一种草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因及其表达蛋白和应用的制作方法

本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因及其表达蛋白和应用。

技术背景

草莓(fragaria×ananassaduch.)是蔷薇科草莓属的多年生草本植物，果实色泽鲜艳，芳香浓郁，酸甜适口，具有较高的营养和保健价值，有“水果皇后”的美誉。草莓果实被证明具有强抗氧化活性，与果实中所含的多酚化合物尤其是花青苷有关；同时，花青苷是构成草莓果实颜色的主要色素，对于形成果实外观品质至关重要；此外，花青苷还具有重要的生物学功能，如能够保护植物本身抵抗紫外线、低温和病虫害等。因此，开展花青苷在草莓果实内的代谢和累积等相关研究，具有十分重要的意义。

花青苷在草莓果实内的代谢和累积情况取决于其在细胞质中的生物合成以及在液泡中的转运贮藏过程；其中，花青苷生物合成是由一系列结构基因的催化以及受myb、bhlh和wd40等转录因子的协同调控。然而，花青苷从细胞质被转运至液泡的过程仍不清楚。

研究发现，花青苷转运过程与谷胱甘肽转移酶转运蛋白密切相关，花青苷转运机制是由位于细胞质的谷胱甘肽转移酶(glutathiones-transferase,gst)和位于液泡膜上的多药耐药抗性相关蛋白(multidrugresistanceassprotein,mrp)共同调控。花青苷在细胞质合成后，gst催化谷胱甘肽(glutathione,gsh)和花青苷共价结合，形成谷胱甘肽交联复合物(glutathiones-conjugate)，并被位于液泡膜上的mrp识别，mrp通过疏水基间的交互作用结合花青苷，将其跨膜转运至液泡。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因，满足使用需求。本发明的另一目的是提供一种草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因的表达蛋白。本发明还有一目的是提供一种上述草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因，其碱基序列如seqidno.1所示。

所述的草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

含有所述的草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因的表达载体。

含有所述的草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因的宿主菌。

所述的草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因在草莓果实花青苷积累中的应用。

所述的草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因在调控chs1、f3h1、ans1或ugt1基因表达中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明克隆出草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因，并通过侵染草莓果实试验发现，fagst1与草莓果实花青苷积累相关，将该基因沉默后，其表达量降低，chs1、f3h1、ans1、ugt1等花青苷合成主要基因表达量受到抑制。可见，该fagst基因在花青苷合成中将具有广泛的应用。

附图说明

图1是草莓果实注射侵染沉默表达fagst1基因结果图；草莓果实注射侵染沉默表达fagst1基因后，草莓果实着色被明显抑制，图中，a、为注射phellsgate-fagst1农杆菌后的草莓果实，b、为侵染液注射后的草莓果实；

图2是注射phellsgate-fagst1农杆菌后fagst1基因表达结果图：图中，col(control)是对照(侵染液侵染后得到的空白对照)，anti1是phellsgate-fagst1基因浸染果实1，anti2是phellsgate-fagst1基因浸染果实2；

图3是注射phellsgate-fagst1农杆菌后花青素合成基因的表达结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。

实施例1

以草莓基因组公布的草莓gst疑似基因序列(基因登陆名：xm_004294173.2)为模板，使用dnaman设计获得上游引物gst1-f和下游引物gst1-r，以“甜查理”草莓转色期果实的cdna为模版，进行pcr反应，克隆得到“甜查理”草莓的fagst1基因，基因序列全长657bp，其碱基序列如seqidno.1所示，表达蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。将“甜查理”草莓的fagst1基因转化pmd-18t载体，获得pmd-18t-fagst1质粒，提取质粒备用。

其中，引物序列为：

gst1-f：5′-aatggcggatgaggttgtc-3′，

gst1-r：5′-ccacttggaataagaaactg-3′。

主要转化过程如下：

(1)连接产物转化大肠杆菌感受态：重组dna粘附在细菌细胞表面，经过42℃的热击处理90sec，促进吸收dna，然后在37℃非选择lb液体(未添加抗生素)培养基中震荡培养1h，均匀地涂布在添加抗生素的固体培养基中37℃过夜培养。

