一种PBMC细胞的制备方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种pbmc细胞的制备的方法。

背景技术：

细胞治疗是一种从人或者动物的组织、血液等，分离提取其中一部分细胞，直接回输给人或者动物，或者将提取的部分细胞通过筛选、基因修饰、诱导分化、培养扩增等手段，再回输给人或者动物的一种治疗方式。细胞免疫治疗方法是近年快速发展的针对多种疾病的细胞治疗方法，通过回输体外筛选、修饰、诱导、扩增的组织或血液中的淋巴细胞达到治愈疾病的目的。常见应用包括制备树突状细胞(dc)，t细胞、nk细胞治疗癌症；制备treg细胞治疗自身免疫疾病和治疗不孕不育、过敏、病毒感染等多种疾病。

细胞制备指细胞治疗过程中所使用细胞的制备过程；以用于癌症治疗的杀伤性t细胞为例，一般可以分为外周血采集→外周血单个核细胞(pbmc)分离→特定种群淋巴细胞分离→细胞激活→细胞孵育→病毒转染→细胞扩增→细胞洗涤后制剂→细胞回输等多个步骤；根据不同的技术原理和临床应用需求，上述过程步骤可进行适当组合和调整，比如细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)治疗的过程可以总结为：外周血采集→pbmc细胞分离→细胞激活→细胞孵育→细胞扩增→细胞洗涤后制剂→细胞回输；嵌合抗原受体t细胞(car-t)免疫疗法是目前细胞治疗技术手段较为先进和复杂的代表，car-t细胞的制备需要完成前述细胞制备的大部分或者全部过程。由于car-t技术面世不久且工艺复杂，市面上缺少为其专门开发优化的自动化设备，所以目前大部分的car-t治疗临床研究的细胞制备过程还是以类似实验室的手工制备方法为主。随着细胞治疗产业的发展，细胞制备的一致性得到越来越多的关注，如何能克服开放式的手工制备操作所造成的微生物污染和样品间的交叉污染问题，以及由于不同操作技术人员的熟练度所造成的批间差问题，是推动细胞治疗技术面向临床最后能达到细胞药品制备标准的重要基础；因此使用自动化设备单独完成细胞制备过程中的每一个步骤并且达到最小的、稳定的批间差，将是完成细胞治疗技术向细胞药品制备标准迈进的重要手段。

cn1331610公开了一种分离生物液为成分的系统，包括一组接收要分离的生物液和已分离成分的容器，可任选的接受添加剂溶液的另一个容器和一空心离心处理室，它具有轴向的生物液进/出口；处理室具有活动活塞，以引入定量的生物液并通过出口挤出处理过的生物液成分；光学装置监测活塞位置，以控制吸入液和成分的挤出；一压力调节阀装置选择性的连通处理室和容器，或将它们的连通切断；将该系统列陈以独立模式和非独立传递模式运行，尤其是用于在已分离造血干细胞中加入防腐溶液；在独立模式下，液体被吸入处理室，离心并被分离成成分，成分用密度梯度产物尽可能的挤出；在传递模式下，处理室在静止的情况下吸入并挤出液体，阀门驱动装置利用活塞的运动，将液体从一个容器通过处理室传递到另一个容器，而不离心或分离，而用于监测活塞位置的装置控制传递的未分离液体量。cn105263611a公开了一种用于在受控的温度下混合包含在柔性的储存袋中的生物标本的混合装置，所述混合装置包括支架，用于支承包含待混合生物标本的储存袋，用于使得支架上的储存袋中的标本发生移位以混合标本的构件；以及用于在混合期间将所述标本保持在受控温度下的温度控制装置，用于使标本移位的构件包括至少一个可膨胀/可收缩的袋即气囊，当膨胀时至少一个可膨胀/可收缩的袋接触储存袋的一部分的表面，以逐渐地挤压储存袋，并且将所包含的标本移位到储存袋的另一部分中。cn101146559公开了一种特别用于在再生医学中修复器官的用于细胞亚群抽出、收集、处理和移植的系统，所述细胞亚群包括成人干细胞和血小板，所述系统包括由一次性无菌的流体运送元件组成的一套组件，所述流体运送元件是预连接的、或包括无菌连接器、或适于在其间以无菌方式互连；该组件通常包括三个一次性无菌元件的成套装置：收集成套装置、处理成套装置和移植成套装置，三个成套装置包括在如托盘之类的支承件上的泡罩型包装，该包装有一个隔室，用于接收所述组件的各互连的成套装置。所述组件包括抽出装置，例如包括用于刺穿骨头或血管的针，用来从病人抽出骨髓或其它细胞亚群源。cn107635668a公开了一种用于将生物流体处理并分离成组分的装置，包括中空的离心处理室，其装配有入口/出口头部并且优选装配有能够轴向运动的活塞。所述入口/出口头部具有两个分开的入口/出口，例如轴向入口和侧向出口，所述处理室(1)装配有内部导流件，使装置能够在连续处理模式中操作，其中待处理的生物流体被所述轴向入口连续导入，与此同时，已处理的组分经由所述侧向出口连续去除。所述连续处理流动可以由外部蠕动泵和/或由活塞在所述室中的轴向位移驱动。但上述现有技术构造复杂，有待进一步优化。

