一种异源重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-LacGWLF及其应用的制作方法

本发明涉及一个来自短小芽孢杆菌的cota漆酶突变体gwlf及其基因、工程菌和制备方法，具体设计基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株，以及该细菌漆酶蛋白在染料脱色工业上的应用，属于酶的基因工程领域。

背景技术：

漆酶(laccase，e.c.1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族的一员,可分为四大类：植物漆酶、昆虫漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。它能够催化多种酚类和非酚类化合物氧化，使之生成相应的苯醌，同时伴随电子的转移，将分子氧还原成水，且反应过程中无其它副产物生成。漆酶的氧化底物极为广泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶应用潜力巨大。在木材加工领域，漆酶能代替化学胶合剂，不但能提高产品质量，而且能减轻对人体健康的伤害及对环境的污染；在造纸工业中，漆酶用于纸张生物漂白和制浆，可减少制浆造纸厂的污染，有助于造纸业最终实现清洁生产；在食品加工领域，漆酶可用于除去果汁中酚类化合物引起的混浊，从而提高果汁的质量。此外，漆酶还可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒性，减少以氯酚类为工业原料生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化工产品而造成的环境污染。对于许多应用，可以通过使用介体来提高漆酶的氧化能力。目前已知的介体包括：hbt(1-羟基苯并三唑)、abts(2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、丁香酸甲酯、nha(n-羟基乙酰苯胺)、neiaa(n-乙酰基-n-苯基羟胺)、hbto(3-羟基1,2,3-苯并三嗪-4(3h)酮)、vio(紫尿酸)。在这些漆酶中，cota漆酶最受研究者关注，其中枯草芽胞杆菌cota漆酶的研究最多，最深入。

由于真菌来源漆酶在工作环境ph偏碱性时活性非常低或几乎没有，热稳定性也较差，且丝状真菌生长周期长，培养基要求高，菌丝在发酵罐中易受到高剪切力的损伤，这大大限制了真菌漆酶在工业上的应用。研究揭示，细菌来源漆酶虽氧化活性普遍略低于真菌来源漆酶，然而它们往往具有一些自身独特的优点：如无需糖基化修饰、热稳定性好、酶活性的最适ph范围广等，这些性质正是目前漆酶工业应用所急需的。然而细菌漆酶本身的表达量较真菌漆酶要低，且在大肠杆菌中易形成包涵体，包涵体的复性比较困难，耗费物力财力。近些年，毕赤酵母异源表达被运用解决细菌漆酶胞外表达上，并取得良好效果，细菌漆酶成功的通过毕赤酵母实现外分泌表达，将有利于其在工业上的应用。

毕赤酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速。毕赤酵母系统用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。毕赤酵母表达系统在表达外源目的蛋白时具有很多优点，具有广阔的前景，适合工业化和规模化生产，该表达系统的优点主要表现在：1、表达量高：毕赤酵母表达系统的表达载体，是以醇氧化酶基因的启动子启动表达的，其外源目的蛋白的表达量很高，pichiapastoris的表达量比一般表达系统的表达量(常用表达系统的表达量一般在毫克级)高10倍甚至100倍。2、稳定性高：毕赤酵母表达系统的表达载体通过整合在酵母的染色体上而存在，并且随染色体的复制而复制，不是以质粒自我复制的形式存在，因此重组菌株的稳定性很高。3、高分泌表达：毕赤酵母表达系统的表达载体中a因子前导序列是一个具有很好的分泌效果的分泌型号序列，能够通过一定的途径是表达产物分泌到细胞外，同时减轻了宿主细胞的代谢负荷，有利于细胞的持续生长。4、目的蛋白翻译后的加工和修饰：毕赤酵母具有真核生物完整的亚细胞结构，能够进行真核生物蛋白翻译后的加工修饰过程(如糖基化、脂肽化、磷酸化以及二硫键的形成等)，从而使分泌蛋白的结构更接近于天然蛋白，而且糖基化程度合适，适于临床使用。5、遗传背景研究较清楚，能够通过基因表达调控机制实现目的蛋白的高水平表达。6、易于进行工业化生产，毕赤酵母属于单细胞微生物，具有生产成本低，营养要求简单(酵母的碳源一般为甘油。葡萄糖以及甲醇等)，发酵工艺简单，可进行高密度发酵等优点，酵母具有大规模发酵生产外源蛋白的潜力，而且酵母表达系统自我分泌的杂蛋白很少，对于目的蛋白的纯化有利。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种异源重组毕赤酵母工程菌gs115-ppic9k-lacgwlf及其应用。本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种表达来源于短小芽胞杆菌的cota漆酶突变体gwlf毕赤酵母工程菌，重组毕赤酵母阳性菌株经过甲醇诱导培养、发酵条件优化和5l发酵罐高密度发酵，可用于制备重组gwlf漆酶。

