一种真菌漆酶突变体PIE5及其表达菌株和应用的制作方法

本发明涉及一种真菌漆酶突变体pie5及其表达菌株和应用。

背景技术：

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，能够催化多种底物如酚类、芳胺类等氧化，当一些小分子物质作为介体存在时，漆酶能够进一步拓宽其氧化底物，并同时将o2还原成水。漆酶分布广泛，在植物、动物和微生物等当中均有分布。其中，微生物是漆酶的最主要来源物种。一般情况下，真菌漆酶具有较高的氧化还原电势(470-790mv)，以及较高的比活力(100-1,000u/mg)。相比较，细菌漆酶氧化还原电势较低(340-490mv)，比活力也低于真菌漆酶(0.1-10u/mg)。因此，真菌漆酶具有更广泛的应用价值。

由于真菌漆酶具有宽泛的底物特异性，它们在纸浆漂白、生物修复、染料降解、药物合成及生物降解等多种领域均有应用，具有重要的经济价值。目前，真菌漆酶在纺织整染特别是靛蓝脱色中应用最为广泛。在牛仔布的整染过程中，真菌漆酶可用于浮石洗涤过程，也可以用于后期的靛蓝降解过程。由于真菌漆酶仅能在酸性条件下发挥最佳活性(ph值3-5)，而在中性或碱性条件下，真菌漆酶虽然比较稳定，但是几乎无活力。因此，在牛仔布的整染过程中，需要将洗涤的ph值控制在5左右，而在反应结束后，需要将废水的ph调整到中性，这一过程增加了洗涤的成本，同时提高了水中的盐离子的浓度，不利于后期处理和环境保护。通过蛋白质工程改造，获得能在中性或碱性条件下发挥良好活性的真菌漆酶蛋白，将有利于改进真菌漆酶的纺织整染工艺，降低运行成本，保护生态环境。

技术实现要素：

本发明基于现有技术的缺陷，旨在提供一种真菌漆酶突变体pie5及其表达菌株和应用。

本发明真菌漆酶突变体pie5，是以定向进化手段对灰盖鬼伞漆酶lcc9进行改造，构建突变文库，结合三轮筛选方法，获得的漆酶突变体，以提高漆酶的应用能力。

本发明真菌漆酶突变体pie5，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

本发明真菌漆酶突变体pie5，其氨基酸序列为seqidno：1经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。

表达本发明真菌漆酶突变体pie5的菌株，含有耐受碱性ph的真菌漆酶蛋白的编码基因，分类命名为pichiapastorisppic9k-pie5，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2018年7月19日，保藏编号：cctccno：m2018451。

本发明真菌漆酶突变体pie5的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将菌株pichiapastoris/ppic9k-pie5接种于种子液体培养基中进行发酵，在15-35℃、100-250rpm/min条件下培养至菌体od600＝2～6；将菌体离心后，用发酵液体培养基重悬细胞至od600＝0.5-2.0，每隔24h加入甲醇使其中甲醇浓度为0.3-2.0％；将诱导后的发酵液离心后获得上清液，即为真菌漆酶粗酶液；

步骤2：将步骤1所得真菌漆酶粗酶液在4-10℃、0.1-0.5mpa条件下进行浓缩超滤，获得浓缩粗酶液；随后以ph值3.5-6.5，更优选为ph值6.5、浓度为20mm的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在4-10℃进行透析三次以更换蛋白保存缓冲液；再以deae-sepharosefastflow阴离子交换柱对真菌漆酶进行纯化，获得真菌漆酶pie5蛋白，并以凝胶电泳检测蛋白纯度。

所述种子液体培养基的溶剂为ph值3.5-6.5、0.1m的pbs缓冲液，溶质及其浓度如下：yeastextract10g/l、tryptone20g/l、ynb13.4g/l、甘油10g/l、生物素4×10^-4g/l。

所述发酵液体培养基的溶剂为ph值3.5-6.5、0.1m的pbs缓冲液，溶质及其浓度如下：ynb13.4g/l、甲醇5g/l、硫酸铜1.5×10^-2g/l、生物素4×10^-4g/l。

