一种与二花脸猪产活仔数相关的SNP标记引物及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与二花脸猪产活仔性状相关的snp标记引物及其应用。

背景技术：

在猪的商业化品系选育中，繁殖性状如产仔数、乳头数等在母系猪的选育中尤为重要。产仔数作为母猪重要的生产性状之一，反映了母猪繁殖力水平、猪场生产水平和经济效应。随着社会经济的发展，人们生活水平普遍提高，对猪肉的需求量也日益增多。根据国家统计局和猪e网等数据，2017年我国生猪存栏量为43325万头，出栏量为68861万头。我国生猪存栏量、出栏量以及产肉量约占世界一半。产仔数的高低直接关系到每头母猪提供育肥猪的数量和猪肉供给量。作为养猪大国，如何提高猪的产仔数尤为必要。然而，传统选育方法基于表型选择，没有准确的遗传信息，选育过程缓慢且效果甚微。近年来，由于分子生物学技术的飞速发展，各种基因标记的发现，利用分子标记辅助育种技术对产仔数进行选育，可以极大提高选择的准确率和生产速度。因此，解析产仔数变异的遗传机理，开发和利用新的基因或分子选育标记来提高猪的产仔性能具有重要意义。

二花脸猪是我国太湖流域的优质猪种,以产仔数高而闻名于世界，是我国养猪业可持续发展的重要资源；虽然国内已有大量的研究机构利用二花脸来鉴别该猪种高繁殖力的遗传机理，但限于研究方法、手段、材料及繁殖性状本身复杂性等众多因素的制约，二花脸猪种高繁殖力遗传机制并没有得到充分的揭示和有效的利用。因此，通过开发和利用分子选育标记来提高二花脸猪的产仔性能意义重大。

随着梅山猪出口到国外，国外的许多机构对梅山猪高繁殖力优势基因进行了系统科学的研究和有效利用，从而提高了瘦肉型猪种的繁殖力，近几年来从法国和丹麦引进的猪种繁殖力普遍很高，中国地方猪高产优势逐渐被削弱，这对我国养猪业来说是一个巨大冲击。鉴别和分离高产优势基因，培育性能相对稳定的高产群体、巩固太湖流域这些地方猪种的高产优势已刻不容缓。

从国际猪qtl数据库网站(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/qtldb/ss/index)可知，目前在猪除10、11号染色体及性染色体上没有定位到影响总产仔数的qtl，其它常染色体上都已定位到影响总产仔数的qtl，但大部分是利用微卫星标记定位的qtl，置信区间多在10-20cm，无法确定真正的主效基因及其关键变异位点，因此难以直接应用于种猪选育改良，因此找到影响产仔数的分子标记位点才是提高产仔数的关键。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术不足，产仔数的低遗传力，提供与二花脸猪产活仔相关的snp标记。

本发明的另一个目的在于提供用于检测上述snp标记的引物和检测方法。

本发明的另一个目的在于提供上述snp标记的用途。

一种与二花脸猪产活仔数性状相关的snp标记，所述snp标记位于猪13号染色体上的钙同线蛋白基因clstn2的核苷酸序列上，所述snp标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪13号染色体上g.80866737核苷酸位点，且存在c/t多态性，所述snp标记与二花脸猪产活仔数显著相关。g.80866737位点具有cc基因型的二花脸个体的产活仔数显著高于具有tt基因型的二花脸个体母猪产活仔数。

一种基于本发明所述的snp开发分子标记的方法，以含有所述的snp标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以二花脸猪基因组dna为模板进行pcr扩增，使所述的snp标记转化为分子标记。

其中，所述的引物对序列优选为上游引物：seqidno：2，下游引物：seqidno：3；所述的分子标记序列进一步优选如seqidno：1所示，所述的snp位点位于第301位，存在c/t多态性。

一种检测所述的snp标记的方法，包含pcr扩增二花脸母猪基因组中含有所述的snp标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的c/t多态性。

本发明所述的检测snp标记的方法，优选包括以下步骤：

(1)取每头二花脸母猪的耳组织样品并提取总dna；

(2)用已提取的二花脸母猪基因组dna为模板，使用本发明所述的引物对进行pcr扩增；

(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seqidno：1第301位的c/t多态性。

步骤(2)所述的pcr扩增进一步优选反应体系为：dna模板1μl、seqidno：2和seqidno：3所示的引物各1μl、pcrmix试剂22μl；其中所述dna模板浓度为30ng/μl，所述引物的浓度为10mol/l，所述pcrmix试剂为南京擎科生物技术有限公司的1.1×t3superpcrmix试剂；pcr扩增的反应程序为：预变性98℃2min；变性98℃10s；退火60℃10s，延伸72℃10s，35个循环；延伸72℃2min。

本发明所述的snp标记、所述的分子标记、引物对在筛选高产二花脸猪品系中的应用。

一种筛选高产二花脸猪品系的方法，包括检测国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上g.80866737核苷酸位点的基因型，在二花脸猪群体中，选育g.80866737核苷酸位点的cc型个体作为种猪。

有益效果：

本发明提供的snp标记与二花脸母猪的产仔性能相关，因此，可以通过鉴定该snp标记来筛选高产的二花脸猪品系，所得的二花脸猪高产品系具有重要的经济效益与社会价值。本发明提供的该snp标记的引物，能够快速的检测该标记，能够在筛选高产二花脸猪品系中应用。