(2)挑取单克隆，重新进行活化，即在新的含抗生素的固体培养基上重新划线，每个挑取12个单克隆进行重新划线活化，37℃过夜培养。

(3)挑取菌落，按照上述pcr反应体系进行菌落pcr反应检测。

(4)根据菌落pcr结果，挑取菌落，置于添加抗生素氨苄青霉素(amp)的液体lb培养基中震荡培养10h，送去上海生工生物工程有限公司测序。

选取测序正确的单菌落，放入(20mllb+20μlamp)的lb液体培养基，37℃摇床摇12-16h，提质粒。

提质粒步骤为：取1-4ml在lb培养基中培养过夜的菌液，12000×g离心1min，弃尽上清。加250μlbuffers1悬浮细胞沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。确认buffers1中已加入rnasea；加入250μlbuffers2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。加入350μlbuffers3，温和并充分地上下翻转4-6次，12000×g离心10min，吸取离心上清并转移到制备管(试剂盒内提供)，12000×g离心1min，弃滤液。将制备管置回离心管，加500μlbufferw1，12000×g离心1min，弃滤液。将制备管置回离心管，加700μlbufferw2，12000×g离心1min，弃滤液，重复一次。将制备管置回2ml离心管中，12000×g离心1min。将制备管移入新的1.5ml中，在制备管膜中央加60-80μleluent或去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min。

20μlpcr体系为：dna模板1μl，dntpmixture(10mm)2μl，gst1-f(20μm)1μl，gst1-r(20μm)1μl，10×buffer(mg²⁺plus)2μl，takarataqase(5u/μl)1μl，ddh2o12μl。

pcr程序为：94℃，1min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，45sec(35个循环)；72℃，10min。

实施例2

以gst1-phf和gst1-phr为扩增引物，以实施例1得到的pmd-18t-fagst1质粒为模板进行pcr反应，回收目的基因产物。将目的基因与phellsgate载体进行连接。25℃连接12h后加入1μl反应终止酶。主要过程如下：

热击法转化dh5α大肠杆菌感受态。采用phellsgate2干涉载体进行重组构建在fagst1的5’端选取300-500bp左右的片段设计引物，并在特异引物前加入attb位点通用引物，作为目标片段扩增引物。以草莓cdna为模板扩增得到目标片段，pcr产物经回收后，经bp反应重组连接至phellsgate2载体，构建成目的载体。选取菌落pcr反应后正确的单克隆菌株，提取质粒并进行带有phellsgate-fagst1基因的质粒进行双酶切验证。选取双酶切验证正确的带有phellsgate-fagst1基因的质粒，冻融法转化农杆菌gv3101。菌落pcr鉴定。

引物如下：

gst1-phf：5′-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaatggcggatgaggttgtc-3′，

gst1-phr：5′-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtggacaacgaaaggagatgagc-3′。

双酶切体系：反应1：质粒10μl，10×mbuffer2μl，0.1％bsa2μl，xbal0.8μl，加ddh2o至20μl。反应2：质粒2μl，10×hbuffer2μl，xhol0.8μl，加ddh2o至20μl。

农杆菌转化步骤如下：

(1)从-80℃取出保存的感受态农杆菌于冰上融化；

(2)每100μl感受态加1μg质粒dna混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃5min、冰浴5min；

(3)加入700μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养2～3h；

(4)5000rpm(转/分钟)离心3min收集菌，留取50μl左右的上清轻轻吸打重悬菌块涂布于含相应抗生素的lb平板上，倒置放于28℃培养箱培养2～3天；

(5)挑单菌落培养并鉴定，鉴定正确的菌液每300μl加入50％甘油700μl置于-80℃保存。

实施例3

挑选实施例2鉴定正确的单菌落进行草莓果实侵染。选择大绿果时期的八倍体果实为试材，采用注射法进行果实侵染，具体方法如下：

1)挑去含phellsgate-fagst1质粒的阳性克隆，接种至15mllb培养基中(含有50mgl^-1的卡那和50mgl^-1利福平)，28℃、200rpm摇菌至od600≈2.0。

2)取20ml新鲜的lb液体培养基(含有50mgl^-1的卡那和50mgl^-1利福平)，接入1ml步骤1)的农杆菌，28℃、200rpm摇至od600≈0.6。

