一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法与流程

本发明涉及一种构建表达alv-k囊膜蛋白的重组病毒的方法。此发明不仅为研究alv-k囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础，而且为临床检测alv-k中和抗体提供了靶向病毒。因此，本发明具有一定应用价值。

背景技术：

禽白血病病毒(avianleukosisvirus,alv)是可引起禽类患多种肿瘤及免疫抑制性疾病的反转录病毒。根据其囊膜蛋白特征，该病毒可分为a-k共11个亚群。其中a，b，j亚群较为常见，且j亚群目前在国内最为常见。alv-j感染主要造成鸡造血细胞恶性增生，引起髓细胞瘤、血管瘤及严重的免疫抑制，对国内外养禽业造成巨大经济损失。随着国内alv净化工作的推进，鸡群alv-j的感染及其发病率显著下降。alv-k是近年来在国内地方品种鸡中分离鉴定出的新型禽白血病病毒。由于alv-k病毒复制能力较弱，病毒蛋白表达水平较低，目前alv通用检测试剂盒对其检测效果不是很好，且尚无商品化特异性alv-k抗原及抗体检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供一种构建表达alv-k囊膜蛋白的重组病毒方法。本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的设计引物，pcr扩增alv-k囊膜蛋白基因片段和alv-j传染性克隆线性化载体，构建重组传染性克隆质粒，并将重组质粒转染df-1细胞拯救出表达alv-k囊膜蛋白的重组病毒。本发明利用alv-j传染性克隆，构建了高效复制及表达alv-k囊膜蛋白的重组病毒。这一重组病毒的获得不仅为研究alv-k囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础，更能够为临床检测alv-k的中和抗体提供靶向病毒。

本发明公开了pcr扩增alv-j传染性克隆线性化表达载体引物以及pcr扩增alv-k-env基因引物序列。本发明还公开了一种基于重组酶exnasetmii将线性化的alv-j传染性克隆表达载体与alv-k-env基因片段pcr产物不经酶切连接反应，直接重组克隆的技术；并通过转染df-1细胞获得表达alv-k囊膜蛋白的重组病毒，具体方案为：

(1)k亚群禽白血病病毒基因组的制备：首先将k亚群禽白血病病毒感染细胞后的上清经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无水乙醇沉淀，溶于30ul灭菌超纯水，即得alv-k前病毒dna，置-20℃备用；

(2)pcr扩增alv-kenv基因片段和alv-j传染性克隆线性化载体：首先设计出扩增alv-kenv基因的引物以及alv-j传染性克隆线性化载体的引物；然后以alv-j传染性克隆质粒以及alv-k前病毒dna为模板，利用相应引物分别pcr扩增出alv-k-env和线性化的alv-j线性化载体。

(3)alv-k-env-j重组表达载体的构建：利用重组酶exnasetmⅱ将线性化的alv-j载体以及alv-kenv基因的pcr产物进行快速体外重组克隆，重组克隆经序列验证后，命名为alv-k-env-j传染性克隆质粒，并挑取阳性细菌菌液进行质粒制备。

(4)将alv-k-env-j传染性克隆质粒转染df-1细胞，六天后将部分上清继续在df-1细胞上盲传3代。pcr检测盲传三代后提取的细胞基因组，以ifa及pcr方法检测盲传3代后的细胞上清，结果证明alv-k-env-j传染性克隆病毒拯救成功。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

第二，该发明设计的引物及基于重组酶exnasetmii的克隆策略，可快速构建重组alv传染性克隆，并拯救出表达alv-k囊膜蛋白的重组病毒。本发明可提供一种高效扩增具有alv-k囊膜蛋白抗原的病毒，不仅为研究alv-k囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础，更能够为临床检测alv-k的中和抗体提供靶向病毒，加快alv的净化进程，在alv净化检测中具有一定应用价值。

附图说明

图1pcr扩增alv-kenv基因片段和alv-j传染性克隆s2线性化载体图；

图1中：泳道m，dnamarker；泳道1，alv-kenv基因片段的pcr产物；泳道3，alv-j传染性克隆s2线性化载体的pcr产物。

图2pcr检测拯救出的重组病毒alv-k-env-j图；

图2中：泳道m，dnamarker；泳道1，alv-k-env-j重组病毒；泳道2，阴性对照；泳道3，alv-k阳性对照。

图3a是ifa检测拯救出的重组病毒alv-k-env-j重组病毒图；

图3b是ifa检测拯救出的alv-j病毒图；

图3c是ifa检测阴性对照图；

图4重组病毒alv-k-env-j在df-1细胞中的生长曲线图。

具体实施方式

下面将通过附图和具体实施方法对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。

实施例

(1)alv-k前病毒dna的制备：

取alv-k感染细胞后的上清400ul于1.5ml指形管内，加入400ul细胞裂解液(50mmol/ltris-hclph＝8.0，20mmol/ledtaph＝8.0，2％sds和蛋白酶k)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4h；加入400ultris平衡酚，充分混匀后10000rpm离心10min，取上清于另一1.5ml指形管；加入400ul酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000rpm离心5min，取上清于另一1.5ml指形管；加入800ul无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000rpm离心15分钟，弃尽上清；室温自然干燥后向沉淀加入30ul灭菌超纯水和2ulrna酶，充分溶解后即得alv-k前病毒dna，置-20℃备用。