本发明真菌漆酶突变体pie5的用途，是在染料脱色过程中作为脱色氧化剂的应用。

所述染料脱色优选为靛蓝脱色过程。

本发明真菌漆酶突变体pie5的应用，是在染料脱色过程中作为脱色氧化剂使用，具体包括如下步骤：

在反应体系ph值4.5-9.0、温度20-80℃、漆酶pie5浓度40-200u/l、介体浓度20-300μm的条件下，对靛蓝染料进行脱色处理，靛蓝的脱色率达到83％以上。

所述介体为丁香醛(dhb)、丁香酸(sa)、丁香酸甲酯(ms)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)或1-羟基苯并三唑(hbt)。

当以丁香酸甲酯ms为介体时，将pie5用于靛蓝脱色，优化后最适反应体系为：靛蓝浓度200μm、pie5酶量160u/l、介体ms浓度120μm、体系ph为7.5下在60℃中反应50min，靛蓝脱色率达到83.1±1.1％(图2)。

当以abts为介体时，将pie5用于靛蓝脱色，优化后最适反应体系为：靛蓝浓度200μm、pie5酶量180u/l、介体abts浓度200μm、体系ph为7.0下在60℃中反应180min，靛蓝脱色率达到90.9±0.3％(图3)。

本发明对不同类型真菌漆酶对靛蓝的脱色能力，同时对比市售漆酶，优选为诺维信漆酶制剂对靛蓝的脱色能力比较。本发明以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)为漆酶底物，每隔24h检测发酵过程中漆酶活力变化。酶活检测体系在30℃下反应3min后立即冰浴30s，在420nm处检测吸光值并计算酶活，定义一个单位的酶活(u)为一分钟内转化1μm底物所需的酶量。本发明中真菌漆酶活力均是以abts为底物所测。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

真菌漆酶具有更为广泛的应用价值，但其催化ph一般在酸性3-5，所以在碱性环境下限制了真菌漆酶的应用。本发明获得一个真菌漆酶突变体pie5，最适催化ph为8.5(愈创木酚为底物)，而且在ph至9.5时仍能够发挥良好活性，因此真菌漆酶pie5相比之下具有碱性环境的应用优势，扩宽了真菌漆酶的应用领域，比如本发明将真菌漆酶pie5用于纺织整染工艺中的靛蓝染料脱色中以取代传统工艺。纺织整染是真菌漆酶应用较为广泛的方向之一，传统在纺织整染中使用石磨水洗进行牛仔布仿旧处理，以及在染料废水处理时用传统使用物理吸附等手段。但这些方式不够绿色环保，真菌漆酶是一种绿色催化剂，能够氧化降解靛蓝，但纺织整染工艺的碱性环境限制了大部分真菌漆酶的应用，本发明所获得碱性真菌漆酶pie5可用于纺织整染工艺尤其是靛蓝脱色中。碱性突变体pie5可直接应用于纺织整染工艺代替石磨水洗，在废水靛蓝降解中也无需调整废水ph，将有利于改进真菌漆酶的纺织整染工艺，降低运行成本，保护生态环境。

附图说明

图1是真菌漆酶pie5纯化后电泳检测，m为蛋白maker，pie5为混合后漆酶纯蛋白。从图1中可以看出目标条带pie5纯度较高，其大小约为61kda。

图2是以ms为介体时pie5脱色靛蓝体系优化结果，其中a表示ph对脱色率的影响，b表示温度对脱色率的影响，c表示酶量对脱色率的影响，d表示介体浓度对脱色率的影响。从图2中可以看出，反应参数对pie5脱色靛蓝的影响很大，ph和温度影响酶的催化活性，使脱色率呈先增后降的趋势，随酶量及介体浓度的增加脱色率呈先增后趋于平稳的趋势。

图3是以ms为介体时pie5用于靛蓝氧化脱色，其中a表示不同时间下的靛蓝脱色率变化，b表示不同时间下靛蓝脱色效果。从图3中可以看出在介体ms作用下，pie5对靛蓝有明显的脱色效果，从图a中看出靛蓝脱色率随反应时间延长而增加，至反应50min后趋于稳定。从图b中看出随反应时间延长，溶液颜色逐渐澄清，靛蓝被氧化脱色。

图4是以abts为介体时pie5脱色靛蓝体系优化结果，其中a表示ph对脱色率的影响，b表示温度对脱色率的影响，c表示酶量对脱色率的影响，d表示介体浓度对脱色率的影响。从图4中可以看出，反应参数对pie5脱色靛蓝的影响很大，ph和温度影响酶的催化活性，使脱色率呈先增后降的趋势，随酶量及介体浓度的增加脱色率呈先增后趋于平稳的趋势。