本发明的技术方案如下：

一种异源重组毕赤酵母工程菌gs115-ppic9k-lacgwlf，所述异源重组毕赤酵母工程菌携带来源于短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)cota漆酶优良突变体gwlf的目的基因；将优化的gwlf漆酶基因重组进毕赤酵母gs115基因组得到的所述工程菌。

按照毕赤酵母密码子偏好性对gwlf的基因进行优化，密码子优化的gwlf漆酶基因的核酸序列如seq.id.no.1所示。

所述优化的gwlf漆酶基因的氨基酸序列如seq.id.no.2所示。

一种含有所述目的基因的质粒或细胞。

一种所述异源重组毕赤酵母工程菌的应用，将其用于制备gwlf漆酶。

一种所述异源重组毕赤酵母工程菌制备gwlf漆酶的方法，包括如下步骤：

(1)将优化的gwlf漆酶基因连入毕赤酵母表达载体ppic9k，得到重组表达载体ppic9k-lacgwlf；

(2)将重组表达载体ppic9k-lacgwlf经saci单酶切线性化之并纯化后电转化至gs115菌株，得到异源重组酵母工程菌gs115-ppic9k-lacgwlf，并在含100μg/lzeocin的ypd平板进行阳性转化子筛选；以ypd平板上的转化子为模板，以5′aox1和3′aox1为引物进行pcr鉴定。pcr鉴定正确的转化子接种到含有0.3mmabts和0.25mmcuso4的bmmy平板上进行活性鉴定，菌落周围出现蓝绿色反应圈的转化子为重组毕赤酵母工程菌gs115-ppic9k-lacgwlf；

(3)挑取重组毕赤酵母工程菌接种到bmgy培养基，30℃，200rpm培养至od600＝2-6，于8000×g，4℃离心5min收集细胞，然后收集的细胞重悬到bmmy培养基至起始od600接近于1.0，于30℃，200rpm震荡培养，每天补加终浓度为0.5％的甲醇；发酵四天后在8000×g，4℃离心5min回收发酵液上清液；用亲和层析的方法对上清液进行纯化，sds-page分析可得明显特异条带；所述bmmy培养基中含有0.25mmcuso4，收集重组gwlf。

一种重组gwlf的应用，将其用于偶氮染料的脱色降毒。

本发明有益的技术效果在于：

本发明获得一株提供一种表达来源于短小芽胞杆菌的cota漆酶突变体gwlf毕赤酵母工程菌，且上述cota漆酶突变体和野生型cota漆酶相比，其催化效率和表达效率分别提高了4.73和4.40倍。

本发明优化毕赤酵母异源分泌表达重组gwlf的发酵条件，优化后的重组gwlf酶活提高了约4倍。克服了细菌漆酶产量低、酶活低、纯化困难等应用缺陷。

本发明参考重组gwlf在摇瓶体积所得最优发酵条件，在5l发酵罐中进行了高密度发酵，所得gwlf酶活得到大幅提高，和摇床体积相比，酶活提高了约4.17倍。

本发明显示该重组gwlf对偶氮染料尤其是伊文斯蓝具有较好的脱色降毒效果。因此，该重组gwlf在实际应用中具有较大的应用潜力。

本发明中重组cota漆酶突变体编码基因来源于本实验室前期构建的催化活性和表达效率大大提高的突变体gwlf。对gwlf编码基因进行密码子优化，在毕赤酵母表达系统中进行表达，得到毕赤酵母高稳定性cota漆酶重组菌株，优化重组毕赤酵母的发酵条件，经过高密度发酵和相应的处理，可以得到热稳定性好，表达量高，催化效率高的外分泌重组cota漆酶。本发明利用该重组cota漆酶对偶氮类染料进行脱色降毒，其中对偶氮染料伊文斯蓝的脱色效果最好，并首次提出了重组cota漆酶对伊文斯蓝的脱色降毒机理。

