一种免疫原性增强型小反刍兽疫N蛋白基因重组腺病毒的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种免疫原性增强型小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒的制备方法。

背景技术：

小反刍兽疫（pestedespetitsruminants,ppr）是由副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒引起的一种高度接触性传染病，俗称“羊瘟”。本病主要发生于山羊、绵羊及野生小反刍动物，发病率和病死率均较高，世界动物卫生组织（oie）将其列为必须报告的动物疫病，中国列为一类动物疫病。1942年该病首次发现于非洲的科特迪瓦，随后的几年时间ppr几乎传遍了赤道到撒哈拉沙漠的所有非洲国家。随着该病的不断蔓延，中国周边国家（老挝、孟加拉国、俄罗斯、印度、巴基斯坦、塔吉克斯坦、哈萨克斯坦、蒙古国、缅甸、尼泊尔、阿富汗和韩国）频频大规模暴发ppr疫情。2007年，西藏阿里地区首次暴发了本病，此后逐渐在我国蔓延开来。

目前，ppr防控主要以弱毒疫苗免疫为主。1989年，diallo等将pprvnigeria75/1株接种于vero细胞上，连续传代，成功地将nigeria75/1致弱，研制出第一株pprv的同源弱毒疫苗，该疫苗目前仍在非洲地区广泛使用。我国发生小反刍兽疫疫情后，很快生产出小反刍兽疫弱毒活疫苗（75/1株），用于紧急接种和日常接种。弱毒苗的使用，使疫情得到有效控制。由于弱毒苗是细胞传代致弱的，存在毒力反强的可能性，因此探索安全有效的新型疫苗对防控工作来说是必须的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种免疫原性增强型小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒的制备方法，将小反刍兽疫n蛋白基因和ag85a基因重组到复制缺陷性腺病毒上，以期提高n蛋白刺激机体产生抗体的能力。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种免疫原性增强型小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒的制备方法，包括如下步骤：

s1，将脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列ires连接到复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa上,然后提取重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-

ires；

s2，将含有小反刍兽疫n蛋白的dna序列和含有结核分枝杆菌ag85a基因的dna序列克隆至重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-ires上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a；

s3，将提取得到的重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a和复制缺陷型腺病毒pacad59.2-100骨架dna经线性化后，转染真核细胞ad-293，得到重组腺病毒rad-n-ires-ag85a；

s4，将所得到的重组腺病毒rad-n-ires-ag85a经浓缩、纯化、扩增，制备得免疫原性增强型小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒。

进一步的，所述步骤s2中，小反刍兽疫n蛋白的dna序列和含有结核分枝杆菌ag85a基因的dna序列以共表达的形式克隆至重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-ires上。

进一步的，所述步骤s2中，转染真核细胞ad-293的过程是在脂质体的作用下共同完成的。

进一步的，重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-ires的具体制备方法如下：

s1.1，核糖体结合位点序列ires的获得：根据genbank数据库发表的脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列id:gb|ef591488.1，合成脑心肌炎病毒的核糖体结合位点ires序列，并在ires序列的两端加入酶切位点ecori与bamhi，获得质粒pex-ires；

s1.2，穿梭质粒的改造：分别提取质粒pex-ires和pacad5cmvk-npa，利用限制性内切酶ecori与bamhi分别酶切质粒，经过连接、转化后获得改造后的重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-ires。

进一步的，重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a的具体是被方法如下：

s2.1小反刍兽疫n蛋白基因片段的获得：根据已经发表的小反刍兽疫病毒nigeria-75-1株序列，以nigeria-75-1株rna为模板，设计1对特异性引物pprv-npf和pprv-npr用于扩增小反刍兽疫n蛋白的基因序列；收集小反刍兽疫疫苗nigeria-75-1株，提取rna，以pprv-npf，pprv-npr为引物进行一步法rt-pcr扩增n蛋白基因，经琼脂糖凝胶纯化回收后，连接pmd19-t载体，转化，测序，获得含有小反刍兽疫病毒n蛋白基因序列的质粒pmd19-t-n；