综上所述，提供一种能单独且稳定地完成pbmc细胞的制备，降低操作污染和提高细胞制备的成功率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种pbmc细胞的制备方法，所述方法采用制备细胞的设备，所述设备利用称重传感器替代光栅，并增加了进气装置和液体传感器，本发明的方法优化整体设备中各装置的连用关系，简化设备操作流程，各装置各步骤相互配合，提高了细胞分离的效率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种pbmc细胞的制备方法，所述方法采用制备细胞的设备，所述设备包括进样装置、收集装置、补液装置、离心培养装置、液体传感器装置、气体交换装置和称重组件装置；

所述液体传感器装置包括第一液体传感器和第二液体传感器，其中，第一液体传感器与进样装置相连，第二液体传感器与离心培养装置相连；

所述称重组件装置包括称重传感器，分别设置于所述进样装置、收集装置、离心培养装置和补液装置上；

其中，进样装置、离心培养装置、气体交换装置、补液装置和收集装置依次连接；

所述方法包括如下步骤：

采用梯度离心法在离心培养装置内进行离心，通过液体传感器装置、离心培养装置、称重组件装置和阀门装置相互配合调节液体流动，将样品中的细胞分离至收集装置。

本发明中，发明人为实现更为高效简洁的制备细胞，增加了进气装置和液体颜色传感器，采用称重传感器替换了光栅，降低机器成本，并根据该设备研发了一套方法，对细胞分离的流程反复钻研实践，攻克多个单元间无法联用的难题，优化各装置各步骤的连接关系和使用顺序，避免多步操作的污染和降低人工成本，顺利实现简洁高效的pbmc细胞的制备过程。

本发明中，所述称重传感器替换了光栅，设置于进样装置、收集装置、离心培养装置和补液装置上，通过对收集袋或样品袋等耗材的重量感应检测，反馈控制系统；所述进气装置调节离心培养装置及管路间的气体交换与流动，所述液体传感器装置分别设置于进样装置和离心培养装置，监控调节设备的关键组件和方法的主要步骤；所述方法中的各步骤与设备的各装置相互匹配，协同联动，最终实现高效简洁的制备细胞的目的。

优选地，所述进样装置包括血袋连接器1、血块滤器31和第一管夹8。

优选地，所述血袋连接器1、血块滤器31和第一管夹8依次连接。

优选地，所述进样装置通过第一液体传感器4与第一阀门15相连。

优选地，所述离心培养装置包括淋巴分离液袋5、第一液体滤器21、第二管夹11、第一阀门15、第一注射口22、第二注射口23、温控模块48、动态密封模块27、离心桶29、活塞28和第一气体滤器30。

优选地，所述第一液体滤器21、淋巴分离液袋5、第二管夹11、第一阀门15、第二液体传感器45、第一注射口22、第二注射口23、动态密封模块27、离心桶29和第一气体滤器30依次连接。

优选地，所述离心桶29内部含有活塞28。

优选地，所述离心桶29外部含有温控模块48。

优选地，所述设备还包括离心驱动装置和气动装置。

优选地，所述离心驱动装置包括旋转电机49和传动装置50。

优选地，所述离心驱动装置与离心培养装置相连。

优选地，所述气动装置包括第一气压检测器43和气压控制装置51。

优选地，所述气动装置与离心培养装置相连。

优选地，所述气体交换装置包括第二气压检测器42、第五阀门46和气路接头61。

优选地，所述第五阀门46、第二气压检测器42和气路接头61依次连接。

优选地，所述补液装置包括生理盐水连接器、培养基袋4、第三管夹9、第三阀门16、第四阀门17、第四管夹10和第二液体滤器20。

优选地，所述生理盐水连接器通过第三管夹9与第四阀门17依次连接。

优选地，所述第二液体滤器20、培养基袋4、第四管夹10与第四阀门17依次连接，所述第三阀门16和第四阀门17连接。

优选地，所述收集装置包括第五管夹12、第七管夹14、收集袋6、第三注射口24、第四注射口25和取样袋26。

优选地，所述取样袋26、第五管夹12、收集袋6和第三阀门16依次连接。

优选地，所述收集袋6还连接有第三注射口24和第四注射口25。

优选地，所述阀门包括电磁阀、夹管阀或旋转阀中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述设备包括壳体结构。

