耐辐射异常球菌角蛋白酶基因kerA的应用的制作方法

本发明属于生物降解技术领域，涉及耐辐射异常球菌角蛋白酶kera基因降解复杂结构的蛋白质、发挥碱性蛋白酶水解的功能。

背景技术：

酶作为一种重要的生物催化剂，在生物化学反应中发挥十分重要的作用，较化学催化剂，酶的催化作用所需条件温和。无论在蛋白质工程、细胞工程、基因工程和发酵工程都需要各种酶的参与，酶工程技术己成为生物工程技术的重要组成部分。其中，蛋白酶在工业酶中用得最多，约占用酶总量的60％，而碱性蛋白酶占37％。

碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质肽键的一类蛋白酶的总称，属于丝氨酸蛋白水解酶类。微生物碱性蛋白酶一般在ph为7-11范围内有活性，最适ph多为9.5-10.5。多数微生物碱性蛋白酶不具有耐热性，在50-60℃维持较长时间便大量失活，只有少数菌株产生的碱性蛋白酶能够耐受70℃的高温。这些情况限制了碱性蛋白酶的使用范围，人们需要找到ph范围和温度范围更宽的碱性蛋白酶用于实际生产中。

技术实现要素：

异常球菌属菌株分离于温泉、沙漠、冰山及南极等各种各样的环境，所有的异常球菌属物种均具有极强的胁迫逆境抗性及超强的环境适应性。在这种极端的环境下，这些微生物经过长期的选择压力下，进化出一系列适应该生境的基因种质资源。菌株基因组中丰富的功能酶编码基因值得进行更加深入的研究。

本发明的目的是从耐辐射异常球菌deinococcusradiodurans中发掘鉴定了一种用于复杂结构蛋白降解的碱性蛋白酶基因。

通过如下研究，首次发掘鉴定了耐辐射异常球菌kera基因(geneid：rs01950；proteinid：wp_027480084)可用于微生物催化的生物降解。具体研究工作如下：

1、获得了含有kera基因的重组工程菌株

1)通过pcr从耐辐射异常球菌基因组扩增出kera基因，基因序列号为：geneid：rs01950。其大小为1599bp，该基因编码532个氨基酸，将其克隆于载体pjet上，构建了含有完整kera基因的重组质粒pjet-kera；

2)将kera基因连接于pet22b质粒上，该质粒含诱导型t7启动子和前导肽pelb，可将诱导表达的靶标蛋白释放到培养液中。构建完成的重组质粒pet22-kera；

3)将导入kera基因的重组质粒pet22-kera转入受体大肠杆菌bl21(de3)中，获得工程菌株bl21-kera(详见实施例1)；

2、含有kera基因重组工程菌株的生物降解检测实验及蛋白酶活性测定分析

本发明进行了如下生物降解检测实验：

1)平板降解圈实验：实验结果显示，表达kera蛋白酶的重组工程菌株在脱脂乳平板上能够生长并产生明显的降解圈。

2)羽毛降解实验：实验证实，并kera蛋白酶具有降解鸡羽毛的活性(详见实施例2)。

结果说明，表达kera的重组大肠杆菌工程菌株具有分泌蛋白酶的能力，该蛋白酶能够降解脱脂乳蛋白和鸡羽毛等复杂结构蛋白。

本发明还进行了蛋白酶活性测定分析。30℃诱导培养条件下，工程菌bl21-kera在诱导8h后可以检测出胞外蛋白酶酶活，粗酶液酶活为137.1u/mg(详见实施例3)。羽毛降解发酵液中氨基酸种类与含量分析显示，降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸(详见实施例4)。

序列表信息

seqidno.1：kera基因的核苷酸序列。

seqidno.2：kera的氨基酸序列。

附图说明：

图1工程菌株bl21-kera与对照菌株bl21-22b的牛奶平板降解效果；

图2工程菌株bl21-kera与对照菌株bl21-22b对羽毛底物的降解效果。

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化降解的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下：

克隆载体pjet：为thermofisher公司市售产品；

穿梭质粒pet-22b：novagen公司市售产品；

大肠杆菌bl21(de3)：为北京全式金公司市售产品。

羽毛：为鸡羽毛采购于市场。

实施例1耐辐射异常球菌kera基因序列在大肠杆菌中的表达

一、实验材料

大肠杆菌bl21(de3)：为北京全式金公司市售产品。

pcr模板dna：耐辐射异常球菌基因组dna

二、实验方法

1.根据已公布的耐辐射异常球菌基因组中的kera基因序列设计1对pcr特异性引物：

kera-f：5′accggatccgatgaacgcacgtctcgttgc3′

kera-r：5′accctcgagcttcgtttcggtcaggctgt3′

2.通过pcr方法从耐辐射异常球菌基因组dna中扩增出目的基因序列。

反应条件：94℃10min，[94℃30sec，58℃30sec，72℃1.5min]35个循环，72℃10min。

3.pcr产物经胶回收后，克隆于载体pjet上，命名为pjet-kera，并测序验证；然后通过bamhi/xhoi双酶切获得含有粘性末端的kera基因及含有t7启动子的pet-22b载体，将kera基因连接于pet-22b载体上，构建大肠杆菌高表达载体pet22-kera，将该表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)。

