一种烟草KUP6蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种来自烟草的钾转运蛋白kup6及其编码基因与应用。

背景技术：

钾转运体是能在外界钾离子浓度极低时将钾离子转运至细胞内的载体蛋白。钾转运体通常是一些跨膜蛋白，通过构象变化完成钾离子的跨膜转运，是一种需要atp提供能量的主动运输过程，通常是k⁺/h⁺或k⁺/na⁺协同运输。

现有技术对于钾转运体基因的研究在模式植物拟南芥中比较广泛，例如，研究表明拟南芥突变体kup6较野生型植株在干旱胁迫下的存活率降低，而35s::kup6过表达转基因植株的耐旱能力却得到了明显的增强(shabalaetal.,2007)；而kup7基因的突变体幼苗在低钾胁迫下表现出叶片黄化的低钾敏感表型，其根部的钾离子含量显著下降，kup7基因功能的缺失使拟南芥幼苗在低钾条件下对钾的吸收能力降低、木质部汁液中钾离子浓度降低(minetal.,2016)。

烟草是一种耗钾量很大的作物，烟叶钾含量是衡量烟叶品质的的重要指标，目前，对于烟草中钾转运体基因的研究较少，烟草kup的功能未知。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种烟草kup6蛋白及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种钾转运蛋白，获自烟草，命名为kup6蛋白，是如下(a)或(b)

(a)其氨基酸序列如seqidno.1所示；

(b)seqidno.1所示序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与(a)同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

本发明提供了编码所述烟草kup6蛋白的基因，所述基因为如下1)或2)或3)的dna分子：

1)编码区如seqidno.2所示的dna分子；

2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码与植物钾离子吸收和转运调控相关蛋白的dna分子；

3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码与植物钾离子吸收和转运调控相关蛋白的dna分子。

经研究发现，所述kup6基因在促进钾离子吸收和转运方面发挥明显作用。

进一步地，本发明所述kup6基因由以下步骤制备得到：

设计pcr扩增引物，所述pcr扩增引物包括正向引物和反向引物：正向引物的核苷酸序列为：5’-atggcgagctcagatagtga-3’，所述的反向引物的核苷酸序列为5’-ctatagttcataagtcatgc-3’；(2)提取烟草细胞总rna，合成烟草细胞cdna，以烟草细胞cdna为模板进行kup6基因的pcr扩增，得到目的片段，测序。

优选的，所述的pcr扩增的体系为20μl体系，包括premixextaq10μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，烟草细胞cdna1μl，ddh2o8μl。

优选的，所述的pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35个循环。

优选的，所述的目的片段在测序之前还包括，将所述目的片段导入大肠杆菌dh5α感受态细胞中进行菌落pcr验证，验证为阳性克隆后进行测序。

优选的，所述菌落pcr验证使用的正向引物核苷酸序列为：正向引物的核苷酸序列为：5’-atggcgagctcagatagtga-3’，菌落pcr验证使用的反向引物的核苷酸序列为5’-ctatagttcataagtcatgc-3’。

优选的，所述菌落pcr验证的体系为10μl，包括premixextaq5μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，ddh2o4μl。

本发明提供了含有上述编码烟草kup6蛋白的基因的生物材料，所述生物材料为重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体进行构建。所述重组表达载体例如可以是双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用kup6基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用kup6基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

携带有所述kup6基因的重组表达载体可通过ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

本发明提供了上述烟草kup6蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在促进植物或微生物钾离子吸收和转运中的应用。

所述植物包括烟草、拟南芥。

所述微生物包括酵母。

例如，在本发明的具体实施方式中，将所述kup6基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株r5421后，表达所述kup6基因的重组酵母重新具有了钾离子吸收和转运的功能；将烟草植株中所述kup6基因进行超量表达后，可显著提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量。

所述应用可选为，将前述烟草kup6基因转入到烟草植株中，使kup6基因超量表达以提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量。

本发明提供了上述烟草kup6蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。

本发明提供了上述烟草kup6蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在植物育种中的应用。

所述育种的目的为促进或调节植物钾离子吸收和转运。

所述植物为烟草。

本发明的有益效果在于：本发明首次提供了分离自烟草的kup6基因，所述kup6基因核苷酸序列如seqidno.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。经功能验证，本发明提供的kup6基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株r5421(该突变株记载于maathuisfjmandsandersd1996mechanismsofpotassiumabsorptionbyhigherplantroots.physiol.plant.96,158–168.)后，表达所述kup6基因的重组酵母重新具有了钾离子吸收和转运的功能。说明本发明提供的kup6基因具有促进钾离子吸收和转运的功能。

附图说明

图1a为本发明实施例2中酵母功能互补实验结果，钾离子浓度为20um的培养基上的生长情况，图1b为钾离子浓度为2mm的培养基上的生长情况；图中，1为阴性对照(转入空载体)，2为转入kup6基因的重组酵母，3为阳性对照转入拟南芥kup基因的酵母；从左到右依次为原液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液在培养基上的生长结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1kup6基因的获得