优选地，所述壳体结构上嵌有阀门旋转机构52、阀门旋转机构53、阀门旋转机构54、离心桶夹具62、第一液体传感器44、第二液体传感器45、气路接头61和可控磁铁47。

优选地，所述壳体结构上还分布有2-10个称重传感器，例如可以是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。

优选地，所述壳体装置还包括人机界面56。

优选地，所述方法在分离细胞之前还包括初始化步骤。

所述初始化的步骤包括准备样品、连接耗材并进行自检。

优选地，所述耗材包括血液样品袋35、淋巴分离液袋5、收集袋6、生理盐水袋33、生理盐水袋34、培养基袋4和离心桶29。

其中，所述初始化的详细操作为：

准备样品：将管路中所有管夹夹住，封闭管路，将培养基和淋巴分离液分别通过滤器注入耗材指定的储液袋当中，将血液样品和生理盐水，通过耗材的连接部件分别进行相连。

连接耗材：按照顺序，将血液样品、生理盐水、淋巴分离液、收集袋挂在机器上，将三通阀按照次序与机器的三通阀旋转机构相连，将离心桶与设备相连并固定，将气体滤器与设备相连，将管路卡入第一液体传感器、第二液体传感器。

自检：将管路中的管夹(除样品收集袋的管夹)松开，通过第一液体传感器、第二液体传感器对检测管路进行检测，通过气压控制装置、第一气压传感器和第二气压传感器对管路密闭性进行检测。

其中，制备细胞的操作为：

通过淋巴分离液(ficoll)梯度离心的方法分离外周血单个核细胞(pbmc)，步骤如下：离心桶旋转，将ficoll注入离心桶，将样品(外周血或单采成分血)缓慢注入离心桶，在离心作用下，红细胞穿透淋巴分离液，pbmc细胞在淋巴分离液上面，达到分离效果，可通过在桶内加入空气的方式，增加离心距离，从而减小离心时间，再通过活塞上推，配合第二液体传感器，将不同成分进行分离，将部分血浆、pbmc细胞、部分淋巴分离液，进行收集，转入收集袋，将部分淋巴分离液、红细胞，转入样品袋；将分离得到的pbmc细胞进行生理盐水离心清洗，直接收集或进行细胞制备的后续操作。

其中，制备细胞的详细操作为：

通过控制活塞，将血液样品缓慢抽取至第一液体传感器处，停止抽取，将淋巴分离液抽入离心桶，并开始离心，将血液样品抽入离心桶，等待一段时间(如15分钟)，液体将在离心桶内由内至外分为血浆层、pbmc细胞层、淋巴分离液、红细胞四层，通过活塞将离心桶内液体缓慢推出，在离心作用下，液体将依次由内至外推出，通过第二液体传感器对经过的液体进行检测分析，配合旋转三通阀和管路将不同液体成分收集至不同的收集袋中，将血清前半部分推向原始的血液样品袋，将血清后半部分连同pbmc细胞层、淋巴分离液的前半部分推向收集袋，将淋巴分离液后半部分和红细胞推向废液袋或血液样品袋。

优选地，所述方法在分离细胞之后还包括冲洗管路的步骤；

优选地，所述冲洗管路的步骤为：将补液装置中的生理盐水抽入离心桶29内，再排至淋巴分离液袋5中。

优选地，所述冲洗管路的次数为1-6次，例如可以是1次、2次、3次、4次、5次或6次。

其中，所述清洗管路的操作具体为：

将离心桶管路与生理盐水管路相连，通过活塞将生理盐水抽入离心桶，再将生理盐水排出至淋巴分离液袋/废液袋，可重复多次以达到彻底清洗的目的。

作为优选技术方案，一种pbmc细胞的制备方法，采用所述设备，具体包括如下步骤：

(1)准备样品、连接耗材并进行自检，所述耗材包括血液样品袋35、淋巴分离液袋5、收集袋6、生理盐水袋33-34、培养基袋4和离心桶29；

(2)采用梯度离心法在离心培养装置内进行离心，通过液体传感器装置、离心培养装置、称重组件装置和阀门装置相互配合调节液体流动，将样品中的细胞分离至收集装置；

(3)将补液装置中的生理盐水抽入离心桶29内，再排至淋巴分离液袋5中，重复多次以冲洗管路。

具体地，本发明包括如下系统和装置：

1、耗材系统

该系统包含有一组液体收容袋和一个离心容器，离心容器内有活塞，活塞可以上下移动，可吸入或者推入液体，以实现可变的离心体积，配合管路液路方向的切换，可以将离心后产品收集到对应的液体收容袋中，该系统还包含有4个旋转三通阀，可以通过阀门方向的切换来实现耗材系统管路液体的流动方向。

