百香果汁，说明酒精发酵阶段工艺、产物造成抗氧化能力的损失，然而另一方面则说明了醋酸发酵阶段产生了某些有利于抗氧化的物质。

本发明通过单因素实验和box-behnken设计试验，利用试验设计系统design-expert，通过响应面分析法对百香果发酵工艺几个关键参数及其相互作用进行了探讨，建立了醋酸菌接种量、温度、初始酒精度、转速与百香果醋发酵的工艺模型，通过析因实验、响应面分析法优化获得百香果果醋发酵工艺条件，制备所得的百香果醋总酸含量高，在5g/100ml以上。

附图说明

图1为不同醋酸菌接种量对总酸的影响图；

图2为不同初始酒精度对总酸的影响图；

图3为不同发酵温度对总酸的影响图；

图4为不同转速对醋酸发酵的影响图；

图5为接种量和转速交互影响酒精度的响应面图；

图6为接种量和时间交互影响酒精度的响应面图；

图7为转速和时间交互影响酒精度的响应面图；

图8为四种样品对dpph·清除率的对比图；

图9为四种样品对样品羟自由基清除率的对比图；

图10为四种样品的还原能力对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1

在酒精度4％vol的百香果酒接入百香果酒体积的12％醋酸菌种子液后，在26℃、210r/min条件下发酵8d后，即得百香果醋。

实施例2

在酒精度9％vol的百香果酒接入百香果酒体积的4％醋酸菌种子液后，在34℃、90r/min条件下发酵12d后，即得百香果醋。

实施例3

在酒精度7％vol的百香果酒接入百香果酒体积的11％醋酸菌种子液后，在30℃、166r/min条件下发酵10d后，即得百香果醋。

实施例4

在酒精度6％vol的百香果酒接入百香果酒体积的10％醋酸菌种子液后，在30℃、180r/min条件下发酵8d后，即得百香果醋。

实施例5

在酒精度7％vol的百香果酒接入百香果酒体积的8％醋酸菌种子液后，在32℃、150r/min条件下发酵12d后，即得百香果醋。

实验例1

百香果醋发酵过程中醋酸菌接种量的确定：

在酒精度7％的百香果酒接入百香果酒体积4％、6％、8％、10％、12％的醋酸菌种子液后，在32℃、150r/min的条件下发酵，每隔24h测定总酸含量。

醋酸菌种子液中醋酸菌总数为5.7×10⁶cfu/ml。

不同的醋酸菌接种量在醋酸发酵过程中产酸曲线见图1，接种量直接影响醋酸发酵的原料转化速率和周期，接种量过小或过大都不利于醋酸发酵的进行。

由图1可以看出：接种量为4％和6％时，整体产酸低，发酵前4天，醋酸菌代谢产酸不明显，第5天后才迅速产酸，分别到达第9天和11天后，总酸含量基本保持稳定，最终产酸含量偏低，这可能是由于发酵菌体量少，发酵不充分，产酸能力较弱；接种量为14％时，产酸曲线是先上升后逐渐下降的趋势，产酸效果不理想，这是因为接种量过大，菌体生长繁殖消耗过多的营养物质，导致代谢产酸量低，发酵后期，由于菌体老化，出现逐渐下降的趋势；接种量为12％时，发酵前期产酸迅速，发酵第6天后，发酵产酸基本结束，总酸含量稳定；接种量为8％和10％时，发酵的产酸曲线趋势相同，发酵到11天时，达到最高值，均达到5.1g/100g以上。

结果表明，当醋酸菌的接种量为8％～10％时，最有利于百香果醋发酵。

实验例2

百香果醋发酵过程中初始酒精度的确定：

用水将百香果酒分别稀释成酒精度为4％、5％、6％、7％、8％、9％，并用白砂糖调整糖度为5.6％，使得六个平行的糖度统一，接入10％的醋酸菌种子液，在32℃、150r/min的条件下发酵，每隔24h测定总酸含量。

醋酸菌发酵的主要营养物质是酒精，酒精度越高产酸量越高，但是酒精浓度过高时会抑制醋酸菌的生长和代谢，使产酸量下降，发酵周期延长。不同初始酒精度对发酵过程产酸的影响见图2。

由图2可以看出：不同的初始酒精度，产酸量和发酵周期也不同，酒精度为4％vol、5％vol时，总酸含量低，发酵周期短，分别发酵到5天、7天就结束产酸，由于酒精度偏低，醋酸菌能在短期内彻底消耗酒精产酸，但是产酸量偏低。当酒精度为8％vol时，产酸曲线呈“s”型，发酵前5天，发酵缓慢，产酸量很低，直至第9天，总酸含量不增加，最终产酸量低，这说明8％vol的酒精度对醋酸发酵有抑制作用。当酒精度为6％vol、7％vol时，虽然醋酸发酵周期长，但是最终总酸含量明显提高。

结果表明，初始酒精度范围为6～7％vol时最适合醋酸发酵，可使百香果醋得到较高的酸度。

实验例3

百香果醋发酵过程中温度的确定：

设计5个温度水平分别为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，其他的发酵条件为：接种量10％，初始酒精度7％，转速150r/min，每隔24h测定总酸含量。

醋酸菌的生长温度为25～35℃，温度直接影响到醋酸菌的生长繁殖速度和产酸速度，适合的温度有利于菌体生长和目的产物的生成。不同发酵温度对发酵过程产酸的影响见图3。

由图3可以看出：发酵前7天，各处理组的醋酸发酵正常，产酸量相差不大；第7天以后，温度在26～32℃范围时，随着温度的提高，发酵过程中的产酸量提高，34℃处理组的总酸含量低于其他组别，到发酵后期由于温度偏高，醋酸菌提前老化，故产酸量开始逐渐降低；当温度为32℃时，发酵10天后，醋酸发酵基本结束，总酸含量较高；当温度为30℃时，醋酸发酵至12天，总酸含量最高。

结果表明，温度范围为30～32℃时最适合百香果醋发酵。

实验例4

百香果醋发酵过程中转速的确定：

设计5个转速水平分别为90r/min、120r/min、150r/min、180r/min、210r/min，其他的发酵条件为：接种量10％，初始酒精度7％，发酵温度32℃，每隔24h测定总酸含量。

醋酸菌是好氧微生物，当氧气充足时，菌体生长代谢旺盛，缺氧会抑制发酵的进行。不同的转速对发酵液供氧量则不同，不同转速对发酵过程产酸的影响见图4。

由图4可以看出：转速在90～180r/min时，随着转速的提高，发酵过程中的产酸效率提高，转速为150～180r/min时，最终产酸量较高；当通气量为210r/min时，发酵前5天，其产酸量均高于其他条件，5天后，发酵产酸速率变慢，10天后，总酸出现下降趋势，最终总酸含量也不高，其原因可能是发酵前期由于充足的氧气供应使得醋酸菌大量繁殖代谢，总酸迅速增加，但是发酵后期，由于乙醇和醋酸挥发或者水分的蒸发，对醋酸发酵有不利的影响。

结果表明：转速范围为150～180r/min时最适合百香果醋发酵。

实验例5

析因试验设计：

固定酒精度7％，采用析因实验考察醋酸菌接种量、温度、转速、时间对醋酸发酵的影响，以总酸为评价指标，设计n＝16的析因实验，考察醋酸菌接种量、温度、转速、时间四个因素对百香果醋酸发酵时产酸效果的影响，每个因素取2个水平：低水平用“-1”表示，高水平用“+1”表示，析因实验设计表见1。

表1析因试验设计

实验结果见表2：

表2析因实验结果

对结果进行方差分析，各因素的显著性结果见表3：

表3析因实验方差分析结果

注：**为差异极显著(p<0.01)；*为差异显著(p<0.05)。

由表3可知，其中时间、转速具有极显著效果，接种量影响显著(p值＜0.05)，温度影响不显著，因此确定主要影响醋酸发酵的因素是时间、转速和接种量，并选用其进行响应面实验，固定发酵温度为30℃，进一步确定最优发酵条件及各因素间的交互作用。

实验例6

响应面实验设计：

在单因素实验和析因实验的基础上，采用box-behnken法设计实验，对析因实验筛选出的显著因子进行研究，建立的模型(通常为二次多项式)用于预测获得最大期望响应的水平，响应面实验设计见表4。

表4响应面实验设计

模型的建立和显著性的检查：用box-behnken对醋酸发酵条件进行响应面优化分析实验，实验结果见表5。

用design-expert.8.05软件对响应面实验结果进行多元回归拟合分析，得到预测模型为：总酸(g/100ml)＝5.27+0.25a+0.32b+0.25c-0.13ab-0.18ac-0.27bc-0.12a2-0.28b2-0.20c2。该模型方差分析结果见表6。

根据回归方程做响应面图，考察接种量、转速、时间各因素两两交互对酸度的影响，如图5～7所示。

表5响应面试验设计与结果

表6响应面二次回归方程模型方差分析结果

注：**为差异极显著(p<0.01)；*为差异显著(p<0.05)。

由表6中拟合方程的方差分析可知，该模型具有极显著，p值为0.0008，说明所得方程有意义；模型失拟项p为0.3812＞0.05，失拟项不显著，即所构建的模型与试验的差异较小，拟合性较好。方程的相关系数r²为0.9504，r²adj为0.8918，信噪比为12.250，远大于4，说明实验操作可信，预测值与试验值有较好的相关性，试验误差较小，因此可用此模型分析和预测百香果醋的发酵工艺。

从回归方程模型系数的显著性检验可知，模型的一次项a(p＝0.018)差异显著，b(p＝0.0004)差异极显著，c(p＝0.0017)差异极显著；二次项a²(p＝0.1251)差异不显著，b²(p＝0.0053)差异极显著，c²(p＝0.0241)差异显著；交互项ac(p＝0.0432)差异显著，bc(p＝0.007)差异极显著，bc(p＝0.1070)差异不显著，说明接种量、转速、时间对醋酸发酵的影响明显，接种量和时间、转速和时间之间的交互明显。

结果表明，比较f值大小可知各因素影响醋酸发酵精度的主次因素顺序为：转速(b)＞接种量(a)＞时间(c)。

由图5～7可知，该结果与单因素实验结果一致，随着因素值的增大，总酸呈先逐渐增大后保持稳定的趋势，同时各因素的显著性与析因实验结果一致。由design-expert.8.05软件综合分析处理得到的最佳发酵条件为：接种量为：11.10％，转速为166.34r/min，时间为10.01d，在此条件下，百香果醋发酵产酸的理论值为5.42g/100ml。为了检验模型的准确性及实用性，将工艺参数修正为：接种量为11％，转速为166r/min，时间为10d，并进行百香果醋发酵验证试验，重复3次，最终结果为5.37g/100ml，与最优条件下的理论值接近。

实验例7

百香果醋质量评价：

按照gb/t18187-2000酿造食醋要求，对实施例5所制得的百香果醋的理化、卫生指标进行检测评定，结果见表7-8：

表7百香果醋理化检测结果

表8百香果醋卫生指标检测结果

本发明通过单因素实验和box-behnken设计实验，利用实验设计系统design-expert，通过响应面分析法对百香果发酵工艺几个关键参数及其相互作用进行了探讨，建立了醋酸菌接种量、温度、初始酒精度、转速与百香果醋发酵的工艺模型。通过析因实验、响应面分析法优化获得百香果果醋发酵工艺条件，得出最佳的发酵工艺参数，所得百香果醋总酸含量为5.365g/100ml，所得实验值与理论值相对误差小，经检测分析该百香果醋质量符合国家标准，说明经响应面分析方法优化获得的工艺参数是可信的，具有较好的实用价值。

实验例8

将实施例5所制得的百香果醋进行dpph自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力评价其抗氧化能力，与百香果汁和百香果酒相比较，讨论了不同发酵程度对体外抗氧化能力的影响；与此同时，与苹果醋对比，探讨不同原料对抗氧化能力的影响，为百香果醋功能饮品的发展提供理论依据。

1.样品预处理

百香果汁：按下述酶解工艺对百香果进行酶解：添加总酶量为0.12％，酶比5:1，酶解温度50℃，酶解时间3.5h，ph4.0；将酶解结束后的百香果酶解液，用经8层纱布过滤、4000r/min离心10min后，取上清液作为试验样液。

百香果酒：按下述发酵工艺制备百香果酒：酵母接种量0.05％，初始糖度21.8％，发酵时间6d，发酵温度29℃；经8层纱布过滤、4000r/min离心10min后，取上清液作为试验样液。

假定未稀释样液百香果汁、百香果酒、百香果醋、苹果醋的体积分数为100％，实验时用蒸馏水稀释至所需浓度。

2.抗氧化能力测试实验

2.1dpph自由基清除能力的实验

dpph溶液：准确称取dpph0.0468g，用无水乙醇定容于500ml容量瓶内，充分摇匀，制得dpph溶液浓度为2.0×10^-4mol/l，于4℃冰箱内避光保持，备用。

样品测定：准确移取的dpph溶液1ml，加入不同质量分数(5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％)的果汁/果酒/果醋0.6ml，充分混匀，避光放置30min后，3000r/min离心，取上清液，于517nm处测定吸光值，对照组以等体积的无水乙醇代替dpph溶液；空白组以等体积的蒸馏水代替样品液，并以等体积的乙醇-水溶液空白调零，平行测定3次,取平均值，按下式计算dpph自由基的清除率：

c％＝[1-(ai-aj)/a0]×100％

式中：c为dpph·的清除率(％)；ai为样品组的吸光度；aj为对照组的吸光度；a0为空白组的吸光度。

根据浓度与dpph清除率的关系，计算出ic50值，并利用duncan多重检验分析样品间的差别情况及显著性。

2.2羟自由基清除能力实验

依次向具塞试管中准确移取0.15mol/lfes04溶液0.5ml、2mmol/l水杨酸溶液2.0ml、蒸馏水2.5ml和不同质量分数(5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％)的果汁/果酒/果醋1ml，充分摇匀，最后加入6mmol/lh2021.0ml启动反应，37℃下反应1h，3000r/min离心,取上清液，在510nm处测定吸光值ai。aj为平行测定3次，取平均值，按下式计算不同样液对oh清除率：

e％＝[a0-(ai-aj)]/a0×100％

式中：e为羟自由基的清除率(％)；ai为含水杨酸样品液的吸光度；aj为不含杨酸溶液时样品液的吸光度；a0为空白对照液的吸光度。

根据浓度与羟自由基清除率的关系，计算出ic△50值，并利用duncan多重检验分析样品间的差别情况及显著性。

2.3还原能力的实验

准确移取不同质量分数(5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％)的果汁/果酒/果醋1ml，依次向具塞试管中加入0.2mol/l、ph6.6的磷酸缓冲溶液0.2ml和质量浓度为1％k3fe(cn)60.5ml，振荡混匀，50℃下水浴20min后取出，流水快速冷却，再加入10％三氯乙酸1ml终止反应，3000r/min下离心10min，取上清液1.5ml，加入质量浓度为l％fecl30.2ml和蒸馏水3.0ml，充分摇匀，静置5min后，于700nm处测定吸光值。平行测定3次，取平均值。吸光值表示还原能力的大小，吸光值越大，还原能力越强。一般而言，还原能力越强的物质，其抗氧化能力也相应增强。

3.结果与分析

实验数据统计分析：均采用exel、spss软件数据统计、处理，origin绘图。duncan多重比较检验试验组间差异情况，用标字母法(a、b、c)表示，差异不显著标志同一字母。

3.1dpph自由基清除能力的对比

dpph是一种稳定以氮为中心的有机自由基，通常用来检测样品抗氧化能力，在517nm处有最大吸收峰，如果样品具有清除其能力时，自由基会释放质子或被还原，它的孤电子被配对，溶液颜色继续变浅，此时，该样品溶液的颜色由紫色变成淡黄色，样品颜色的变化与清除自由基的能力程度呈一定的关系。因此用分光光度计法测定清除率来表示某种物质对自由基的清除能力，清除率越大，表明该物质抗氧化的能力越强。四种样液不同体积浓度对dpph自由基清除能力如图8所示。

从图8中可以看出，四种样液对dpph自由基的清除能力具有较好的作用，特别是百香果醋，当百香果醋浓度20％时，dpph自由基清除率超过90％，浓度达25％时，dpph自由基清除率达100％以上；随着四种样液浓度的增加，dpph清除能力明显增强，体积浓度低于15％时，百香果醋与百香果汁的dpph清除能力相当，百香果酒的清除能力低于百香果醋、百香果汁；当浓度低于30％，苹果醋的dpph清除能力均低于百香果醋、百香果汁、百香果酒。

同时，有研究用ic50来评价抗氧化剂对自由基的清除能力和抗氧化作用，即dpph自由基清除率达50％时样品的浓度用ic50表示，四种样液的ic50值及样品间的差异显著性如表9所示。

表9四种样品的ic50及差异显著性

ic50值越低则说明抗氧化能力越强，从表9中可以看出各样品ic50值大小，对比ic50值大小说明各样品对dpph的清除能力的强弱为：百香果醋＞百香果汁＞百香果酒＞苹果醋。百香果醋与苹果醋之间有显著性差异，且百香果醋清除dpph能力的作用比苹果醋的高出一倍以上，说明百香果醋具有较好的抗氧化能力，可能由于果醋不同的发酵方式、原料所提供的具有抗氧化能力物质不同或含量不同造成dpph清除能力的差别；百香果汁与百香果酒存在显著性差异，说明百香果酒的清除dpph的能力明显低于百香果汁，可能由于酒精发酵过程酵母菌大量繁殖、物质代谢转化造成了抗氧化成分的损失，导致发酵液抗氧化性能下降，百香果醋与百香果汁的清除dpph能力没有显著性差异，但是显著优于百香果酒，说明醋酸发酵过程可能产生了某些代谢产物，有利于清除dpph自由基，即果醋酿造过程中醋酸量积累，酸度上升，提供了更多带正电的氢离子，进而提高了自由基的清除率。

3.2羟自由基清除能力的对比

在fenton反应体系中产生羟自由基：fe²⁺+h2o2→fe³⁺+oh⁺+·oh，·oh反应活性很强，存活时间短，水杨酸能捕获·oh，产生有色物质，若样品具有清除·oh自由基的能力，会与·oh作用，则水杨酸与·oh的作用降低，最终有色产物生成量减少，从而可以利用此原理来得到羟自由基的清除率。四种样液不同体积浓度对羟自由基清除能力如图9所示。

由图9可知，四种样液的羟自由基清除能力较好，随着浓度的增大，清除率不断提高，最终羟自由基清除率均能达到90％以上；其中百香果醋对羟自由基清除能力最好，当浓度为25％时，羟自由基清除率达到了93.7％，而百香果汁、百香果酒、苹果醋清除率分别为83.9％、67.6％、73.9％，说明百香果醋具有较好的清除羟自由基的能力。

用ic△50表示其抗氧化活性强弱，四种样液的ic△50值及样品间的差异显著性如表10所示。

表10四种样品的ic△50及差异显著性

注：a、b、c表示差异显著性，不同字母表示差异显著。

从表10中看出，各样品的ic△50值大小顺序为：苹果醋＞百香果酒＞百香果汁＞百香果醋，ic△50值越小说明抗氧化活性越强，则可知四种样液抗氧化能力强弱顺序为百香果醋＞百香果汁＞百香果酒＞苹果醋；比较样品间的差异显著性，可知百香果醋显著优于其他三个样品，而百香果酒与苹果醋的抗氧化能力没有显著性差异。

3.3还原能力的对比

还原能力越强的物质，其抗氧化能力也相应增强。如果样品具有还原能力，会将fe³⁺还原为fe²⁺，并产生普鲁士蓝，在700nm下测定吸光值，吸光值越大说明还原能力越强，即抗氧化能力越好。四种样品在不同浓度下测定还原能力如图10所示。

从图10可以看出样液浓度增大，还原能力也相应的增强，其中苹果醋的还原能力远远低于百香果醋、百香果汁、百香果酒；浓度低于10％时，百香果汁、百香果酒、百香果醋的还原能力相当，超过10％以后，百香果醋的还原能力明显高于百香果汁、百香果酒。

通过抗氧化性对比实验，发现从百香果汁酒精发酵、醋酸发酵得到的百香果醋具有很好的抗氧化性，对dpph、羟自由基有很好的清除能力，并且还原能力高；百香果酒对dpph、羟自由基清除能力弱于百香果汁，说明酒精发酵阶段工艺、产物造成抗氧化能力的损失，然而另一方面则说明了醋酸发酵阶段产生了某些有利于抗氧化的物质。苹果醋的dpph清除能力、羟自由基清除能力、还原能力均弱于百香果醋。

因此，选用百香果为原料发酵百香果醋拥有良好的抗氧化活性，具有开发应用价值。