取0.5g烟草新鲜叶片，采用trizol法提取烟草细胞的总rna，然后采用takara公司的cdna合成试剂盒合成cdna，进一步采用primer5.0软件设计并经过人工优化得到引物，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列为：5’-atggcgagctcagatagtga-3’，反向引物的核苷酸序列为5’-ctatagttcataagtcatgc-3’；。以合成的cdna为模板，进行pcr扩增。

pcr扩增体系为20μl体系，包括：premixextaq10μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，烟草细胞cdna1μl，ddh2o8μl。

pcr扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环。

pcr扩增完成后，使用dna纯化试剂盒进行目的片段的纯化，将纯化后的目的片段与pmd19-t载体16℃连接12h得到连接产物，将所述得到的连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞得到转化后的大肠杆菌dh5α，将所述的转化后的大肠杆菌dh5α接种于涂有氨苄青霉素的lb平板上进行筛选培养得到阳性克隆。在得到阳性克隆后，采用菌落pcr的方法来验证阳性克隆，所述菌落pcr的正向引物的核苷酸序列为：5’-atggcgagctcagatagtga-3’，反向引物的核苷酸序列为5’-ctatagttcataagtcatgc-3’；所述菌落pcr的体系为10μl，包括premixextaq5μl，10μm的正向引物0.5μl，10μm的反向引物0.5μl，ddh2o4μl。然后从已验证的阳性克隆中随机选取3个独立的阳性克隆送到生物技术公司进行测序，本发明在测序后得到所述的kup6基因的序列，如seqidno.2所示，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

实施例2kup6基因在促进钾离子吸收和转运方面的作用

将连接有实施例1中所述的kup6基因的t-载体与表达载体p416(p416酵母游离型穿梭表达载体,tef组成型启动子,cyc1终止子,cen6arsh4复制起点,酵母中筛选标记为ura3,大肠杆菌中筛选标记为amp。摘自functionalexpressionofaω-3fattyaciddesaturasegenefromglycinemaxinsaccharomycescerevisiae)分别进行双酶切(酶切位点为：smaⅰ和xhoⅰ)，回收目的基因和表达载体p416，然后用连接酶连接，将连接后的重组酵母表达载体转入大肠杆菌dh5α的感受态细胞，对转化后的大肠杆菌单菌落进行pcr扩增、酶切来验证是否构建成功，将构建成功的重组酵母表达载体转入到r5421中。

具体步骤如下：用接菌环取保存的r5421酵母菌划线于固体培养基ypda上，28℃培养12h；挑取r5421酵母单菌落于ep管中，加1mlypda培养液涡旋；将上述菌液全部转入装有ypda培养液的三角瓶中，于30℃，250rpm摇菌至od600＝1.2；按1:10转接，摇至od600＝1.0～1.2；于28℃，1000rpm离心5min集菌，用1/2体积的灭菌超纯水重悬；于28℃，1000rpm离心5min集菌，吸干上清；依次加入下列成分(每5ml原始菌液)：

涡旋1min，使转化体系完全混匀；放于30℃的水浴中温育30min；再放入42℃的水浴中热击28min，冰上冷却10min；7000rpm离心15s，弃上清；用1ml的无菌水轻轻重悬沉淀；取200μl转化混合物铺于营养缺陷型平板上；30℃培养3天。提取酵母质粒并鉴定结果。

挑取鉴定过的酵母单菌落在营养缺陷平板上划线，30℃培养3天；用牙签在营养缺陷平板上蘸取少量菌体于2ml营养缺陷液中培养12h；8000rpm离心1min收集菌体；弃上清，用1ml双蒸水悬浮菌体，8000rpm离心1min；

弃上清，用1ml双蒸水重悬浮，调od600为0.8；将未稀释菌液及分别稀释10倍、100倍后的菌液，分别取5ul在钾离子浓度为20um，2mm的培养基上，30℃培养3天观察结果。

实验结果如图1a和图1b所示，在钾离子浓度为20um、2mm培养基(ap培养基(1l)：磷酸546μl，l-精氨酸1.742g，1000×维生素溶液1ml，1000×微量元素溶液1ml，尿嘧啶0.77g，100×ura10ml，葡萄糖20g，琼脂粉15g)上，阴性对照组酵母菌(转入p416空载体)几乎不生长，转入烟草kup6基因的重组酵母和阳性对照组(转入拟南芥kup基因)的重组酵母菌均可以生长。随着稀释倍数的增加，转入烟草kup6基因的重组酵母和阳性对照组的重组酵母菌仍然可以生长。

上述结果证明，本发明所述的kup6基因具有钾吸收和转运功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>贵州省烟草科学研究院

<120>一种烟草kup6蛋白及其编码基因与应用

<130>khp171117857.8

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>805

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metalaserseraspsergluarghisthrgluglualaalagluasn

151015

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<211>2418

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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