3)收集菌液，室温、6000rpm离心3min。

4)用侵染液重新悬浮菌液，室温条件下，6000rpm离心3min。侵染液配置：分别配置浓度为1.0moll^-1的mes、1.0moll^-1的mgcl2以及浓度为1.0moll^-1的乙酰丁香酮，取200μl的mes、200μlmgcl2、20μl乙酰丁香酮，灭菌水定容至20ml，即为侵染液，备用。

5)重复步骤4)一次。

6)最后用20ml侵染液重新悬浮菌株，室温静止2h，注射法侵染草莓果实。

数据测定：将phellsgate-fagst1基因做荧光定量pcr，分析该基因在草莓果实的表达模式

pcr体系为：nuclease-freewater7μl，上游引物(5`-aggtctggactaacaagccac-3`)1.0μl，下游引物(5`-cctgctcatctcctttcgttg-3`)1.0μl，qpcrmastermix10μl，模板cdna1μl。

pcr反应条件：95℃，2min；95℃，15sec，60℃，1min(50个循环)；溶解曲线。

图1是草莓果实注射侵染沉默表达fagst1基因，图中，a、为注射侵染后的草莓果实，b、为侵染液注射后的草莓果实。fagst1与草莓果实花青苷积累相关，将该基因沉默后，其表达量降低，但是注射phellsgate空载体的果实花青苷的积累不受影响。

图2是phellsgate-fagst1基因表达，基因沉默后，fagst1的表达量降低。

图3是花青素调控基因的表达，基因fagst1沉默后，chs1、f3h1、ans1、ugt1等花青苷合成主要基因表达量受到抑制。

sequencelisting

<110>安徽农业大学

<120>一种草莓谷胱甘肽转移酶fagst基因及其表达蛋白和应用

<130>100

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>657

<212>dna

<213>fragaria×ananassaduch

<400>1

atggcagatgaggttgtcttgttggacttctggcctagcccatttgggatgaggctgagg60

atcgctctggccgagaaaggcgtcaagtacgagtacaaggacgaggacctgaggaacaag120

agcccgctgttgcttcagtcgaacacggttcacaagaagatcccggttctcattcacaac180

ggcaaacctgtctgcgagtctgtcattgctcttcagtacattgatgaggtctggactaac240

aagccactattgccctccgacccttacctcagatcccaggccaggttctgggccgacttt300

gtggacaagaagatatatgatatcggtaggaagacatggacaacgaaaggagatgagcag360

gaggcagcaaagaaggaattcatcgactgcattaagttgctagaagtggagcttggggac420

aagcctttctttggcggtgagaccctcggatttgtggacgtgacgctcattcctttctat480

tcctggttctctgtgtatgagaaatacggcaacttcagcattgcgccagagtgcccgaag540

ttcatggcttgggttaagaggtgtatggagaaggagagtgtgtcaaagtctcttcctgac600

caggacaaggtctgtggctttgttgccgagatgaggaagaagcttggagttgagtag657

<210>2

<211>218

<212>prt

<213>fragaria×ananassaduch

<400>2

metalaaspgluvalvalleuleuaspphetrpproserprophegly

151015

metargleuargilealaleualaglulysglyvallystyrglutyr

202530

lysaspgluaspleuargasnlysserproleuleuleuglnserasn

354045

thrvalhislyslysileprovalleuilehisasnglylysproval

505560

cysgluservalilealaleuglntyrileaspgluvaltrpthrasn

65707580

lysproleuleuproseraspprotyrleuargserglnalaargphe

859095

trpalaaspphevalasplyslysiletyraspileglyarglysthr

100105110

trpthrthrlysglyaspgluglnglualaalalyslysglupheile

115120125

aspcysilelysleuleugluvalgluleuglyasplysprophephe

130135140

glyglygluthrleuglyphevalaspvalthrleuileprophetyr

145150155160

sertrppheservaltyrglulystyrglyasnpheserilealapro

165170175

glucysprolysphemetalatrpvallysargcysmetglulysglu

180185190

servalserlysserleuproaspglnasplysvalcysglypheval

195200205

alaglumetarglyslysleuglyvalglu

210215