EBER原位杂交检测用探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测技术，特别涉及一种eber原位杂交检测用探针及试剂盒。
背景技术：
：eb病毒(epstein-barrvirus，ebv)属疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科成员，90％以上的健康成人携带该病毒。eb病毒不仅会引起人类感染性疾病，如传染性单核细胞增多症、慢性活动性eb病毒感染等，而且在某些情况下，潜伏感染的eb病毒会导致恶性肿瘤的发生，最常见的有b细胞来源的伯基特淋巴瘤(burkitt’slymphoma)和霍奇金淋巴瘤(hodgkinlymphoma)，以及上皮细胞来源的鼻咽癌和胃癌等。ebv为双链dna病毒，基因组大小约为170kb，ebv编码6种核抗原(ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b、ebna3c、ebnalp)和3种潜伏性膜蛋白(lmp1、lmp2a、lmp2b)。其中lmp1为具有促细胞癌变和转移作用的致瘤蛋白，在ebv介导的b淋巴细胞增殖和永生化中起非常重要作用。除了可转录一系列蛋白编码基因，还可以编码一些小rna分子。而ebv编码的小rna主要有为ebv编码的小rna-1(ebvencodedsmallrna1，eber-1)和ebv编码的小rna-2(ebvencodedsmallrna2，eber-2)，在每个细胞中的拷贝数为106～107，为ebv潜伏感染的标志物。eber分子内部存在比较稳定的二级结构，因此，不像细胞内其他rna分子容易降解。ebv的检测以免疫组化、eber原位杂交以及pcr方法较为常见。pcr法最为灵敏，检出率略高，但易受各种不确定因素影响，操作条件和成本要求更高。免疫组化法检测的是ebv基因产物-lmp1，为蛋白水平，lmp1为ebv潜伏感染时由bnlf1基因编码的跨膜蛋白之一，主要定位于细胞质或胞膜。eber原位杂交检测的是ebv编码的rnaeber，在ebv感染的细胞核中以高拷贝存在，主要反映dna的转录情况，可在病毒潜伏期和复制期均进行转录，主要定位于细胞核上。对于细胞内低拷贝数rna的ebv感染，eber原位杂交检测的阳性率高于免疫组化，且eber原位杂交阳性定位清晰，能确定病毒与组织和细胞的关系，易于观察，目前仍是检测ebv的金标准。现有的eber原位杂交检测试剂盒中，其采用的eber探针主要为rna探针和dna探针。rna探针通过体外转录法来合成，转录的过程会进行地高辛或生物素的标记，该方法操作繁琐，且rna探针不稳定，易降解；dna探针可通过化学合成dna短链，然后用地高辛寡核苷酸加尾试剂对探针的3’端标记地高辛，该标记方法局限于一条探针只标记一个地高辛。因而，上述eber探针的局限性制约了试剂盒检测的信号强度和灵敏度。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：提供一种eber原位杂交检测用探针，可增强试剂盒检测的信号强度和灵敏度，并基于此，提供一种包含上述eber原位杂交检测用探针的eber原位杂交检测试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种eber原位杂交检测用探针，包括检测eber-1的原位杂交探针，其核苷酸序列如seqidno.1所示。一种eber原位杂交检测试剂盒，包括eber杂交液，所述eber杂交液包括上述的eber原位杂交检测用探针。本发明的有益效果在于：设计上述核苷酸序列如seqidno.1所示的检测eber-1的原位杂交探针，该序列中，根据探针序列长度在25～35nt、gc％在60％左右、并结合eber-1rna的二级结构，设计了如下eber-1探针，用于检测eb病毒中的eber-1；并且上述序列设计在化学合成的过程中可实现将地高辛分别标记于探针的5’和3’端，具有增强试剂盒检测的信号强度和灵敏度的优点，同时该标记方法的探针标记地高辛效率高、均一性更高、性价比高且易于推广。附图说明图1为本发明实施例的eber原位杂交检测试剂盒用于检测一病理切片后于光学显微镜放大100倍下观察到的实验结果图；图2为本发明实施例的eber原位杂交检测试剂盒用于检测另一病理切片后于光学显微镜放大100倍下观察到的实验结果图。