一种检测RNASET2基因启动子甲基化的引物及其检测方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，特别是指一种检测rnaset2基因启动子甲基化的引物及其检测方法。

背景技术：

自20世纪70年代美国提出攻克癌症计划起，至今已40余年，全球花费大量人力、物力致力于肿瘤的研究。现在对肿瘤发生、发展的机制已有了初步了解，但还未真正认清癌变的本质。随着分子生物学技术的飞速发展，研究人员已经认识到，癌基因及抑癌基因的异常变化在人类恶性肿瘤的发生、发展中起着重要作用，尤其是抑癌基因功能的丧失，越来越受到人们的重视。抑癌基因具有抑制细胞生长增殖的作用，正常情况下，它们对细胞的生长、发育和分化起着重要的调节作用。这些基因由于甲基化、突变等各种原因导致基因失活或其产物失去活性时，可导致细胞的癌变和肿瘤的发生。

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁到女性的健康与生命。宫颈癌的发病是一个多基因、多步骤的结果，其中抑癌基因功能的丧失和癌基因的表达是其细胞癌变的分子基础。dna甲基化是肿瘤发生的早期事件，因此通过检测基因的甲基化异常来进行肿瘤的早期诊断具有重要的临床意义。近年来的研究表明，dna甲基化与宫颈癌的发生、发展密切相关，可以作为有效的分子标志物应用于宫颈癌筛查。抑癌基因甲基化在宫颈癌中普遍存在，宫颈癌抑癌基因甲基化的研究将为宫颈癌的早期诊断、治疗及预后提供新的思路和方法。发现更多、更好的宫颈癌相关基因，寻找具有高度特异性和敏感性的甲基化标志物，并将其运用至临床实践，仍是一大难题和挑战。

抑癌基因rnaset2定位于6q27，系ii类肿瘤抑制基因。其编码的rnaset2蛋白属于核糖核酸酶rh/t2/s家族，是一种具有催化活性的分泌型糖蛋白，可调控基因表达和细胞分化，改变肿瘤微环境，抑制肿瘤的进展。既往研究表明在卵巢癌细胞系，恶性黑色素瘤、前列腺癌等恶性肿瘤中rnaset2转录水平下调，提示rnaset2可能在肿瘤的发生发展中起重要作用。但目前尚无该基因与宫颈癌的相关研究。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种检测rnaset2基因启动子甲基化的引物及其检测方法，用于克服上述现有技术中的全部或者部分不足。

基于上述目的，本发明提供一种检测rnaset2基因启动子甲基化的引物，该引物包括与发生甲基化的模板匹配的甲基化上游引物mf和甲基化下游引物mr，与未发生甲基化的模板匹配的非甲基化上游引物uf和非甲基化下游引物ur。

可选的，所述甲基化上游引物mf:5′-tttacgggtggtttaggttagttc-3′，甲基化下游引物mr:5′-tatcaaacgactatattccttcgc-3′，其中，下划线标注的是和发生了甲基化的dna相匹配的位点。

可选的，所述非甲基化上游引物uf:5′-ttttatgggtggtttaggttagttt-3′，非甲基化下游引物ur：5′-atcaaacaactatattccttcacc-3′，其中，下划线标注的是和未发生甲基化dna相匹配的位点。

可选的，所述引物中甲基化上游引物和下游引物的浓度比为1：1。

可选的，所述引物中非甲基化上游引物和下游引物的浓度比为1：1。

可选的，所述引物的pcr扩增产物长度为107bp。

一种检测rnaset2基因启动子甲基化的方法，包括如下步骤：

1)提取dna样品；

2)dna的修饰；

3)修饰dna甲基化特异性pcr。

可选的，所述dna的修饰是采用ezdna甲基化试剂盒-gold对dna进行亚硫酸氢盐修饰和纯化。

可选的，所述dna甲基化特异性pcr的pcr扩增条件：94℃预变性2min；94℃变性40s，63℃退火40s，-0.5℃循环，72℃延伸45s，10个循环；95℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min。

从上面所述可以看出，本发明提供一种检测抑癌基因rnaset2启动子cpg岛甲基化的引物及检测方法，一方面通过成对的甲基化引物和非甲基化对目标dna检测，提高检测灵敏度，具有特异性好，另一方面采用的检测方面简单易操作，实现了检测rnaset2启动子甲基化的准确检测。

附图说明

图1为本发明实施例rnaset2基因msp电泳结果示意图。

mk-marker，m-甲基化u-非甲基化，mb-sssⅰ处理过的正常宫颈组织，b-无甲基化的健康对照外周血，1、2、3-患者标本，4-对照标本，blank-空白对照。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，结合图，对本发明进一步详细说明。

在本发明实施例中，一方面，提供的一种检测rnaset2基因启动子甲基化的引物，该引物包括与发生甲基化的模板匹配的甲基化上游引物mf和甲基化下游引物mr，与未发生甲基化的模板匹配的非甲基化上游引物uf和非甲基化下游引物ur。