附图说明

图1为在含有0.3mmabts,0.25mmcuso4和0.5％甲醇的bmmy平板上初步筛选高效转化子；

a为密码子优化前的转化子，选择了14号；

b为密码子优化后的转化子，选择了1号、2号、6号和10号转化子。

图2为在毕赤酵母中分泌表达的重组gwlf的sds-page和非变形凝胶电泳，重组gwlf的分子量约为75kda(图中红色箭头指出)；

a中条带分别为：m：蛋白质分子量标准(kda)；1：空载上清；2：重组gwlf上清；3：重组gwlf纯酶。

b中条带分别为：1：空载上清；2：重组gwlf上清，其中b图是非变性性电泳图，以abts为底物染色。

图3为密码子优化以及发酵条件优化对重组gwlf表达的影响；

a：密码子优化；b：诱导温度；c：诱导时间；d：甲醇浓度；e：诱导初始ph；f：铜离子浓度；g：非抑制性碳源；h：山梨醇浓度。

图4为重组gwlf在5l发酵罐中的高密度发酵。

图5为重组gwlf对伊文斯蓝脱色降毒的生物毒性实验；

a：高地芽孢杆菌；b：恶臭假单孢菌；c：三孢布拉霉；d：黑曲霉；

a：碳酸盐缓冲液(ph10)；b：不同浓度的伊文斯蓝(从a到d分别是625,325,625和1250mg/ml)；c：经过重组gwlf处理24h后的伊文斯蓝溶液。

图6为对经重组gwlf处理的伊文斯蓝和空白对照的液质联用图谱；

a：hplc图谱：a：空白对照；b：经重组gwlf处理的伊文斯蓝；

b：总离子流图谱：a：空白对照；b：经重组gwlf处理的伊文斯蓝；

c：质谱图：a：在6.06min出现的最高峰值249.2；b和c：2.930min出现的两个最高峰值195.1和180.1；d：在0.959min出现的最高峰值164.1。

图7为基于液质联用分析结果推断重组gwlf对伊文斯蓝的脱色降毒机理。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

材料和试剂：abts、氨苄青霉素和无氨基酵母氮源等购于sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；限制性核酸内切酶、t4连接酶和巴斯德毕赤酵母gs115菌株购于中国takara宝生物公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购于中国科晴生物公司；其他试剂均为国内或者国外购买的分析纯试剂。本发明使用的短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)保藏信息为：cctccno.m2015018。

实施例1

重组毕赤酵母表达载体ppic9k的构建和gwlf基因的密码子优化

(1)以本实验室前期构建的催化活性以及表达效率大大提高的cota漆酶突变体gwlf为模板，设计引物，扩增目的基因。设计的相关正向和反向引物如下：

gwlf-f:5′-gccggaattcatgaacctagaaaaatttgt-3′

gwlf-r:5′-gccgcctaggttactggatgatatccatcg-3′

其中下划线部分分别代表ecori和avrii的酶切位点。pcr扩增体系为：质粒dna3μl，前引(10μm)1μl，后引(10μm)1μl，pcrsupermix25μl，ddh2o补至50μl，pcr扩增条件为94℃变性2min，循环30次(94℃30s，55℃30s，72℃2min)，最后72℃延伸5min。

取5μlpcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并检测到目的条带正确。使用胶回收试剂盒对扩增所得的目的基因进行纯化以去除目的基因中过量的引物、dna聚合酶和dntp。使用ecori和avrii限制性核酸内切酶同时对纯化后的目的基因和表达载体ppic9k进行双酶切，然后使用t4连接酶对具有相同粘性末端的目的基因和表达载体进行酶连。

加入25μl酶连产物于100μle.colidh5α感受态细胞内，轻弹混匀，冰浴20-30min；42℃水浴热激45s，立即至于冰上2min；加入900μl平衡至室温的lb培养基，37℃200rpm培养1h，最后将转化产物涂布于含100mgl^-1氨苄青霉素的lb平板，经37℃过夜培养，从平板上挑选10个单菌落进行菌落pcr验证，从验证成功的菌落中挑5个单菌落接种到lb液体培养基，10h后将每个单菌落保存2个甘油管，一份-80℃保藏，一份用于测序。

(2)gwlf基因的密码子优化

由中国金斯瑞生物科技有限公司按照毕赤酵母密码子偏好性对gwlf基因进行密码子优化，得到含有优化后gwlf基因的亚克隆，且该亚克隆在相应位置引入了ecori和avrii酶切位点。将含有已优化和未优化目的基因的重组表达载体同时转化进毕赤酵母以选择可以表达更高酶活的重组毕赤酵母。