具体实施方式为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本发明最关键的构思在于：根据探针序列长度在25～35nt、gc％在60％左右、并结合eber-1rna的二级结构，设计上述eber原位杂交检测用探针的具体核苷酸序列。请参照图1以及图2，一种eber原位杂交检测用探针，包括检测eber-1的原位杂交探针，其核苷酸序列如seqidno.1所示。一种eber原位杂交检测试剂盒，包括eber杂交液，所述eber杂交液包括上述的eber原位杂交检测用探针。从上述描述可知，本发明的有益效果在于：设计上述核苷酸序列如seqidno.1所示的检测eber-1的原位杂交探针，该序列中，根据探针序列长度在25～35nt、gc％在60％左右、并结合eber-1rna的二级结构，设计了如下eber-1探针，用于检测eb病毒中的eber-1；并且上述序列设计在化学合成的过程中可实现将地高辛分别标记于探针的5’和3’端，具有增强试剂盒检测的信号强度和灵敏度的优点，同时该标记方法的探针标记地高辛效率高、均一性好、性价比高且易于推广。本发明的实施例一为：本实施例的eber原位杂交检测试剂盒包括：(1)eber杂交液；(2)蛋白酶k(3)鼠抗地高辛抗体；(4)hrp标记羊抗鼠igg聚合物；(5)过氧化氢；(6)3,3’-二氨联苯胺。其中，eber杂交液按下述步骤配制：a、合成下表1中所示核苷酸序列的检测eber-1的原位杂交探针；表1编号探针序列(5’—3’)1gaccgaagacggcagaaagcagagtctggg且，eber-1序列如下：aggacctacgctgccctagaggttttgctagggaggagacgtgtgtggctgtagccacccgtcccgggtacaagtcccgggtggtgaggacggtgtctgtggttgtcttcccagactctgctttctgccgtcttcggtcaagtaccagctggtggtccgcatgttttb、将合成的eber探针用1xte(10mmtris-hclph8.0，1mmedta)溶解,根据所需进行分装，冻存于-20℃。c、配制空白杂交液：50％(v/v)去离子甲酰胺，20mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)，1xdenhardts，10％(w/v)硫酸葡聚糖，3xssc；并用0.22μm的滤头过滤除菌。d、在空白杂交液中加入终浓度为1～2ng/μl的eber探针以及100μg/ml鲑鱼精dna，配成eber杂交液。本实施例的eber原位杂交检测试剂盒用于检测eb的具体实验操作方法为：一、切片预处理1、将组织片切片于67℃烘烤固定1～2h。二、脱蜡及水化1、二甲苯依次脱蜡3x10min。2、梯度酒精水化，100％酒精1x3min，95％酒精1x3min，75％酒精1x3min，蒸馏水1x3min。三、杂交预处理甩干切片,将组织周围液体用滤纸吸干,每张切片滴加适量蛋白酶k(100μg/ml)消化15-20min。蒸馏水洗涤2x3min，小心擦干组织周围液体。四、杂交1、移取20μl杂交液滴加于组织片上，加盖玻片；2、将组织切片移入水湿盒中于37℃培养箱中孵育过夜；3、将玻片浸入pbs缓冲液内10分钟，盖玻片自然滑落，pbs缓冲液冲洗3x3min；五、杂交后显色1、小心擦去载玻片上细胞周围的液体，滴加1滴(约50μl)鼠抗地高辛抗体并涂抹均匀，后置于加湿盒中于37℃孵育30min；2、将载玻片放入37℃预热的pbs溶液低速振摇3x2min；3、在吸水纸上轻磕载玻片，使多余液体脱离，后向细胞区域滴加1滴(约50μl)酶标羊抗鼠igg聚合物并涂抹均匀，后置于加湿盒中于室温(约25℃)孵育20min；4、将载玻片放入pbs溶液(室温)低速振摇3x2min；5、dab显色5-10min；6、将载玻片放入pbs溶液(室温)低速振摇3x2min，蒸馏水低速振摇3min；7、苏木素复染；8、酒精梯度脱水，中性树胶封片。请参见图1-2，图1-2为利用本发明的eber原位杂交检测试剂盒采用上述具体实验操作方法对两个病理切片进行eb检测的实验结果图，图中应用光学显微镜放大100倍进行观察，由图可见，图中阳性信号为棕褐色，主要位于细胞核中，并且背景干净。综上所述，本发明提供的eber原位杂交检测试剂盒具有检测信号强度和灵敏度高的优点。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12