一种真菌漆酶诱导活性化合物及其发酵制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明属化合物分离纯化【技术领域】，涉及一种微生物来源的新型真菌漆酶高效诱导化合物的发酵制备、分离纯化工艺，及其在诱导真菌漆酶生产方面的应用。其特征在于包括下述步骤：通过真菌发酵制备含有活性化合物的发酵液，经过萃取获得的活性化合物粗提物依次经不同层析树脂吸附，以不同浓度甲醇-水作为洗脱剂纯化精制，最终获得纯化的活性化合物分子；获得的活性化合物在1～500μM浓度下可以高效诱导漆酶生产真菌分泌胞外漆酶。本发明具有以下优点：诱导化合物来源于真菌次级代谢产物；诱导化合物工作浓度低，有效工作浓度为1～500μM；诱导化合物具有高的真菌漆酶诱导活性。
【专利说明】一种真菌漆酶诱导活性化合物及其发酵制备方法与应用
[0001]本申请是申请日为2012年5月7日，申请号为2012101384476，发明名称为“一种真菌漆酶诱导活性化合物及其发酵制备方法与应用”的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明属于化合物分离纯化【技术领域】，涉及一种微生物来源的真菌漆酶诱导活性化合物的发酵制备、高纯度漆酶诱导活性化合物的纯化工艺及其在真菌漆酶诱导方面的应用。
【背景技术】
[0003]漆酶(Laccase，ECl.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类化合物氧化，同时伴随有分子氧还原成水。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制浆和漂白、食品风味改良、饲料营养改善、人工合成染料脱色、纺织纤维软化细化、新型药物开发、生物传感器制造及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值(Arora DS, SharmaRK(2010)Ligninolytic fungal laccases and their biotechnological applications.Appl Biochem Biotechnol 160:1760 - 1788),近年来成为国际酶工程学和环境科学交叉领域研究的一个热点。
[0004]漆酶广泛存在于高等真菌(特别是担子菌)中。多数真菌分泌的天然漆酶存在产量低、发酵周期长、后处理繁琐等缺点，无法满足工业化应用的需要。目前，用来提高漆酶的生物合成产量主要有两种方法:重组表达和添加化合物诱导。然而，重组表达产量依然较低、且生产成本高、后处理难度大，使漆酶生产的成本大大提高，限制了漆酶在工业生产中的应用；有效的诱导剂多为芳香类化合物或重金属离子，其有环境毒性并且价格昂贵，有效作用浓度大，通常在10_3~10_2摩尔级别，易造成环境污染，生产后的发酵液需要脱毒处理，提高了生产成本，同样无法突破漆酶产业化应用的瓶颈。因此，寻找一种清洁、高效的漆酶生产方式是推进漆酶产业化进程的迫切需要。
【发明内容】
[0005]本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种高效真菌漆酶诱导活性化合物(名称为3-羟基-2-辛基-戊二酸)的发酵制备和分离纯化工艺及其在真菌漆酶诱导发酵方面的应用。
[0006]本发明的目的之一是提供一种对真菌漆酶具有高诱导活性的化合物，该化合物有如下分子式:
[0007]
【权利要求】
1.一种对真菌漆酶具有高诱导活性的化合物的发酵制备方法，其特征在于:使用的发酵菌株为Gongronella sp.，经发酵培养获得发酵液，所述发酵液经分离纯化后获得如下分子式的纯活性化合物:
2.根据权利要求1所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于:所述发酵培养是指将Gongronella sp.接种在经灭菌的ρΗ4.0~7.0的发酵培养基中，于温度25~31°C、摇床转速100~150rpm条件下培养3~7天后通过纱布过滤收集发酵液备用；所述的发酵培养基为每升水中含10~20g蔗糖、I~2g DL-天冬酰胺、0.7~1.5g KH2PO4、0.2~0.6gMgSO4.7Η20、0.02 ~0.15gNa2P04.7Η20、0.01 ~0.05g CaCl2,0.01 ~0.05g FeSO4.7H20、0.01 ~0.04g 腺嘌呤、20 ~60μ g VB1O
3.根据权利要求2所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基为每升水中含15g蔗糖、1.5g DL-天冬酰胺、Ig KH2P04、0.5g MgSO4.7H20、0.1gNa2PO4.7Η20、0.01g CaCl2,0.01g FeSO4.7Η20、0.0275g 腺嘌呤、50 μ g VB10
4.根据权利要求2所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于，所述分离纯化依次包括以下步骤: (1)制备的发酵液通过萃取剂体积比1:1萃取，萃取液在100~2000Pa，30~55°C的条件下减压蒸馏，去除萃取剂，得到活性化合物粗制品；所述萃取剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚中的任意一种； (2)将粗制品通过甲醇溶解，按照粗制品与层析树脂A质量比1:10~20上样，使用体积浓度20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个浓度洗脱3~5柱体积，收集合并活性化合物组分并在100~2000Pa，30~55°C的条件下减压蒸馏浓缩收集的层析组分，得浓缩产物一； (3)步骤(2)中获得的浓缩产物一通过甲醇溶解，按照粗制品与层析树脂B质量比1:10~20上样，使用体积浓度20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个浓度洗脱3~5柱体积，收集合并含活性化合物组分并在100~2000Pa，30~55°C的条件下减压蒸馏，得浓缩产物二 ； (4)步骤(3)中获得的浓缩产物二通过甲醇溶解，按照粗制品与层析树脂C质量比1:10~20上样，使用体积20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脱，每个浓度洗脱3~5柱体积，收集合并含活性化合物组分并在100~2000Pa，30~55°C的条件下减压蒸馏获得纯物质。
5.根据权利要求4所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述的层析树脂A为市售D101、LX-60非极性大孔树脂。
6.根据权利要求4所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的层析树脂B为市售MCI GEL CHP20P MCI系列精细层析树脂。
7.根据权利要求4所述的活性化合物的发酵制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的层析树脂C为市售十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)非极性层析树脂。
【文档编号】C07C59/245GK103834695SQ201410085685
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年5月7日 优先权日:2012年5月7日
【发明者】肖亚中, 方泽民, 刘娟娟, 洪宇植, 房伟 申请人:安徽大学