2、细胞分离系统(机器)

①该系统包含了一套耗材系统；

②该系统包含一套驱动耗材离心容器旋转以及活塞上下移动的离心驱动装置，该装置包含有电机(驱动离心容器旋转)，气泵、电磁阀、动态密封结构(给离心容器吹气或者抽气，从而实现活塞上下运动)，第二气压传感器(检测离心容器的压力，检测活塞的极限位置)；

③该系统包含有一套温控模块，该模块可以保证离心容器在一定温度下(比如37度)工作，该装置具备加热、保温、温度检测、温度补偿的功能。

④该系统包含有2个液体颜色传感器装置，该装置能检测出流过该装置的液体的颜色，配合旋转三通阀，可实现将不同的颜色的液体分到不同的收集袋。

⑤该系统包含有4个旋转三通阀的驱动装置，用来驱动旋转三通阀，或者该装置也可用其他的电磁阀来替代，阀门的切换可以实现耗材管路可流动的方向的改变。

⑥该系统包含有一个能给管路耗材系统提进气体、检测管路耗材系统密封性的气体交换装置，其中有压力传感器(能检测管路压力)、夹管阀(也可其他电磁阀，旋转阀来代替)，来控制气体进入耗材管路的通断。

⑦该系统包含一组称重组件装置，耗材的每个收容袋都会固定在一个具有称重功能的装置上，称重装置能精准的测量出能每个收集袋的重量，保证进入、推出离心容器的体积的精度。

3、控制原理系统

①气泵对离心容器充气，控制器通过对第二气压传感器的压力的读取，检测离心容器是否漏气，人机界面输出下一步骤；

②气泵对离心容器抽气，控制器通过对第一气压传感器的压力的读取，检测耗材管路是否漏气，人机界面输出下一步骤；

③控制器读取耗材收容袋的重量，按需求，控制器控制旋转三通切换管路方向，气泵工作驱动离心容器活塞，往离心容器抽入一定重量的某种液体。或者从离心容器往某个收容袋推出一定重量的液体；

④控制器实时读取温控模块的温度，控制加热模块的通断。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的方法采用一种制备pbmc细胞的设备，能够减少人手操作的次数，同时降低污染，减少人为失误，本发明提供的方法优化操作流程，降低了对人员操作的要求，降低了生产成本，使得细胞分离的过程更加智能自动化，操作更加简便，提高了细胞制备的成功率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