(2)pcr扩增alv-kenv基因片段和alv-j传染性克隆线性化载体：

设计扩增出含alv-j传染性克隆线性化载体与alv-kenv基因片段的引物：扩增alv-j传染性克隆线性化载体的上游引物位于j1质粒7010-7039位；扩增alv-j传染性克隆线性化载体的下游引物位于j1质粒5292-5320位。扩增alv-kenv基因上游引物位于alv-k基因组5253-5274位，且在5’端带有15个与alv-j传染性克隆线性化载体下游引物反向互补碱基；扩增alv-kenv基因下游引物位于alv-k基因组7020-7040位，且在5’端带有15个与alv-j传染性克隆线性化载体上游引物反向互补碱基。具体引物序列见附表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

表1.pcr扩增alv-j线性化载体及alv-kenv基因的引物

分别以alv-j传染性克隆s2以及步骤(1)制备的k亚群禽白血病病毒基因组为模板，表1所述相应引物分别进行pcr，扩增出线性化的s2-linear载体以及alv-k-env基因序列。pcr扩增反应体系为：模板2ul，5×buffer10ul，10mmdntpmix1ul，上游引物为10μmol2ul，下游引物为10μmol2ul，高保真酶1ul，加入灭菌超纯水至50ul。pcr扩增反应循环参数为：95℃预变性4min，随后进行30个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min30s/1min)，72℃延伸10min。pcr结束后，产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图1所示)。

(3)alv-k-env-j重组表达载体的构建：

将(2)中纯化的线性化载体alv-j以及alv-kenv基因片段pcr产物在商品化重组酶exnasetmⅱ的作用下进行重组克隆。重组克隆经序列验证后，命名为pmd19t-simple-alv-k-env-j。具体重组反应体系如下：纯化的alv-kenv基因片段pcr产物50-100ng，纯化的alv-j线性化载体170ng，2μl商品化的exnasetmⅱ酶，4ul5×ceⅱbuffer，其它补加水至20μl。反应产物于37℃作用30分钟后，置冰上5min。随后将20μl反应产物转化到感受态细胞dh5α并涂lb平板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。

(4)重组病毒拯救

将df-1细胞接种于十二孔板，当汇合度为约70％时，将pmd19t-simple-alv-k-env-j传染性克隆质粒和alv-j传染性克隆质粒分别转染十二孔板中的df-1细胞，留一孔细胞作为阴性对照。每孔2μg质粒，37℃6h后换为含1％胎牛血清的dmem培养基。维持6天后各取1ml上清接种于另一铺有df-1的十二孔板，以相同方法继续盲传2代，并收取p2代、p3代细胞上清冻于-80℃留做检测。

(5)pcr检测拯救出的重组病毒alv-k-env-j

在收取p3代细胞上清后，以axygen基因组提取试剂盒提取细胞基因组作为模板，表1②与表2中所述引物分别进行pcr，检测重组病毒是否拯救成功以及是否单一。pcr反应体系为：模板2ul，5×buffer10ul，10mmdntpmix1ul，上游引物为10μmol2ul，下游引物为10μmol2ul，高保真酶1ul，加入灭菌超纯水至50ul；2×taq10ul，灭菌超纯水6ul，上游引物1ul，下游引物1ul，模板2ul。pcr扩增反应循环参数为：95℃预变性4min，随后进行30个循环(95℃变性30s，55℃/58℃退火30s，72℃延伸1min/45s)，72℃延伸10min。pcr结束后，产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。结果如图2、3a、3b、3c所示：alv-k-env-j传染性克隆病毒基因组作为模板pcr只扩增出k-env片段并且无其他亚群的alv的核酸。

(6)ifa检测拯救出的重组病毒alv-k-env-j

以ifa方法检测盲传3代后的alv-k-env-j拯救病毒和alv-j传染性克隆s2病毒的细胞上清：将df-1细胞接种于96孔板，当汇合度约为70％时，接种病毒，维持5天后，将细胞用50μl丙酮：乙醇比例为3：2的固定液固定5分钟，干燥；将50μl1：150稀释的抗j亚群禽白血病病毒p27单克隆抗体5d3为一抗与固定好的细胞于37℃孵育45分钟，弃去所有液体，以200μlpbs洗3遍；加入50μl1：150稀释的fitc标记的羊抗鼠igg为二抗于37℃孵育45分钟，弃去所有液体，以200μlpbs洗3遍，加入30μlpbs，于倒置荧光显微镜下进行观察。结果如图4所示，alv-k-env-j传染性克隆病毒组可见特异性的绿色荧光，表明重组病毒拯救成功。

(7)重组病毒alv-k-env-j生长曲线

将df-1铺于六孔板，当汇合度约70％时，按moi＝0.01分别接种alv-k-env-j拯救病毒和alv-j传染性克隆s2病毒，各做两个重复。24h后收取细胞上清200μl并补充200μl含1％胎牛血清的维持液，此后连续6天以同样方法定时收取并补充，上清冻存于-80℃冰箱备用。将alv-k-env-j传染性克隆病毒与alv-j传染性克隆s2病毒各自收取的7个时间点的细胞上清通过reed-muench法测定tcid50；利用graphpadprism5软件绘制病毒生长曲线。结果如图4所示：alv-k-env-j传染性克隆病毒与alv-j传染性克隆s2病毒相比，其生长速度远快于alv-j拯救病毒。

<110>扬州大学

<120>一种表达alv-k囊膜蛋白的重组病毒的构建方法

<160>4

seqidno.1

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

taggttccgaacgcgatgtaacggggcaag30

seqidno.2

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctgcaaagagagggctcgcctcatccttc29

seqidno.3

<210>3

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gccctctctttgcaggcatttctgactggatatcctg37

seqidno.4

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgcgttcggaacctacactgttccattttcgggctg36