实施例2重组gwlf的表达与纯化

(1)表达：将表达载体ppic9k-lacgwlf经saci单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌(pichiapastoris)gs115感受态，使用2mm的电转杯在1.8kv电压下进行电转化，并在md平板上进行阳性转化子筛选；以md平板筛选得到的转化子为模板，以3’aox(ggcaaatggcattctgacat)和5’aox(gactggttccaattgacaagc)为引物进行pcr鉴定，pcr鉴定正确的转化子为重组毕赤酵母工程菌pichiapastorisgs115/ppic9k-lacgwlf。

将重组毕赤酵母工程菌在含有0.3mmabts,0.25mmcuso4和0.5％甲醇的bmmy平板上进行初筛，每隔24h在平板盖子上滴加100μl甲醇，产漆酶的转化子将会在菌落周围出现蓝绿色显色圈(如图1所示)。挑选显色圈直径大颜色深的转化子转入25mlbmgy摇瓶培养基进行复筛，30℃，200rpm培养至od600＝2.0-6.0，将发酵液于4℃8000rpm离心10min去除上清，收集菌体；取适量菌体重悬于含有0.25mmcuso4和0.5％甲醇的的bmmy摇瓶培养基至od600≈0.6，30℃，200rpm，每隔24h补加0.5％(w/v,终浓度)甲醇，培养96h后取粗酶液测量漆酶酶活，确定一株高效转化子。在筛选高效转化子的过程中尽量保持实验操作一致。

(2)纯化：由于重组表达的cota漆酶带有多聚组氨酸标签(his6·tag)，因此使用镍离子亲和层析法分离目标蛋白。镍离子亲和层析纯化蛋白的步骤：(a)平衡：用10倍住体积的20mm缓冲液(含5mm的咪唑)平衡histraphp镍离子柱(1ml)；(b)上样：预先处理好的样品以1mlmin^-1的流速上样；(c)洗脱：用高浓度咪唑进行梯度洗脱，收集洗脱条件下峰型对应的管号，并做酶活检测，收集单峰对应的有酶活的蛋白，跑sds-page蛋白电泳确认单一条带，获得纯化的酶(如图2所示)。

实施例3重组gwlf的酶活测定

(1)酶活单位定义：采用abts方法测定漆酶酶活时，定义每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量为一个活力单位。酶活测定步骤：

(1)预热：取2.4mlph3.5的柠檬酸缓冲液于试管中，在试管中加入0.5mlabts溶液(abts终浓度为0.5mm)置于50℃水浴锅中预热5min；2反应：加入稀释好的0.1ml样品酶液，震荡均匀。3测量：用分光光度计对震荡均匀的样品进行动力学测量，在420nm波长下测量30s内每分钟od值的变化量(测量反应显示直线)并计算酶活力。

酶活力公式：酶活力

比活力

式中：△od-反应时间内吸光度值的差v总-反应体系的体积(l)

n-酶液稀释倍数△t-反应时间(min)

vo-酶液的体积(l)m酶-酶蛋白的质量(mg)

ε–底物摩尔消光系数，ε420＝3.6×10⁴l·mol^-1·cm^-1

实施例4

摇瓶发酵产重组gwlf的发酵条件优化

通过优化诱导温度、时间、ph、cuso4浓度、甲醇浓度和添加非抑制性碳源的单因素试验确定产重组gwlf的最适发酵条件。每一个单因素的最佳值通过测定该条件下的漆酶酶活来确定。在起始诱导ph为6.0，甲醇浓度为0.5％以及cuso4浓度为0.25mm时，同时优化诱导温度和时间；当最适诱导温度和时间确定后，再依次测定在不同诱导ph、甲醇浓度和cuso4浓度下的酶活。最终得到摇瓶发酵产重组gwlf的最适发酵条件(如图3所示)。

实施例5

产重组gwlf的毕赤酵母工程菌在5l发酵罐中的高密度发酵

(1)发酵种子液培养

在装有5mlypd培养基的试管中接入从ypd平板上挑取的单菌落，30℃，200rpm培养24h；在装有50mlypd培养基的500ml三角瓶中接入500μl试管培养基中的菌液，30℃，200rpm培养至od600＝2.0-6.0。