s2.2，含有小反刍兽疫n蛋白基因穿梭质粒的构建：在步骤s2.1中获得pmd19-t-n的上下游引物的5’端分别引入限制性内切酶ecori、xbai的酶切位点，通过双酶切，将n蛋白基因克隆到穿梭质粒pacad5cmvk-npa-ires，通过转化、pcr和酶切鉴定，获得含有n蛋白基因的穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-

ires；

s2.3，结核分枝杆菌ag85a基因片段的获得：根据genbank数据库发表的结核分枝杆菌ag85a基因，合成ag85a基因序列，并在序列的两端加入酶切位点bamhi与xhoi，获得质粒pex-ag85a；

s2.4，含有小反刍兽疫n蛋白基因与结核分枝杆菌ag85a基因穿梭质粒的构建：将步骤（5）所得质粒pex-ag85a和步骤（4）所得pacad5cmvk-npa-n-ires利用限制性内切酶bamhi与xhoi分别酶切质粒，经过连接、转化、鉴定后获得改造后的穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a。

进一步的，所述重组腺病毒rad-n-ires-ag85a的具体制备方法如下：

s3.1，穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a和复制缺陷型重组腺病毒pacad59.2-100的骨架dna，经paci酶切线性化后回收，转染ad-293细胞，重组腺病毒dna在细胞内包装成完整的复制缺陷型重组腺病rad-n-ires-ag85a；

s3.2，复制缺陷型重组腺病rad-n-ires-ag85a经纯化、扩增后，采用pcr、rt-pcr、sds-page和westernblot方法检测n蛋白基因、ag85a基因的转录与表达，制得重组腺病毒rad-n-ires-ag85a。。

进一步的，所述重组腺病毒rad-n-ires-ag85a制备所述免疫原性增强型小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒的具体方法如下：

s4.1，将重组腺病毒rad-n-ires-ag85a接种于ad-293细胞，进行扩大培养；当细胞病变达80-90%时，收集病毒，经反复冻融3次后，即可获得所述免疫原性增强型小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒，经检测、分装、包装后完成。

本发明的另一目的是提供上述制备方法制成的免疫原性增强型小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒。

本发明的再一目的将上述免疫原性增强型小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒用于制备疫苗。

还提供一种用上述的免疫原性增强型小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒作为种毒制备的小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒疫苗，以及用于递送重组腺病毒的制剂，其中制剂包含上述的免疫原性增强型小反刍兽疫n蛋白基因重组腺病毒、赋形剂以及药学或兽医学可接受的运载体。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

1、本发明选取小反刍兽疫n蛋白基因，该序列是保守性较高的区域，是引发机体强烈的抗体反应的蛋白基因；n蛋白上含有t细胞表位，在细胞免疫方面发挥着重要作用。

2、本发明采用复制缺陷型人腺病毒血清5型载体为表达载体，该载体不含有e1基因，只能在真核细胞ad-293细胞中复制增殖，不能在人、羊等动物体内复制增殖，而且没有致病性，不会出现散毒等传统弱毒苗的缺陷。而且，通过腺病毒载体在真核细胞胞内表达的蛋白可以进行蛋白翻译后修饰，最大程度还原目的蛋白的真实结构，发挥其原有的生物学活性。此外，该重组腺病毒可以采用滴鼻免疫，能够刺激机体产生有效的黏膜免疫力。

3、本发明利用基因工程技术将脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列插入到穿梭质粒的基因组上，对复制缺陷型人腺病毒血清5型载体的穿梭质粒进行改造，使得该重组腺病毒具备表达两种不同蛋白的能力，而且这两种蛋白的结构与表达水平不会受到相互干扰；利用本方法，构建的重组腺病毒能够同时表达小反刍兽疫n蛋白基因与结核杆菌ag85a基因，在ag85a蛋白的作用下，有效提高了n蛋白的免疫原性。

附图说明

下面结合附图说明对本发明作进一步说明。

图1是本发明实施例中构建含有脑心肌炎病毒核糖体结合位点序列的腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-ires的酶切鉴定结果（601bp）；其中泳道1：穿梭质粒经双酶切后得到两个片段，分别为穿梭质粒骨架及ires元件序列；m：10kbdnamarker。

图2是本发明实施例中构建含有小反刍兽疫病毒n蛋白基因的腺病毒穿梭质粒的pcr鉴定结果（1578bp）；其中，泳道1：n蛋白基因pcr鉴定结果；m：2kbdnamarker。