附图说明

图1为本发明的空耗材系统示意图；

图2为本发明的细胞分离系统及系统连接示意图；

图3为本发明的系统输入输出设计及控制原理示意图；

图4为本发明的壳体结构的左侧视图；

图5为本发明的壳体结构的右侧视图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1设备组装

本实施例提供一种设备，所述设备包括进样装置、收集装置、补液装置、离心培养装置、液体传感器装置、气体交换装置和称重组件装置；

所述液体传感器装置包括第一液体传感器和第二液体传感器，其中，第一液体传感器与进样装置相连，第二液体传感器与离心培养装置相连；所述称重组件装置包括称重传感器，分别设置于所述进样装置、收集装置、离心培养装置和补液装置上；其中，进样装置、离心培养装置、气体交换装置、补液装置和收集装置依次连接；所述进样装置包括血袋连接器1、血块滤器31和第一管夹8；所述血袋连接器1、血块滤器31和第一管夹8依次连接；所述进样装置通过第一液体传感器44与第一阀门15相连；所述离心培养装置包括淋巴分离液袋5、第一液体滤器21、第二管夹11、第一阀门15、第一注射口22、第二注射口23、温控模块48、动态密封模块27、离心桶29、活塞28和第一气体滤器30；所述第一液体滤器21、淋巴分离液袋5、第二管夹11第一阀门15、第二液体传感器45、第一注射口22、第二注射口23、动态密封模块27、离心桶29和第一气体滤器30依次连接；所述离心桶29内部含有活塞28；所述离心桶29外部含有温控模块48；所述设备还包括离心驱动装置和气动装置；所述离心驱动装置包括旋转电机49和传动装置50；所述气动装置包括第一气压检测器43和气压控制装置51；所述离心驱动装置与离心培养装置相连，所述气动装置与离心培养装置相连，所述气体交换装置包括第二气压检测器42、第五阀门46和气路接头61；所述第五阀门46、第二气压检测器42和气路接头61依次连接；所述补液装置包括生理盐水连接器2-3、培养基袋4、第三管夹9、第三阀门16、第四阀门17、第四管夹10和第二液体滤器20；所述生理盐水连接器2-3通过第三管夹9与第四阀门17依次连接；所述第二液体滤器20、培养基袋4、第四管夹10与第四阀门17依次连接，所述第三阀门16和第四阀门17连接；所述收集装置包括第五管夹12、第七管夹14、收集袋6、第三注射口24、第四注射口25和取样袋26；所述取样袋26、第五管夹12、收集袋6、和第三阀门16依次连接；所述收集袋6还连接有第三注射口24和第四注射口25；所述阀门为旋转三通阀；所述设备还包括壳体结构；所述壳体结构的上侧面嵌有阀门旋转机构52-54、离心桶夹具62、第一液体传感器44、第二液体传感器45和气路接头61；所述壳体结构的左侧面靠近上侧面的位置分布有一个称重传感器，右侧面靠近上侧面的位置分布有两个称重传感器；所述壳体结构的后侧面中部竖有立杆，所述立杆顶部支撑有扁圆柱体，圆柱体侧面均匀分布有四个称重传感器；所述壳体装置还包括人机界面56，所述人机界面位于壳体结构的前侧面。

将上述设备按照图1-图5所示的连接关系和位置顺序相连，组装成分离细胞的设备。

实施例2制备细胞

采用如下步骤制备细胞：

(1)准备100ml样品、连接耗材并进行自检，所述耗材包括血液样品袋35、淋巴分离液袋5、收集袋6、生理盐水袋33-34、培养基袋4和离心桶29；

(2)采用梯度离心法在离心培养装置内进行离心，通过液体传感器装置、离心培养装置、称重组件装置和阀门装置相互配合调节液体流动，将样品中的细胞分离至收集装置；

(3)将补液装置中的生理盐水抽入离心桶29内，再排至淋巴分离液袋5中，重复多次；

详细操作步骤如下：

准备样品：

将管路中所有管夹夹住，封闭管路；将培养基和淋巴分离液分别通过滤器注入耗材指定的储液袋当中，将血液样品和生理盐水，通过耗材的连接部件分别进行相连。

连接耗材：

按照顺序，将100ml血液样品、生理盐水、淋巴分离液、收集袋挂在机器上，将三通阀按照次序与机器的三通阀旋转机构相连，将离心桶与设备相连并固定，将气体滤器与设备相连，将管路卡入第一液体传感器和第二液体传感器。

自检：

将管路中的管夹(除样品收集袋的管夹)松开，通过液体检测器1、液体检测器2对检测管路进行检测，通过气压控制装置、第一气压传感器、第二气压传感器对管路密闭性进行检测。

pbmc制备：

通过控制活塞，将血液样品缓慢抽取至第一液体感受器处，停止抽取，将淋巴分离液抽入离心桶，并开始离心，将血液样品抽入离心桶，等待一段时间(如15分钟)，液体将在离心桶内由内至外分为血浆层、pbmc细胞层、淋巴分离液、红细胞四层，通过活塞将离心桶内液体缓慢推出，在离心作用下，液体将依次由内至外推出，通过第二液体感受器对经过的液体进行检测分析，配合旋转三通阀和管路将不同液体成分收集至不同的收集袋中；将血清前半部分推向原始的血液样品袋，将血清后半部分连同pbmc细胞层、淋巴分离液的前半部分推向收集袋，将淋巴分离液后半部分和红细胞推向废液袋或血液样品袋。

冲洗管路和离心桶：

将离心桶管路与生理盐水管路相连，通过活塞将生理盐水抽入离心桶，再将生理盐水排出至淋巴分离液袋/废液袋，可重复多次以达到彻底清洗的目的。

实验检测

100ml血液样品分离的结果如下：

1、pbmc的分离：

a.大于1e8pbmc细胞每100ml全血血样，最高样品超过2.5e8pbmc细胞每100毫升全血。

b.pbmc的纯度：大于90％。

综上所述，本发明提供了一种pbmc细胞的制备方法，采用一种制备细胞的设备，所述设备利用称重传感器替代光栅，并增加了进气装置和液体传感器，本发明提供的方法优化整体设备中各装置的连用关系，简化设备操作流程，各装置各步骤相互配合，降低了生产成本，使得细胞分离的过程更加智能自动化，操作更加简便，减少污染，提高了细胞制备的效率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。