一种R型1-苯基乙醇合成酶的编码基因及其应用的制作方法

本发明涉及一种r型1-苯基乙醇合成酶及编码该合成酶的基因、含有该基因的载体及其应用。

背景技术：

手性化合物在医药和香料市场的需求与日俱增。r型1-苯基乙醇具有花香味，作为香料物质广泛应用于化妆品行业中。在植物界，1-苯基乙醇在山茶科的植物中大量蓄积，但是通过植物直接分离得到单一构型的1苯基乙醇在技术上存在诸多壁垒，可行性非常低。

现在的手性化合物大部分通过化学合成的方法得到。化学合成具有其不可避免的缺点。一方面，化学合成的方法容易造成环境污染。另一方面，通过化学合成的方法很难得到单一构型的产物，同时化学合成会带来较多的副产物。生物合成是继化学合成之后兴起的化合物合成方法。在手性化合物合成应用方面，生物合成具有成本低，能耗少，无环境污染，产物手性结构单一等特点，从而受到广泛的关注。

目前已有文献(dongf,zhouy,zengl,etal.optimizationoftheproductionof1-phenylethanolusingenzymesfromflowersoftea(camelliasinensis)plants[j].molecules,2017,22(1):131.)报道能特异性生成1-苯基乙醇(r型1-苯基乙醇和s型1-苯基乙醇混合物)的合成酶，但是植物中能够特异生成r型1-苯基乙醇合成酶的暂未见报道。因此，提供一种源自植物的能够特异性合成r型1-苯基乙醇的合成酶具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种r型1-苯基乙醇合成酶及编码该合成酶的基因、含有该基因的载体及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种蛋白，其氨基酸序列如seqidno.1所示，或者是seqidno.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后且具有同等或更高等活性的蛋白；

seqidno.1：

makvesssinsrwcltgltalvtggtrgighavveelgelgaqvhtcsrneaelsgclqewaskgftvtasvcdvssssqrqqlldkasslfdgklnilinnvgtnirkptieytteeysmimatnlesafhlcqlaypllkasgvgsivfissvaglvhigsgsiygaskgamnqltknlacewakdnircncvapwyirtslvehllenkefldkiisqtplrrpgepkevsslvaflcmpassyitgqiisvdggmtvngfsvn。

编码上述蛋白的序列。

进一步地，序列如seqidno.2所示；

seqidno.2：

atggcgaaggtggagagcagtagcataaattcgaggtggtgtctcacgggattgaccgcactcgtcaccggtggcactcgtggcattgggcacgcagttgtggaggaactaggtgaattaggggctcaagtgcacacatgttcccgcaacgaagcagagctgagtggttgcttacaagaatgggcctctaaaggctttaccgtcactgcttctgtctgcgacgtttcttcttcatcccaacgacaacagttgctcgataaagcctcctctctcttcgatggcaagctcaacattcttataaacaatgttggcacaaatatcaggaagccaactattgagtatacaactgaagaatactccatgattatggctaccaaccttgaatctgctttccatctttgccaacttgcataccctttgttaaaagcatccggagttggaagcattgtgttcatttcctccgttgctggtctggtgcatattggttctggatctatttatggagccagtaagggtgcaatgaatcaacttacaaagaatttggcttgtgagtgggcaaaagataacattcgatgtaactgtgttgcaccctggtatatcagaacctcactcgtagaacatttgctggaaaacaaagagttcctggataaaataatatctcaaactcctctaagacgccctggagagcccaaggaagtatcatccttggtggcatttctttgtatgcctgcttcgtcttacatcaccgggcagattatttccgttgacggaggaatgactgttaatggtttctcagtcaattag。

一种克隆载体，含有上述序列。

一种表达载体，含有上述序列。

一种r型1-苯基乙醇合成酶的制备方法，包括将上述表达载体导入宿主细胞中，表达得到r型1-苯基乙醇合成酶。

一种r型1-苯基乙醇的生物合成方法：使用上述蛋白作为合成酶催化反应。

进一步地，以苯乙酮为底物。

进一步地，反应体系中还需要加入辅酶nadph。

进一步地，反应ph为7～8，反应温度为45～55℃。

本发明的有益效果是：

1、本发明中的r型1-苯基乙醇合成方法经济性很高，同时无环境污染，无有毒化学试剂的使用，具有“绿色化学和绿色工业”的特征。

2、利用本发明中的r型1-苯基乙醇合成酶以苯乙酮为底物生成的r型1-苯基乙醇的ee％大于99％。

3、本发明中公开了r型1-苯基乙醇合成酶氨基酸序列及其编码基因序列，可以作为未来基因改造的骨架，为将来通过氨基酸的替换等手段，人工智能设计出催化效率更高的r型1-苯基乙醇合成酶提供了基础。

附图说明

图1为r型1-苯基乙醇合成酶的sds-page蛋白电泳结果；

图2为不同反应条件下的酶促反应效率；

图3为gc-ms鉴定r型1-苯基乙醇合成酶催化苯乙酮的产物。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