(2)分批补料高密度发酵培养

将三角瓶中的菌液按10％的接种量接入3lbsm发酵培养基中。

参考摇瓶中的最优发酵条件设置发酵罐参数控制条件为：

(1)温度：甘油培养阶段为30℃，甲醇诱导阶段为26℃；

(2)ph值：甘油培养阶段为ph6.0，甲醇诱导阶段为ph7.0

(3)转速：最低搅拌转速为200r/min，上限设置为600r/min；

(4)溶氧：根据不同阶段溶氧需求调节通气量的大小，控制溶氧在30％；

(5)甘油浓度：甘油培养阶段，控制甘油浓度＜15ml/l；

(6)甲醇浓度：甲醇诱导初期浓度为4ml/h/l，待溶氧稳定后浓度提高至8ml/h/l，2h后提高至12ml/h/l直到发酵终止。

甘油培养阶段：在前22h里，在含有4％甘油的bsm培养基中进行培养；然后以4.0ml·h^-1·l^-1的流速流加含有12ml/lptm1的50％甘油6h，在甘油培养阶段结束后细胞湿重达到210g/l。在饥饿40min后，进入甲醇诱导阶段：先以4.0ml·h^-1·l^-1的流速流加含有12ml/lptm1的的0.5％甲醇；当od值达到20％—30％之后，将流速提高至8.0ml·h^-1·l^-1；2h后将流速提高至12.0ml·h^-1·l^-1并维持此流速直至发酵停止。高密度发酵过程如图4所示。

实施例6

重组gwlf对偶氮染料伊文斯蓝的脱色降毒试验

(1)重组gwlf在碱性条件下对3种偶氮染料的脱色率测定

采用常规测定方法：反应体系为5ml，染料(伊文斯蓝70mg/l、活性艳橙k-7r50mg/l、活性黑kn-b30mg/l)，纯化后的漆酶10μg，介体为abts，介体浓度0.5mm，反应温度为37℃，ph10，缓冲液为碳酸缓冲液。实验结果显示在碱性环境ph10下，重组gwlf对三种偶氮染料的脱色率分别达到80.35％、71.44％和64.72％。以上数据表明重组gwlf在碱性环境下对偶氮类染料具有很好的脱色效果，具有较大应用潜力。

(2)重组gwlf作用于伊文斯蓝前后的生物毒性试验

首先用碳酸缓冲液(ph10)配置不同浓度梯度的伊文斯蓝溶液(6.25、31.25、62.5、156.25、625、和1,250mg/ml)作用于真菌和细菌。对于细菌而言，12h后能够产生直径为1cm抑菌圈的浓度为伊文斯蓝作用于细菌的最适浓度；对于真菌而言，24h后能够在距离菌落0.5cm处产生月牙形抑菌区的浓度为伊文斯蓝作用于真菌的最适浓度。

获得伊文斯蓝作用于细菌和真菌的最适浓度之后，如图5所示，图中a、b、c和d分别为高地芽孢杆菌、恶臭假单孢菌、三孢布拉霉和黑曲霉的菌落平板，平板中的滤纸片“a”均为10μl的碳酸缓冲液(ph10)，滤纸片“b”为10μl不同浓度的伊文斯蓝碳酸盐溶液(即作用于四种微生物的最适伊文斯蓝浓度625、156.25、625和1250mg/ml)，滤纸片“c”为10μl以上不同浓度的伊文斯蓝碳酸盐溶液经过纯化后的重组gwlf作用24h的脱色产物。图中结果表明，经过重组gwlf脱色降毒后的伊文斯蓝对微生物的毒性大大降低，几乎对微生物的生长没有影响。

实施例7

重组gwlf对伊文斯蓝脱色降毒机制的研究

通过液相色谱—质谱(lc-ms)分析重组gwlf对伊文思蓝的脱色和解毒机制。将含有0.1m碳酸盐缓冲液(ph10.0)，伊文斯蓝，重组gwlf(4,092u/l)和abts(0.3mm)的混合物作为检测样品；分别将没有添加重组gwlf的混合物和添加灭活的重组gwlf的混合物作为对照样品。

通过利用masslynxv4.1软件分析检测结果，lc-ms图谱以及推断结果如图6、7所示。结果表明，重组gwlf能够作用于伊文斯蓝的偶氮建，生成氢气而不是有毒的苯胺类物质，在此过程中，水是唯一的副产物，所以本发明中的重组gwlf在降解工业染料废水中具有较大的应用潜力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种异源重组毕赤酵母工程菌gs115-ppic9k-lacgwlf

<130>2018.10.26

<160>2

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工合成(synotype)

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