图3是本发明实施例中构建的重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a的pcr鉴定结果；泳道1：n蛋白基因pcr鉴定结果；泳道2：n-ires-ag85a基因pcr扩增结果；泳道m：5kbdnamarker。

图4是本发明实施例中复制缺陷型重组腺病毒感染ad-293细胞之后的细胞病变；图片右为正常的ad-293细胞对照，图片左为pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a转染ad-293细胞的细胞病变。

图5是本发明实施例中重组腺病毒rt-pcr鉴定结果图。泳道1：基因ag85a的扩增结果；泳道2，4：野生型腺病毒对照；泳道3：n蛋白基因的扩增结果；m：2kbdnamarker。

图6是本发明实施例中免疫印迹检测结果图。其中：泳道1为正常ad-293细胞对照裂解液与ag85a蛋白单抗的检测结果，泳道2为感染腺病毒rad-n-ires-ag85a的ad-293细胞裂解液与ag85a蛋白单抗的检测结果，泳道3为感染腺病毒rad-n-ires-ag85a的ad-293细胞裂解液与小反刍兽疫阳性血清的反应结果，泳道4为正常ad-293细胞对照细胞裂解液与小反刍兽疫阳性血清的反应结果。

图7是本发明实施例中各代次的重组腺病毒rad-n-ires-ag85art-pcr检测结果图。图片a为各代次重组腺病毒rad-n-ires-ag85a内n蛋白基因的鉴定结果，泳道1-4分别为1、5、10、20代重组腺病毒内n蛋白基因的鉴定结果；图片b为各代次重组腺病毒rad-n-ires-ag85a内ag85a基因的鉴定结果，泳道1-4分别为1、5、10、20代重组腺病毒内ag85a基因的鉴定结果。

具体实施方式

实施例1重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa的改造

根据genbank数据库发表的脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列（genebanksequenceid:gb|ef591488.1），合成ires序列，并在序列的两端加入酶切位点ecori与bamhi，获得质粒pex-ires。分别提取质粒pex-ires、pacad5cmvk-npa，利用限制性内切酶ecori与bamhi分别酶切质粒，通过琼脂糖凝胶电泳纯化双酶切后的ires片段与pacad5cmvk-npa质粒片段，经过t4连接酶连接后，转化dh10b感受态细胞，经鉴定筛选含有ires元件的穿梭质粒pacad5cmvk-npa-ires，如图1所示。

实施例2重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-ires的构建

2.1特异性引物pprv-npf、pprv-npr设计。根据已经发表的小反刍兽疫病毒nigeria-75-1株序列，设计两对特异性引物，扩增n蛋白基因。引物序列如下：

pprv-npf：5’-ggaattcatggcgactctccttaaaagct-3’

pprv-npr：5’-gctctagaacagccgaggagatccttgtc-3’

2.2含有n蛋白基因的克隆质粒构建。采用病毒rna柱式提取试剂盒提取pprvrna，以oligodt为引物进行反转录获得pprvcdna，以pprvcdna为模板，以pprv-npf、pprv-npr为引物扩增含有n蛋白基因，经琼脂糖凝胶纯化回收之后，连接pmd19-t载体，筛选含有n基因片段的pmd19-t阳性重组质粒pmd19-t-n。

2.3含有n蛋白基因的腺病毒穿梭质粒的构建。利用限制性内切酶ecori、xbai双酶切质粒pmd19-t-n与腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-ires，经琼脂糖凝胶纯化回收之后，将n片段插入至酶切后的载体pacad5cmvk-npa-ires，连接产物转化dh5α感受态细胞，pcr鉴定筛选阳性克隆，鉴定的阳性质粒命名为pacad5cmvk-npa-n-ires，如图2所示。

实施例3重组腺病毒穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a的构建

根据genbank数据库发表的结核分枝杆菌ag85a基因，合成ag85a基因序列（1364bp)，在序列的两端加入酶切位点bamhi与noti，获得质粒pex-ag85a。根据ag85a基因dna序列，设计引物p1、p2，用于ag85a基因扩增。

p1：5’ctagggatcctatgcagcttgttgacagg3’

p2：5’ataagaatgcggccgcctaggcgccctggggcgcgg3’

利用限制性内切酶bamhi与noti酶切质粒pex-ag85a与实施例2中获得的质粒pacad5cmvk-npa-n-ires，经琼脂糖凝胶纯化回收之后，将ag85a片段插入至酶切后的载体pacad5cmvk-npa-n-ires，连接产物转化dh5α感受态细胞，pcr鉴定筛选阳性克隆，鉴定的阳性质粒命名为pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a，如图3所示。

实施例4重组腺病毒rad-n-ires-ag85a的获得

4.1重组穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a线性化与纯化。

使用无内毒素质粒大提试剂盒提取穿梭质粒pacad5cmvk-npa-n-ires-ag85a,与腺病毒骨架质粒pacad59.2-100，按照下列体系将重组腺病毒质粒与腺病毒骨架dna分别进行paci单酶切线性化，反应体系如下：重组腺病毒质粒30.0μl，10×nebuffer16.0μl，100×bsa0.6μl，paci1.0μl，加入灭菌双蒸水至总体积60.0μl，37℃酶切6h，进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。利用乙醇沉淀法纯化酶切之后的dna，分装保存。

4.2复制缺陷型重组腺病毒的包装：（1）转染前一天，用12ml含有10%胎牛血清无抗生素dmem生长液分散t25单层ad-293细胞，转至六孔板，2ml/孔，使其细胞密度为90-95%。（2）准备dna：转染试剂混合液，取一支灭菌的eppendorf管，按照下列配方，依次加入以下试剂：dmem250μl，重组穿梭质粒15μl，腺病毒骨架dna5μl，反复吹吸混匀，最后加入恢复至室温的transit试剂6μl，吹吸混匀，室温作用25min。（3）转染前采用无血清dmem培养基2ml/孔，轻轻洗涤细胞2次，加入2μl含有2%胎牛血清的dmem培养基，然后分多点逐滴加入dna：转染试剂混合液，轻晃细胞板，使之均匀，将细胞板置于37℃，5%co2培养箱中培养。（4）每天观察细胞状态，10-15d出现典型cpe后（见图4），收毒。

实施例5复制缺陷型重组腺病毒的鉴定

5.1重组腺病毒的rt-pcr检测：（1）用12ml含有10%胎牛血清无抗生素dmem生长液分散t25单层ad-293细胞，分别取4ml细胞培养液分装置t25细胞瓶中，加入6ml含有10%胎牛血清的dmem生长液，吹吸混匀，置于37℃，5%co2培养箱中培养。（2）待t25细胞瓶中细胞密度生长至90-95%时，用10ml含有2%胎牛血清的无抗生素dmem生长液洗涤细胞2次，然后各加入10ml含有2%胎牛血清的无抗生素dmem生长液，向其中一瓶细胞中接种复制缺陷型重组腺病毒液，置于37℃，5%co2培养箱中培养3d，出现典型cpe之后，收毒。（3）用trizol试剂按照产品说明书提取总rna，按照实施例2中的方法进行rt-pcr检测pprvn蛋白基因与ag85a基因的mrna，如图5所示。结果表明，该复制缺陷型重组腺病毒能够成功转录插入的pprvn蛋白基因与结核杆菌ag85a基因。

5.2蛋白印迹检测：（1）按照5.1中的方法，收集含有重组腺病毒的细胞液以及正常的293细胞液，提取总蛋白。然后各加入5×loadingbuffer，100℃煮沸5min。取20μl样品加至sds-page胶的加样孔中，进行电泳，分离蛋白。（2）电泳结束后，将胶条割至合适大小，裁取与胶条相同大小的nc膜，将胶条与nc膜一起浸入转膜缓冲液中浸泡10min。（3）按照以下顺序组装转膜装置，从下至上依次为阳极碳板、3层滤纸、nc膜、凝胶、3层滤纸、阴5极碳板，其中nc膜与凝胶必须精确对齐。接通电源，以1ma/cm2电流，转印1h。（4）转印结束后，将nc膜取出，置于干净的平皿中，加入20mlpbst洗涤nc膜，5min×3次。（5）向平皿中加入10ml5%脱脂牛奶，置于水平摇床上，平稳摇动，室温封闭2h。弃除封闭液，加入pbst洗膜，5min×5次。（6）以1：1000的比例用封闭液稀释pprv阳性血清，使nc膜完全浸润在一抗中，置于水平摇床上，平稳摇动，室温作用1h。弃除一抗，加入pbst洗膜，5min×5次。（7）以1：5000的比例用pbst稀释二抗，使nc膜完全浸润在二抗中，置于水平摇床上，平稳摇动，室温作用1h。弃除二抗，加入pbst洗膜，5min×5次。（8）用滤纸轻轻吸干nc膜表面的水分，加入显色液，避光反应1min。然后将膜与胶片一起置于暗盒中作用3-5min，作用结束后，将胶片先后置于显色液，脱色液中至其出现条带。（9）结果表明，该复制缺陷型重组腺病毒能够正确表达目的蛋白，并能与pprv阳性血清反应，如图6所示。

实施例6复制缺陷型重组腺病毒的遗传稳定性试验

6.1小反刍兽疫n蛋白基因复制缺陷型重组腺病毒候选株种子批制备将实施例4中得到的重组腺病毒定义为o代。吸取500μl接种ad293细胞进行传代，连续传20代，定义为01-20代。分别取1、5、10、20代按照实施例5中进行rt-pcr检测，剩余毒株分装后，-80℃保存。结果证明，携带小反刍兽疫n蛋白基因与结核杆菌ag85a基因的重组腺病毒基因序列稳定，在该重组腺病毒中能够稳定表达，如图7所示。

6.2小反刍兽疫n蛋白基因复制缺陷型重组腺病毒病毒滴度测定分别取3，5，10，20代重组腺病毒进行10倍梯度稀释，接种于含有ad-293细胞的96孔细胞培养板中，37℃培养7天，逐日观察细胞病变，按照reed-muench方法计算tcid50。结果显示，随着病毒传代，重组腺病毒rad-n-ires-ag85a的病毒滴度逐代增加，至第5代趋于稳定，第10代的tcid50为109.8/ml，结果表明，该复制缺陷型重组腺病毒接种ad-293细胞以后毒价稳定并出现典型的cpe。

实施例7rad-n-ires-ag85a感染小鼠的免疫原性测定

为了验证复制缺陷型重组腺病毒rad-n-ires-ag85a免疫原性，本实施例取第10代重组腺病毒rad-n-ires-ag85a进行动物试验，用实验室保存的只含有pprvn蛋白基因的重组腺病毒rad-n与不含外源基因的野生型腺病毒rad作为对照。将90只小鼠，随机分成3组，每组30只，分别为试验组1，试验组2，pbs对照组。试验组1每只小鼠接种剂量为0.1ml的重组腺病毒rad-n-ires-ag85a，接种方式为皮下注射和滴鼻。试验组2每只小鼠接种剂量为0.1ml的重组腺病毒rad-n，接种方式为皮下注射和滴鼻。对照组通过皮下注射和滴鼻免疫接种等量的野生型腺病毒。首免后隔两周，加强免疫一次，共接种2次。

7.1pprvn蛋白抗体检测。接种后，第0周，2周，4周，6周，8周随机取5只小鼠采血，分离血清。（1）利用纯化的重组n蛋白包被96孔板，建立elisa检测方法。（2）将待检血清进行1：100倍稀释后，取100μl加入96孔板中，37℃孵育1h。（3）每孔加入300μlpbst洗液，洗3次，拍干。（4）每孔加入100μl稀释的酶标羊抗鼠igg，37℃孵育1h。（5）每孔加入300μlpbst洗液，洗3次，拍干。（6）每孔加入100μl底物，避光反应15min。（7）每孔加入100μl终止液，用酶标仪测定od450读取光密度值。试验结果表明，免疫后2周，试验组1与试验组2的小鼠体内开始产生针对n蛋白的阳性抗体，免疫后6周抗体水平更高。其中，免疫rad-n-ires-ag85a重组腺病毒的小鼠体内n蛋白抗体水平明显高于免疫rad-n腺病毒小鼠体内的抗体水平，说明ag85a起到免疫增强作用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。