本发明采取的技术方案如下：

1.r-1苯基乙醇合成酶r1pes表达载体的构建

将seqidno.2所示的r型1-苯基乙醇合成酶r1pes基因克隆进pet32a原核表达载体中。

seqidno.2：

atggcgaaggtggagagcagtagcataaattcgaggtggtgtctcacgggattgaccgcactcgtcaccggtggcactcgtggcattgggcacgcagttgtggaggaactaggtgaattaggggctcaagtgcacacatgttcccgcaacgaagcagagctgagtggttgcttacaagaatgggcctctaaaggctttaccgtcactgcttctgtctgcgacgtttcttcttcatcccaacgacaacagttgctcgataaagcctcctctctcttcgatggcaagctcaacattcttataaacaatgttggcacaaatatcaggaagccaactattgagtatacaactgaagaatactccatgattatggctaccaaccttgaatctgctttccatctttgccaacttgcataccctttgttaaaagcatccggagttggaagcattgtgttcatttcctccgttgctggtctggtgcatattggttctggatctatttatggagccagtaagggtgcaatgaatcaacttacaaagaatttggcttgtgagtgggcaaaagataacattcgatgtaactgtgttgcaccctggtatatcagaacctcactcgtagaacatttgctggaaaacaaagagttcctggataaaataatatctcaaactcctctaagacgccctggagagcccaaggaagtatcatccttggtggcatttctttgtatgcctgcttcgtcttacatcaccgggcagattatttccgttgacggaggaatgactgttaatggtttctcagtcaattag。

2.r型1-苯基乙醇合成酶r1pes的原核表达

将构建好的载体r1pes-pet32a转入表达菌株rosetta后挑取单克隆摇菌。待菌液的od600约等于0.6时加入终浓度为0.1mm的异丙基硫代半乳糖苷进行蛋白诱导表达。

蛋白诱导表达的温度为18～25℃，诱导时间为12～16小时。

3.重组蛋白r1pes-pet32a的纯化

将诱导表达的大肠杆菌rosetta12,000g离心10min。用裂解液(50mmnah2po4，300mmnacl，10mm咪唑，ph8.0)重悬，超声裂解后12,000g离心30min。上清在4℃条件下和ni-nta琼脂糖凝胶孵育1小时后上柱。漂洗液(50mmnah2po4，300mmnacl，20mm咪唑，ph8.0)漂洗4次后，用洗脱液(50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑，ph8.0)将蛋白从柱上洗脱，得到纯化的r1pes重组蛋白。纯化的r1pes重组蛋白sds-page电泳结果如图1所示。

4.r型1-苯基乙醇的合成

利用得到的r1pes重组蛋白进行体外酶促反应，以苯乙酮为底物合成r型1-苯基乙醇。具体的方法为：反应体系添加的苯乙酮浓度为0.25mm，辅酶nadph的浓度为1.5mm，反应ph为7～8，反应温度为45～55℃，反应时间为1～1.5小时。不同反应条件下的酶促反应效率如图2所示。

gc-ms鉴定r1pes催化苯乙酮的产物，鉴定结果如图3所示，由鉴定结果可知r1pes可以催化苯乙酮专一性的形成r型1-苯基乙醇。

实施例1

将seqidno.2所示的r型1-苯基乙醇合成酶基因克隆进pet32a原核表达载体中。

将r1pes-pet32a载体转入大肠杆菌rosetta。挑取单克隆接种至100mllb培养基中，37℃，230转摇至od600约等于0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.1mm。之后继续在20℃，180转的条件下培养16小时。

12,000g离心10分钟收集菌体，加入10ml裂解液(50mmnah2po4，300mmnacl，10mm咪唑，ph8.0)重悬后超声破碎菌体。超声破碎仪的参数为：40％功率，超声3秒，间歇5秒。超声30分钟后，12,000g离心30分钟收集上清。上清中加入500μlni-nta琼脂糖凝胶，于4℃，200转的条件下孵育1小时。将蛋白和ni-nta琼脂糖凝胶的混合物装柱，弃流穿液。漂洗液(50mmnah2po4，300mmnacl，20mm咪唑；ph8.0)漂洗4遍后，用3ml洗脱液(50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑)将重组蛋白从琼脂糖凝胶柱上洗脱。获得的重组蛋白的量为3.6mg。

取5μg重组蛋白加入反应体系，反应体系中苯乙酮的浓度为0.25mm，辅酶nadph的浓度为1.5mm，反应ph为7.5，反应温度为55℃，反应时间为1小时。反应结束后测得生成的r型1-苯基乙醇的量约为4.2nmol，转化效率约为4.2％。

实施例2

将seqidno.2所示的r型1-苯基乙醇合成酶基因克隆进pet32a原核表达载体中。

将r1pes-pet32a载体转入大肠杆菌rosetta。挑取单克隆接种至400mllb培养基中，37℃，230转摇至od600约等于0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.1mm。之后继续在20℃，180转的条件下培养16小时。

12,000g离心10分钟收集菌体，加入10ml裂解液(50mmnah2po4，300mmnacl，10mm咪唑，ph8.0)重悬后超声破碎菌体。超声破碎仪的参数为：40％功率，超声3秒，间歇5秒。超声30分钟后，12,000g离心30分钟收集上清。上清中加入500μlni-nta琼脂糖凝胶，于4℃，200转的条件下孵育1小时。将蛋白和ni-nta琼脂糖凝胶的混合物装柱，弃流穿液。漂洗液(50mmnah2po4，300mmnacl，20mm咪唑，ph8.0)漂洗4遍后，用3ml洗脱液(50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑)将重组蛋白从琼脂糖凝胶柱上洗脱。获得的重组蛋白的量为7.6mg。

取5μg重组蛋白加入反应体系，反应体系中苯乙酮的浓度为0.25mm，辅酶nadph的浓度为1.5mm，反应ph为7.5，反应温度为45℃，反应时间为1小时。反应结束后测得生成的r型1-苯基乙醇的量约为3.5nmol，转化效率约为3.5％。

sequencelisting

<110>中国科学院华南植物园

<120>一种r型1-苯基乙醇合成酶的编码基因及其应用

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>267

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<213>人工合成

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