图5是以abts为介体时pie5用于靛蓝氧化脱色，其中a表示不同时间下的靛蓝脱色率变化，b表示不同时间下靛蓝脱色效果。从图5中可以看出在介体abts作用下，pie5能够氧化脱色靛蓝，图a显示靛蓝脱色率随反应时间延长而增加，至反应180min后趋于稳定。图b显示随反应时间延长，溶液颜色逐渐澄清，靛蓝被氧化脱色。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法均为本领域中公知的常规方法。

1、真菌漆酶pie5的制备

菌株：e.colijm109、p.pastorisgs115

载体：ppic9k

培养基：

ypd培养基(1l)：20gpeptone，10gyeastextract溶于900ml水中，高压灭菌后，加入100ml10×d，固体培养基添加1.5％的琼脂。

种子液体培养基的溶剂为ph值6.0、0.1m的pbs缓冲液，溶质及其浓度如下：yeastextract10g/l、tryptone20g/l、ynb13.4g/l、甘油10g/l、生物素4×10^-4g/l。

发酵液体培养基的溶剂为ph值6.0、0.1m的pbs缓冲液，溶质及其浓度如下：ynb13.4g/l、甲醇5g/l、硫酸铜1.5×10^-2g/l、生物素4×10^-4g/l。

1.1突变体pie5编码基因的获得及重组质粒的构建

以灰盖鬼伞漆酶lcc9的cdna为模板，以如下引物(下划线为突变位点序列)在氨基酸序列中引入e116k、n229d、i393t三处位点突变。

116f：gcattgaacctgtacttaaacgactctc

116r：gagagtcgtttaagtacaggttcaatgc

229f：gaacttgtagtcgggatcgcacg

229r：tcgtgcgatcccgactacaagttc

393f：ggcaaagtatgggtcgcaccac

393r：agtggtgcgacccatactttgcc

pie5f：cggaattccaaatccttggcccg(下划线部分为ecori的识别序列)

pie5r：aaggaaaaaagcggccgcttaaggagtgg(下划线部分为noti的识别序列)

以常规pcr方式扩增并获得突变体pie5编码基因，并在全长序列扩增时引入ecori和noti两处酶切位点。pcr反应体系50μl，反应条件为：95℃预变性2min，随后进行30个循环(95℃20s，57℃20s，72℃1.5min)，循环后72℃延伸10min，最后4℃保温，取10μlpcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。以axyprepdna凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将pie5目的片段。

以ecori和noti两种限制内切酶分别将回收后的pie5目的片段和ppic9k载体于37℃水浴中双酶切8h，通过axyprepdna凝胶回收试剂盒将两组酶切产物回收后，各取100ng回收产物，在t4连接酶作用下于16℃环境中将pie5编码基因正向插入ppic9k的ecori和noti酶切位点之间，获得重组质粒。

1.2突变体pie5重组表达菌株的构建

将重组质粒转入e.colijm109感受态细胞中于，转化产物涂板于lb(含100mg/l氨苄青霉素)平板在37℃培养。随机挑取部分单克隆，以菌落pcr方式验证阳性克隆。将阳性克隆接种于含有5ml液体lb(含100mg/l氨苄青霉素)试管中，于37℃、200rpm进行培养。过夜培养后，离心弃上清收集菌体，以axyprep质粒回收试剂盒提取重组质粒。以saci限制性内切酶将6μg的重组质粒于37℃中充分单酶切，获得线性化质粒，axyprepdna凝胶回收试剂盒将线性化质粒回收。

将回收后线性化的重组质粒以电转方式转入p.pastorisgs115感受态细胞中，于28℃中以ypd平板进行培养，以含有abts的bmm检测平板挑选阳性克隆，筛选获得pie5重组表达菌株。将获得的重组菌株挑至bmgy培养基中于28℃、200rpm条件培养后保存于15％的甘油管中，放置于-80℃中以保菌。