三、实验结果

利用pcr技术成功克隆了耐辐射异常球菌kera基因，成功构建了表达kera的重组大肠杆菌工程菌株。经pcr、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为bl21-kera。含有pet-22b对照空质粒的e.colibl21(de3)命名为bl21-22b。

四、实验结论

完成表达kera的重组大肠杆菌工程菌株的构建。

实施例2耐辐射异常球菌kera蛋白酶活性初步分析

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达kera基因的bl21-kera菌株

对照菌株：实施例1所述含空质粒的bl21-22b菌株。

二、实验方法

1平板降解圈实验

1)挑去单克隆菌株接种于含amp的液体lb培养基中，37℃恒温摇床培养过夜

2)将种子液转接于新的lb培养基，培养至对数生长期。制备含有1％脱脂乳的1％琼脂平板。将菌株在平板上进行点种，每隔12h测定水解圈直径及菌落直径，至稳定不变。

3)计算平板上水解圈直径与菌落直径的比值h/c，初步评估菌株产蛋白酶能力。

2羽毛降解实验

用清水冲洗鸡羽毛，烘干备用。以羽毛为唯一碳源和氮源加入50ml无机盐培养基，高温灭菌。无机盐培养基：nacl0.05％，k2hpo40.1％，kh2po40.04％，mgcl2·7h2o0.01％，cacl20.006％，ph7.5。

将菌株种子液转接于以羽毛为唯一碳源和氮源加入无机盐培养基中，37℃恒温摇床培养，每隔12h观测羽毛降解情况。

三、实验结果

平板降解圈实验结果显示，培养24h后表达kera蛋白的菌株bl21-kera在脱脂乳平板上能够生长并产生明显的降解圈，对照菌株bl21-22b未见降解圈(图1)。羽毛降解实验显示，菌株bl21-kera培养24h开始降解羽毛，72h后羽毛完全降解。对照菌株bl21-22b培养液中羽毛未见降解发生(图2)。

四、实验结论

表达kera的重组大肠杆菌工程菌株具有分泌蛋白酶的能力，该蛋白酶能够降解脱脂乳蛋白和羽毛。

实施例3耐辐射异常球菌kera蛋白酶酶活测定实验

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达kera基因的bl21-kera菌株

二、实验方法

1蛋白表达与纯化

1)挑去单克隆接种至50ml含amp的液体lb培养基中，37℃恒温摇床培养过夜

2)0.1％转接菌株种子液至新鲜lb培养基中，37℃恒温摇床培养到od600达0.6

3)向培养基中加入终浓度1mm的iptg，30℃诱导培养8h

4)12000rpm离心收集菌体和培养液上清，上清液为粗酶液

5)加入上样缓冲液，煮沸后进行sds-page分析。

2蛋白酶酶活测定

采用folin-酚法测定培养基中蛋白酶的酶活，具体步骤如下：

1)将离心所得粗酶液用ph8.0，50mmtris-hcl稀释至合适倍数

2)取稀释后上清100μl，加入2％酪蛋白底物100μl，在55℃孵育10min，加入200μl0.4m三氯乙酸终止反应10min。

3)12000rpm离心2min，取上清100μl，加入500μl0.4mna2co3，100μlfolin试剂，混匀，在40℃显色20min后660nm测定吸光值。

4)每分钟催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸定义为一个酶活力单位(u)。利用不同浓度的酪氨酸对其在660nm吸光值作图制作到酪氨酸标准曲线。

三、实验结果

研究结果显示，30℃诱导培养条件下，工程菌bl21-kera在诱导8h后可以检测出胞外蛋白酶酶活，粗酶液酶活为137.1u/mg。

四、实验结论

kera蛋白酶在工程菌种成功表达，具有蛋白酶活性，胞外粗酶活为137.1u/mg。

实施例4耐辐射异常球菌kera蛋白酶羽毛降解产物分析

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达kera基因的bl21-kera菌株

二、实验方法

1.将离心所得粗酶液用ph8.0，50mmtris-hcl稀释至合适倍数

2.取稀释后上清3ml，加入羽毛粉10mg，在40℃孵育60min，加入2ml0.4m三氯乙酸终止反应10min。

3.12000rpm离心10min，取上清。对照组反应前即加入2ml0.4m三氯乙酸

4.将5ml上清样品加入旋转蒸发仪中，蒸发至1ml，回收至ep管中，利用氨基酸分析仪进行降解产物的游离氨基酸含量分析。

三、实验结果

研究结果显示，如下：

结果显示，羽毛降解发酵液中氨基酸种类与含量分析显示，降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸。

四、实验结论

耐辐射异常球菌kera蛋白的羽毛降解发酵液中氨基酸含量分析显示，降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>耐辐射异常球菌角蛋白酶基因kera的应用

<160>2

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>1599

<212>dna

<213>耐辐射异常球菌（deinococcusradiodurans）

<400>1

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<210>2

<211>532

<212>prt

<213>耐辐射异常球菌（deinococcusradiodurans）

<400>2

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