附图说明

图1为染色体上影响猪产活仔数的gwas定位结果示意图。即为207头纯种二花脸母猪群体的gwas定位结果。其中，猪的18条常染色体及x染色体信息标识于x轴，snp与产活仔数相关性的-log10(p)值按snp在基因组中的位置显示y轴。虚线表示的是染色体显著水平阈值，实线表示的是基因组显著水平的阈值。

图2为13号染色体精细定位得到的位点。

图3为使用本发明的引物扩增clstn2基因的电泳图。

图4为clstn2基因的突变位点不同基因型的dna测序结果峰图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

1、实验动物来源

江苏常州焦溪二花脸猪专业合作社。

计算177头二花脸母猪的育种值，计算模型为

y(窝产总仔数)＝parity(胎次)+farm(场)+year(年度)+season(季节)+age(母猪分娩年龄)+sire(与配公猪)+permanenteffect(母猪的永久效应)+additiveeffect(个体的加性效应)，

其中包括固定效应-胎次、母猪分娩的场/年/季，协变量-母猪分娩的年龄，随机效应-与配公猪，永久效应-母猪，个体加性遗传值。选择育种值较高的25个个体与育种值较低的25个个体。

2、提取基因组dna

采集48头母猪的耳组织样品，放置于装有75％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。

使用传统酚/氯仿法提取耳组织基因组dna，所需试剂包括：

裂解液(实验室配备)

蛋白酶k(德国merck生物科技有限公司)

tris饱和酚(北京索莱宝生物科技有限公司)

tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(北京索莱宝生物科技有限公司)

氯仿(江苏永华精细化学品有限公司)

无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)

3m乙酸钠(北京索莱宝生物科技有限公司)

具体步骤如下所述：

(1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2ml离心管中；

(2)加入裂解液(自己配备)800μl，及蛋白酶k30μl(20mg/ml)；

(3)样品置于55℃恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；

(4)加入tris饱和酚800μl，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；

(5)取650μl上清加tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μl，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；

(6)取550μl上清，加氯仿800μl，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；以下步骤换1.5ml的离心管

(7)取450μl上清，加无水乙醇800μl，3m乙酸钠40μl，混摇6min，4℃1000r/min离心8min；

(8)弃上清留下dna沉淀团，加入1000μl70％乙醇，混摇5min，4℃1000r/min离心5min，弃上清(如需要可重复一次)；

(9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；

(10)样品加100μl超纯水，轻微吹打至dna溶解，经过nanodrop-2000分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到30ng/μl于-20℃下保存备用。

3、猪全基因组6万个(60k)snp基因型检测

上述个体的dna在illuminabeadstation平台上根据公司标准流程进行猪全基因组60ksnp(illumina，美国)基因型判定。利用plink对所有样本60k芯片数据进行质量控制，剔除检出率低于0.95、家系孟德尔错误率高于0.05的个体；最小等位基因频率小于0.05的snp标记。

4、全基因组关联(gwas)分析

使用gemma软件对分型个体的60ksnp标记型数据和产活仔数表型数据进行gwas分析，采用bonferroni校正法控制多重检验，将基因组显著性阈值确定为0.05标记数。gwas的结果显示，猪13号染色体上存在1个与产活仔数显著相关的snp位点(图1)。

实施例2

本实施例为在实施例1中得到的gwas候选位点附近上下游500kb范围内对二花脸猪筛选snp(snp/16kb)，得到精细定位位点。

1、提取二花脸母猪基因组dna

采集具有准确产活仔记录的纯种二花脸母猪的耳组织样品266头分别放置于装有75％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。利用上述方法提取耳组织基因组dna，经过质量、浓度检测后将浓度稀释到30ng/μl于-20℃下保存备用。

2、目标区域精细定位

上述的个体的dna送去上海天昊生物科技有限公司进行精细定位，得到包括g.80866737位点的许多snp，然后利用sas软件对这些snp进行基因型对表型的影响效应分析。分析模型为yijklm＝u+hfsi+agej+pak+pl+gm+eijklm

其中：hfsi为第i个厂年季固定效应；agej是母猪分娩年龄作为协变量；pak为胎次k的固定效应；pl代表母猪的永久环境效应；gm代表第m个snp的基因型固定效应；不同胎次的产仔数记录作为重复数据处理；eijklm为残差。

显著性的p值经过10000次的随机抽样校正。

表1给出了g.80866737c/t突变位点在纯种二花脸群体中对产活仔数的影响效应。由表1可知，纯种二花脸猪中，g.80866737c/t位点的cc基因型个体与tt型个体、ct型个体相比较：经产活仔数平均分别增加0.84头和0.67头。由此可见，在二花脸猪种中，继代选育g.80866737c/t位点的cc型均可逐步提高二花脸母猪的产活仔数，达到提高二花脸母猪繁殖性能的目的。

表1g.80866737c/tsnp位点与二花脸猪经产产活仔数的关联分析

注：表格中以平均值±标准误(mean±s.e.)表示

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种与二花脸猪产活仔数相关的snp标记引物及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>683

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cacttggtacagcctgaaggaggtcacaggagacagaaggtcaggagaggcagactgcag60

gagcaggaagtgaggccacagtacaccgaccactgcaaagacctaggtcgtagctcctgg120

gacagctggacagctcctagcttctcccctaaagaagcatgggacactcatggagcaaac180

tcaaggacttgggaaagaagaaagaccatcaccccacagaatcatgcccccaacattatg240

tgccctgtgctgaacatcagctatttacatgtagtcattctccactggaacacaagctcc300

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cagccagaatctttcctccaccactagacaaggttactggttcttctgctgaaaaccaga660

gaaagtggttacctggctcacag683

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cacttggtacagcctgaagga21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctgtgagccaggtaaccactt21