本发明属于质粒提取
技术领域：
，具体涉及一种大肠杆菌质粒dna的提取方法。
背景技术：
：质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是dna重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞（大肠杆菌）中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。研究发现，提取的质粒一般有超螺旋、线形和开环三种构象。在用质粒转染时，超螺旋比例高时其转染效率及表达量较高，普遍认为超螺旋质粒dna在基因治疗和dna疫苗中是起主要作用的质粒载体形式。细菌的培养作为生产超螺旋质粒dna的第一步，在整个生产过程中起着关键的作用。它兴驻直接影响到超螺旋质粒dna的产量，而且也影响下续步骤的进行。因此，选择和优化菌体的生长条件，是产生大量稳定的超螺旋质粒dna必要条件，特别是培养基的组成成分和浓度对细菌的生长和超螺旋质粒dna的含量有较大的影响。从原核生物中提取和纯化质粒dna的经典方法，步骤依次为：菌体裂解、质粒分离和纯化。配套方法的，目前国内外很多生物试剂公司如碧云天、生工、天根等都研制推出了质粒提取的试剂盒，这些试剂盒以碱裂解结合纯化柱来分离提取质粒，利用质粒与硅胶纯化柱的吸附作用纯化质粒。其中的菌体裂解步骤，多采用碱裂解法，碱裂解法质粒dna纯化技术是1979年由birnboim&doly发明，其操作包括三种溶液处理，需要第一步悬浮菌体，第二步碱和sds变性裂解和第三步质粒复性，然后才能上离心柱，提取过程一般需要20分钟左右的时间，实验周期相对较长，且超螺旋质粒含量低，影响了研究者的实验进程。并且现有的质粒dna提取效率低，菌液的表达量很低，所提取的有效质粒的含量也很低，严重限制质粒dna的应用。技术实现要素：本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种大肠杆菌质粒dna的提取方法。本发明是通过以下技术方案实现的：一种大肠杆菌质粒dna的提取方法，包括如下步骤：（1）纯化培养：选取大肠杆菌dh5α菌株，采用平板划线的方法将选取的dh5α菌株接种于含氨苄青霉素的lb固体培养基的平板上，静置20~30min后，将接种后的平板封口后倒置于培养箱内进行培养；（2）扩大培养：待步骤（1）中的平板上长出单菌落，菌落的大小达到0.5~0.6mm时，取出平板，挑取单菌落接种于4~5l含氨苄青霉素的lb液体培养基中，然后将接种后lb液体培养基置于摇床内进行培养，在培养的同时进行光波声波交替处理；（3）预混液的制备：将溶液ⅰ和溶液ⅱ按照体积比为1:1.6~2共同投入无菌离心管中，摇匀后置于冰上进行冰浴4~6min，然后量取溶液ⅰ和溶液ⅱ总体积45~55%的溶液ⅲ投入装有将溶液ⅰ和溶液ⅱ的无菌离心管中，摇匀后置于冰上进行冰浴2~3min，最后置于4~6℃环境中保存备用，预混液的制备过程在稳恒磁场中进行，稳恒磁场的强度为1800~2000gs；（4）大肠杆菌的裂解：a.等到步骤（2）中的菌液od600达到0.9~1时，量取1~2份菌液置于离心管中进行离心处理，离心机的转速为4000~5000rpm，离心后弃去上清；b.量取0.4~0.5份步骤（3）所得的预混液投入操作a的离心管中，轻轻翻转摇匀后，置于冰上进行冰浴6~7min；（5）质粒dna的分离：a.将步骤（4）操作b中所得的混合液置于离心机内进行离心，离心机的转速为4000~5000rpm，离心处理13~17min后，取上清置于新的无菌离心管中；b.向操作a的新的无菌离心管中加入等体积的异戊醇，摇匀后室温静置8~10min，然后以5000~6000rpm的转速进行离心15~17min后，去上清；（6）质粒dna的收集：将步骤（5）操作b中得到的沉淀用75%的酒精清洗2~3次后，将沉淀自然风干至含水率为12~16%，然后加入40~50μlte缓冲液溶解即可。进一步的，所述步骤（1）中纯化培养时，培养箱内的温度设置为36~38℃。进一步的，所述步骤（2）中摇床的转速设置为140~160rpm，摇床内的温度设置为28~30℃。进一步的，所述步骤（2）中光波交替处理的程序为：首先用20~24khz的超声波处理10~20min，然后用475~485nm的蓝光照射14~18min。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅰ各成分及其对应重量份为：50mm葡萄糖7~8份、25mm三（羟甲基）氨基甲烷8~9份、10mm乙二胺四乙酸2~3份。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅱ各成分及其对应重量份为：0.2m氢氧化钠4~5份、1%十二烷基硫酸钠1~2份。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅲ各成分及其对应重量份为：3m醋酸钾5~6份，2m醋酸4~6份、75%酒精9~10份。本发明在现有的质粒dna提取的方法上做了很大的改进，细菌的培养作为生产超螺旋质粒dna的第一步，在整个生产过程中起着关键的作用。它兴驻直接影响到超螺旋质粒dna的产量，而且也影响下续步骤的进行。因此，选择和优化菌体的生长条件，是产生大量稳定的超螺旋质粒dna必要条件，特别是培养基的组成成分和浓度对细菌的生长和超螺旋质粒dna的含量有较大的影响。因此，本发明在菌液扩大培养的过程中，打破了常规的培养条件，常规的菌液培养时，将温度设置为35~38℃，大肠杆菌繁殖比较快，但是对于有效菌或者说单位菌液所表达的超螺旋质粒的含量非常低，申请人在大量的实验中发现，将菌液扩大培养时的温度控制为28~30℃，同时进行特定频率的超声波和特定波长的光波交替处理，促进菌体对培养基中营养成分的吸收，并且有助于超螺旋质粒dna处于拓扑缠绕状态，在菌液提取中，更容易沉淀，进而提高单位质量中超螺旋质粒dna的比重。常规的裂解过程分为三个步骤，需要第一步悬浮菌体，第二步碱和sds变性裂解和第三步质粒复性，然后才能上离心柱，提取过程一般需要20分钟左右的时间，实验周期相对较长，且超螺旋质粒含量低，本发明在菌液培养的过程中，制备预混液，首先将溶液ⅰ和溶液ⅱ按照一定的体积比进行混匀冰浴，再加入溶液ⅲ进行混匀，在稳恒磁场的辅助作用下，三种溶液快速融合，提高了其对菌液细胞的裂解效果，提高了质粒提取的效率和质粒的质量，加快了质粒提取的进程。本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种大肠杆菌质粒dna的提取方法，整个过程科学合理，提高了单位菌液中质粒的含量和单位质量质粒中超螺旋质粒dna的含量，并且耗时短，很好的推动了质粒dna的市场推广应用性。具体实施方式实施例1一种大肠杆菌质粒dna的提取方法，包括如下步骤：（1）纯化培养：选取大肠杆菌dh5α菌株，采用平板划线的方法将选取的dh5α菌株接种于含氨苄青霉素的lb固体培养基的平板上，静置20min后，将接种后的平板封口后倒置于培养箱内进行培养；（2）扩大培养：待步骤（1）中的平板上长出单菌落，菌落的大小达到0.5mm时，取出平板，挑取单菌落接种于4l含氨苄青霉素的lb液体培养基中，然后将接种后lb液体培养基置于摇床内进行培养，在培养的同时进行光波声波交替处理；（3）预混液的制备：将溶液ⅰ和溶液ⅱ按照体积比为1:1.6共同投入无菌离心管中，摇匀后置于冰上进行冰浴4min，然后量取溶液ⅰ和溶液ⅱ总体积45%的溶液ⅲ投入装有将溶液ⅰ和溶液ⅱ的无菌离心管中，摇匀后置于冰上进行冰浴2min，最后置于4℃环境中保存备用，其中预混液的制备过程在稳恒磁场中进行，稳恒磁场的强度为1800gs；（4）大肠杆菌的裂解：a.等到步骤（2）中的菌液od600达到0.9时，量取1份菌液置于离心管中进行离心处理，离心机的转速为4000rpm，离心后弃去上清；b.量取0.4份步骤（3）所得的预混液投入操作a的离心管中，轻轻翻转摇匀后，置于冰上进行冰浴6min；（5）质粒dna的分离：a.将步骤（4）操作b中所得的混合液置于离心机内进行离心，离心机的转速为4000rpm，离心处理13min后，取上清置于新的无菌离心管中；b.