在一些可选实施例中，本发明提供的一种检测rnaset2基因启动子甲基化的引物，包括与发生甲基化的模板匹配的甲基化上游引物mf：5′-tttacgggtggtttaggttagttc-3′，甲基化下游引物mr:5′-tatcaaacgactatattccttcgc-3′，其中，下划线标注的是和发生了甲基化的dna相匹配的位点，pcr扩增产物长度为107bp，pcr扩增是甲基化上游引物mf和下游引物mr的浓度比为1：1；引物还包括与未发生甲基化的模板匹配的非甲基化上游引物uf:5′-ttttatgggtggtttaggttagttt-3′，非甲基化下游引物ur：5′-atcaaacaactatattccttcacc-3′，其中，下划线标注的是和未发生甲基化dna相匹配的位点，pcr扩增产物长度为107bp，pcr扩增是非甲基化上游引物uf和下游引物ur的浓度比为1：1。

另一方面，本发明实施例中还提供一种检测rnaset2基因启动子甲基化的方法，包括如下步骤：

1)提取dna样品；

2)dna的修饰；

3)修饰dna甲基化特异性pcr。

在一些可选实施例中，本发明实施例中还提供一种检测rnaset2基因启动子甲基化的方法，具体步骤如下：

1)提取dna样品包括采用血液、提取细胞组织、细胞组织基因组dna提取试剂盒(货号：dp304)提取dna。

采用的基因组dna提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，其包括缓冲液ga(bufferga)、缓冲液gb(buffergb)、缓冲液gd(buffergd)、漂洗液pw(bufferpw)、洗脱缓冲液te(bufferte)、proteinasek、吸附柱cb3、收集管。

取宫颈癌组织或正常宫颈组织0.2～0.5g，用生理盐水漂洗，滤纸擦干，称重，放入研钵中，用眼科小剪刀尽快将组织剪碎，加入1ml生理盐水研磨，将研磨的组织匀浆倒入玻璃匀浆器中，用0.5ml生理盐水冲洗研钵，一起倒入匀浆器中；上下转动研磨数10次，使组织匀浆化，将匀浆后的组织转入离心管中，10000rpm离心1min，除去上清液，向沉淀物中加入200μl缓冲液ga，震荡至彻底悬浮；然后依次向其中加入20μl蛋白酶k，混匀，56℃放置至组织溶解，加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，加入200μl无水乙醇，颠倒混匀，然后依次进行如下操作，将上述溶液加入吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入600μl漂洗液pw(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复操作上述最后一次离心操作后，将吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min，弃废液，室温放置几分钟。将吸附柱放入干净离心管中，向吸附柱中加入洗脱液100μlte，室温放置5min，12000rpm离心2min，得到dna提取液。

2)dna的修饰；采用ezdna甲基化试剂盒-gold(货号：d5005)对dna进行亚硫酸氢盐修饰和纯化。甲基化处理试剂从北京天漠科技开发有限公司购买得到，其包括ctconversionreagent、m-bindingbuffer、m-washbuffer、m-desulphonationbuffer、m-elutionbuffer、zymo-spiniccolumn和collectiontube。

ctconversionreagent的制备：将900μl灭菌双蒸水，50μlm-dissolvingbuffer和300μlm-dilutionbuffer到一管ctconversionreagent，室温下震荡10min，4℃过夜，用前震荡2min。在pcr管中加入130μl的ctconversionreagent，20μldna样品，混匀。将pcr管放入pcr仪中，按以下步骤操作：98℃10min；64℃150min，然后加入600μlm-bindingbuffer到吸附柱中，并将吸附柱放入试剂盒提供的collectiontube中。将pcr管中的样品加入到含有m-bindingbuffer的吸附柱中，盖上盖子，颠倒混匀数次，10000rpm离心30s，弃废液；加入200μlm-washbuffer到吸附柱中，10000rpm离心30s，弃废液；加入200μlm-desulphonationbuffer到吸附柱中，室温放置20min，10000rpm离心30s，弃废液；加入200μlm-washbuffer到吸附柱中，10000rpm离心30s，弃废液；再加入200μlm-washbuffer到吸附柱中，10000rpm离心30s，弃废液；加入10μlm-elutionbuffer到柱基质中，将吸附柱放置于新的1.5ml的ep管中，静置2min，10000rpm离心1min，得到修饰的dna。

3)修饰dna甲基化特异性pcr：pcr试剂盒采用promega公司的hotstartgreenmastermix(货号m5122)，包括热启动酶、反应缓冲液(ph8.5)、400umdatp、400umdatp、400umdatp、400umdatp和4mmmgcl2。

甲基化特异性pcr(methylation-specificpcr，msp)，msp反应体系：15-50μl，优选的15μl，含hotstartgreenmastermix7.5-25μl，优选的7.5μl，ezdna甲基化试剂盒-gold修饰后的dna模板dna2-4μl，优选的2μl，上、下游引物各1-2μl，优选的1μl，灭菌双蒸水补足至15-50μl，优选的15μl。采用touch-down的pcr反应程序：94℃预变性2min；94℃变性40s，63℃退火40s，-0.5℃/循环，72℃延伸45s，10个循环；95℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

以正常人外周血淋巴细胞dna，经甲基化酶sssⅰ处理过的宫颈癌组织dna和水，分别作为非甲基化、甲基化和空白对照进行凝胶分析，取5μlmsp反应产物，2.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果见图1。扩增的dna序列和引物对应的序列如下所示：

凝胶分析如下：若仅u引物能扩增出条带，且条带位置正确(107bp)，判断为甲基化阴性；若仅m引物出现目的条带(107bp)，判断为完全甲基化；若m和u引物均出现目的条带，则判断为部分甲基化；完全甲基化和部分甲基化均为甲基化阳性。检测结果显示，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，实现了检测rnaset2启动子甲基化的准确检测。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。