1.3发酵培养

在28℃、200rpm条件下，将保存于甘油管中的菌株接种于含50ml液体bmgy培养基的250ml摇瓶中培养至菌体生物量od600值至2.0-6.0。离心菌体，以100ml发酵液bmm液体培养基重悬菌体，至菌体od600值为1.0，继续培养并每隔24h添加甲醇使其中甲醇浓度为0.5％，并以abts检测发酵液中漆酶pie5活力变化。

abts检测体系为：取ph4.0的酒石酸钠缓冲液950μl，加入浓度为0.5mm的abts母液33μl，于30℃水浴中预热3min后加入17μl漆酶液。混匀后反应体系在30℃下反应3min后立即冰浴30s，在420nm处检测吸光值并计算酶活，定义一个单位的酶活(u)为一分钟内转化1μm底物所需的酶量。

1.4粗酶液获得

连续检测漆酶活力开始下降时，结束发酵并收集发酵液，在4℃、8000g下离心30min，弃沉淀收集上清液1l，为pie5粗酶液。使用350ml规格超滤装置在4℃、0.3mpa条件下对粗酶液进行浓缩超滤，获得真菌漆酶pie5浓缩粗酶液20ml。

配制ph6.5，浓度为20mm的磷酸氢二钠-柠檬酸透析缓冲液3l，将pie5浓缩粗酶液置于透析袋中。在4℃环境中，将透析袋置于缓冲液中进行透析更换漆酶缓冲体系。每隔5h更换一次透析缓冲液，连续透析三次，获得漆酶pie5粗酶液约21ml。

1.5真菌漆酶pie5纯化

以阴离子交换柱：deae-sepharosefastflow纯化真菌漆酶，配制纯化溶液：

低盐：20mm磷酸氢二钠-柠檬酸ph6.5；

高盐：在低盐缓冲液中加入150mm的硫酸铵；

nacl：浓度为1m的nacl溶液500ml；

naoh：浓度为1m的naoh溶液500ml；

乙醇：体积分数为20％乙醇溶液1l；

h2o：超纯水1l。

将配制完成的溶液均进行抽滤后超声除气。蛋白纯化具体步骤如下：

①调节仪器流速1.0ml/min，安装阴离子交换柱，使用20％乙醇冲洗柱体40min；

②冲洗柱体，依次更换h2o→nacl→h2o→naoh→h2o→高盐→h2o→低盐，每次更换均冲洗40min。

③将透析后的pie5粗酶液上样至柱中，调节高盐浓度，依次从低到高(0％-100％)进行洗脱蛋白，并收集洗脱液。

④检测：以15％的sds-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)检测收集洗脱液中的蛋白纯度，收集目标蛋白较纯的洗脱液，混合后备用(图1)。

2、漆酶pie5用于靛蓝脱色

称取5.25g靛蓝、4g氢氧化钠、2g二氧化硫脲至1l水中，将混合液加热至50℃溶解配制靛蓝溶液。以二甲基亚砜(dmso)为溶剂，配制介体丁香酸甲酯(ms)和abts母液浓度为10mm。

构建漆酶氧化脱色靛蓝初始反应体系1ml：靛蓝200μm、pie5酶活200u/l、介体浓度100μm，以ph7.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液补齐至1ml。体系在40℃反应3h后，于700nm处检测反应前后吸光值变化，并计算脱色率，以脱色率为评价标准优化并建立漆酶氧化靛蓝脱色体系。脱色率计算公式如下：

脱色率＝(a0-a1)/a0×100％

a0为反应前体系初始吸光值，a1为反应后体系吸光值。

2.1以ms为介体用于靛蓝脱色

当以丁香酸甲酯ms为介体时，将pie5用于靛蓝脱色，在反应体系的优化中，分别对影响脱色效果的温度、酶量、ph、介体浓度等参数进行了优化，以脱色率为评价标准，优化后最适反应体系为：靛蓝浓度200μm、pie5酶量160u/l、介体ms浓度120μm、体系ph为7.5下在60℃中反应50min，靛蓝脱色率达到83.1±1.1％(图2-3)。

2.2以abts为介体用于靛蓝脱色

当以abts为介体时，将pie5用于靛蓝脱色，在反应体系的优化中，分别对影响脱色效果的温度、酶量、ph、介体浓度等参数进行了优化，以脱色率为评价标准，优化后最适反应体系为：靛蓝浓度200μm、pie5酶量180u/l、介体abts浓度200μm、体系ph为7.0下在60℃中反应180min，靛蓝脱色率达到90.9±0.3％(图4-5)。

seqidno：1

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<120>一种真菌漆酶突变体pie5及其表达菌株和应用

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