向操作a的新的无菌离心管中加入等体积的异戊醇，摇匀后室温静置8min，然后以5000rpm的转速进行离心15min后，去上清；（6）质粒dna的收集：将步骤（5）操作b中得到的沉淀用75%的酒精清洗2次后，将沉淀自然风干至含水率为12%，然后加入40μlte缓冲液溶解即可。进一步的，所述步骤（1）中纯化培养时，培养箱内的温度设置为36℃。进一步的，所述步骤（2）中摇床的转速设置为140rpm，摇床内的温度设置为28℃。进一步的，所述步骤（2）中光波交替处理的程序为：首先用20khz的超声波处理10min，然后用475nm的蓝光照射14min。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅰ各成分及其对应重量份为：50mm葡萄糖7份、25mm三（羟甲基）氨基甲烷8份、10mm乙二胺四乙酸2份。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅱ各成分及其对应重量份为：0.2m氢氧化钠4份、1%十二烷基硫酸钠1份。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅲ各成分及其对应重量份为：3m醋酸钾5份，2m醋酸4份、75%酒精9份。实施例2一种大肠杆菌质粒dna的提取方法，包括如下步骤：（1）纯化培养：选取大肠杆菌dh5α菌株，采用平板划线的方法将选取的dh5α菌株接种于含氨苄青霉素的lb固体培养基的平板上，静置25min后，将接种后的平板封口后倒置于培养箱内进行培养；（2）扩大培养：待步骤（1）中的平板上长出单菌落，菌落的大小达到0.55mm时，取出平板，挑取单菌落接种于4.5l含氨苄青霉素的lb液体培养基中，然后将接种后lb液体培养基置于摇床内进行培养，在培养的同时进行光波声波交替处理；（3）预混液的制备：将溶液ⅰ和溶液ⅱ按照体积比为1:1.8共同投入无菌离心管中，摇匀后置于冰上进行冰浴5min，然后量取溶液ⅰ和溶液ⅱ总体积50%的溶液ⅲ投入装有将溶液ⅰ和溶液ⅱ的无菌离心管中，摇匀后置于冰上进行冰浴2.5min，最后置于5℃环境中保存备用，其中预混液的制备过程在稳恒磁场中进行，稳恒磁场的强度为1900gs；（4）大肠杆菌的裂解：a.等到步骤（2）中的菌液od600达到0.95时，量取1.5份菌液置于离心管中进行离心处理，离心机的转速为4500rpm，离心后弃去上清；b.量取0.45份步骤（3）所得的预混液投入操作a的离心管中，轻轻翻转摇匀后，置于冰上进行冰浴6.5min；（5）质粒dna的分离：a.将步骤（4）操作b中所得的混合液置于离心机内进行离心，离心机的转速为4500rpm，离心处理15min后，取上清置于新的无菌离心管中；b.向操作a的新的无菌离心管中加入等体积的异戊醇，摇匀后室温静置9min，然后以5500rpm的转速进行离心16min后，去上清；（6）质粒dna的收集：将步骤（5）操作b中得到的沉淀用75%的酒精清洗2次后，将沉淀自然风干至含水率为14%，然后加入45μlte缓冲液溶解即可。进一步的，所述步骤（1）中纯化培养时，培养箱内的温度设置为37℃。进一步的，所述步骤（2）中摇床的转速设置为150rpm，摇床内的温度设置为29℃。进一步的，所述步骤（2）中光波交替处理的程序为：首先用22khz的超声波处理15min，然后用480nm的蓝光照射16min。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅰ各成分及其对应重量份为：50mm葡萄糖7.5份、25mm三（羟甲基）氨基甲烷8.5份、10mm乙二胺四乙酸2.5份。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅱ各成分及其对应重量份为：0.2m氢氧化钠4.5份、1%十二烷基硫酸钠1.5份。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅲ各成分及其对应重量份为：3m醋酸钾5.5份，2m醋酸5份、75%酒精9.5份。实施例3一种大肠杆菌质粒dna的提取方法，包括如下步骤：（1）纯化培养：选取大肠杆菌dh5α菌株，采用平板划线的方法将选取的dh5α菌株接种于含氨苄青霉素的lb固体培养基的平板上，静置30min后，将接种后的平板封口后倒置于培养箱内进行培养；（2）扩大培养：待步骤（1）中的平板上长出单菌落，菌落的大小达到0.6mm时，取出平板，挑取单菌落接种于5l含氨苄青霉素的lb液体培养基中，然后将接种后lb液体培养基置于摇床内进行培养，在培养的同时进行光波声波交替处理；（3）预混液的制备：将溶液ⅰ和溶液ⅱ按照体积比为1:2共同投入无菌离心管中，摇匀后置于冰上进行冰浴6min，然后量取溶液ⅰ和溶液ⅱ总体积55%的溶液ⅲ投入装有将溶液ⅰ和溶液ⅱ的无菌离心管中，摇匀后置于冰上进行冰浴3min，最后置于6℃环境中保存备用，其中预混液的制备过程在稳恒磁场中进行，稳恒磁场的强度为2000gs；（4）大肠杆菌的裂解：a.等到步骤（2）中的菌液od600达到1时，量取2份菌液置于离心管中进行离心处理，离心机的转速为5000rpm，离心后弃去上清；b.量取0.5份步骤（3）所得的预混液投入操作a的离心管中，轻轻翻转摇匀后，置于冰上进行冰浴7min；（5）质粒dna的分离：a.将步骤（4）操作b中所得的混合液置于离心机内进行离心，离心机的转速为5000rpm，离心处理17min后，取上清置于新的无菌离心管中；b.向操作a的新的无菌离心管中加入等体积的异戊醇，摇匀后室温静置10min，然后以6000rpm的转速进行离心17min后，去上清；（6）质粒dna的收集：将步骤（5）操作b中得到的沉淀用75%的酒精清洗3次后，将沉淀自然风干至含水率为16%，然后加入50μlte缓冲液溶解即可。进一步的，所述步骤（1）中纯化培养时，培养箱内的温度设置为38℃。进一步的，所述步骤（2）中摇床的转速设置为160rpm，摇床内的温度设置为30℃。进一步的，所述步骤（2）中光波交替处理的程序为：首先用24khz的超声波处理20min，然后用485nm的蓝光照射18min。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅰ各成分及其对应重量份为：50mm葡萄糖8份、25mm三（羟甲基）氨基甲烷9份、10mm乙二胺四乙酸3份。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅱ各成分及其对应重量份为：0.2m氢氧化钠5份、1%十二烷基硫酸钠2份。进一步的，所述步骤（3）中溶液ⅲ各成分及其对应重量份为：3m醋酸钾6份，2m醋酸6份、75%酒精10份。对比实施例1本对比实施例1与实施例2相比，省去步骤（2）中的光波声波交替处理，除此外的方法步骤均相同。对比实施例2本对比实施例2与实施例2相比，省去步骤（3）预混液的制备中的稳恒磁场，除此外的方法步骤均相同。对照组申请号为：201510529938.7公开的一种质粒dna提取方法。为了对比本发明效果，选取dh5α菌株作为实验对象，然后分别用实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对照组的方法培养大肠杆菌并提取质粒dna，并测定相关指标，质粒含量采用紫外分光光度计测定260nm波长的a值确定。质粒纯度的测定采用紫外分光光度计测定260nm、280nm波长的吸收比值确定（符合质量标准的比值应在1.75-1.85之间）并进行琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统扫描，并分析超螺旋质粒的比例（符合质量标准的超螺旋比值应>90％）。具体实验对比数据如下表1所示：表1单位体积收菌量（g/l）单位体积质粒含量和（mg/l）单位菌量质粒含量（mg/g）a260/a280超螺旋比例（%）实施例2189.564732.501.8394对比实施例1185.434132.231.8384对比实施例2189.564242.241.8179对照组184.794162.251.8483由上表1可以看出，本发明提供了一种大肠杆菌质粒dna的提取方法，整个过程科学合理，提高了单位菌液中质粒的含量和单位质量质粒中超螺旋质粒dna的含量，并且耗时短，很好的推动了质粒dna的市场推广应用性。当前第1页12