本发明涉及多肽物质及其在药品制备中的用途，尤其涉及一种能够有效且选择性地阻断nav1.7(电压门控钠通道α亚基家族)的多肽毒素及其用途。
背景技术：
电压门控钠离子通道(vgscs)分布十分广泛，无论是脊椎动物还是无脊椎动物的各种组织中，这些通道都有表达。vgscs在动作电位的产生和爆发以及神经信号传导中发挥着重要作用。许多疾病与电压门控钠离子通道密切相关，比如疼痛，癫痫等。
vgscs是兴奋性细胞膜上的一种高分子量，多次跨膜的糖蛋白。2003年，国际药理联合会公布了vgscs的命名规则。英文缩写(nav)表示电压敏感钠离子通道，其中na代表钠离子通道，v则表示电压敏感通道。目前发现的九种钠离子通道被分别命名为navl.l-nav1.9，“1”用于表示1型亚家族，而“1”后面的数字则代表具体亚型。九种钠通道亚型的氨基酸序列差异性分析显示navl.l到nav1.9的九种亚型在自然进化中过程中非常保守，同一物种的钠通道亚型之间序列均相似度在75％以上，这意味着钠通道中的趋异序列则在很大程度上决定了不同亚型之间的动力学以及生理功能的差异。根据vgscs对河豚毒素(ttx)是否敏感，九种钠通道亚型又可以被分为河豚毒素敏感型和河豚毒素不敏感型。前者包括navl.l、nav1.2、nav1.3、nav1.4、navl.6、nav1.7；后者主要有nav1.5、nav1.8、nav1.9。
vgscs在人体组织体内分布广泛。在中枢神经系统、心脏、骨骼肌等组织中均发现了它们的表达，除nav1.4和nav1.5外，所有的钠通亚型在人背根神经节(drg)细胞上都有表达；nav1.1、nav1.3、nav1.6在心脏组织的横管里也有分布。同时它们又表现出一定的组织特异性，如电压门控钠离子通道nav1.5主要分布在心肌细胞的细胞膜上，而nav1.4仅仅分布在骨骼肌细胞上，nav1.6在肺泡平滑肌细胞上。
nav1.7主要在外周交感神经元和感觉神经元中表达。nav1.7积聚在神经纤维末端，使小规模阈下去极化放大，并作为调节兴奋性的阈值通道。nav1.7功能与各种疼痛状态有关，包括急性、炎性和/或神经性疼痛。在人体内，已发现nav1.7的功能获得性突变与原发性红斑肢痛症(该疾病的特征在于肢体灼痛和炎症)和阵发性剧痛症相关。与此观察一致的是，非选择性钠通道阻滞剂利多卡因、美西律和卡马西平可缓解这些疼痛疾病的症状。在人体内，nav1.7的功能丧失性突变导致罕见的常染色体隐性疾病先天性无痛症，其特征在于完全缺失对疼痛刺激的感知或对疼痛刺激不敏感。
目前已发现了多种与电压敏感钠通道相互作用的多肽毒素。通过选择性的作用于钠通道的某些区域，多肽毒素或延缓通道失活，或加快通道激活，或阻断钠电流却不改变通道动力学特征。电压门控钠离子通道上已经有6个区域被证实在通道和毒素的相互作用中扮演重要角色。sandrinecestele等将这些区域进行了命名，依次为位点1～位点6，并将作用于某一位点毒素称做该位点毒素。这些位点主要分布在细胞膜外侧，跨膜片段以及孔道内侧。例如，位点1由两个环状结构组成，位于钠通道孔道区。作用于该区域的毒素主要有河豚毒素、芋螺毒素以及甲藻毒素。位点2位是由α亚基中的di-s6和div-s6两个跨膜段构成，蛙皮毒素、乌头碱等作用于该区域。δ-actx、sphtx2,δ-atracotoxins等多肽毒素作用于位点3，该区域位于钠通道α亚基div上的s3～s4胞外连接环，多肽毒素与通道相互做用时可以阻止div-s4电压敏感元件的运动和改变通道激活和失活的偶联，从而抑制通道电流，其作用方式的特点是：多肽毒素在结合到位点3后会延缓通道失活，但不影响通道激活。δ-atracotoxins是典型的钠通道位点3多肽毒素，它能抑制钠电流并延缓钠通道的失活。sphtx2作为疑似位点3毒素，该毒素既延缓钠通道失活，又可以使得通道稳态激活和稳态失活往去极化方向漂移。δ–atracotoxins与传统的位点3毒素α-蝎毒相比，它们与通道的相互作用机制各有异同。这两种毒素都能延缓通道失活，毒素上的lys3、arg5和asp13在与钠通道相互作用中起关键作用，钠通道上与毒素相互作用的关键残基都是glu1613、glu1616和lys1617，但是α-蝎毒会增加钠通道电流，而δ–atracotoxins则减小钠电流。毒素结合位点4主要是α亚基dii上的s1-s2之间以及s3-s4之间的两个胞外环连接，hwtx-iv、jztx-iii等多肽毒素作用于位点4，其偏好性地抑制nav1.7钠电流，通过捕获处于静息状态时钠通道的domainii电压敏感元件抑制钠电流。与传统的位点4毒素β-蝎毒相比，它们与钠通道的相互作用机制存在较大差异。hwtx-iv不影响nav1.7激活，jztx-iii使通道的激活电压向去极化方向漂移，而β-蝎毒却使通道的激活电压向超极化漂移。另外，前者是捕获处于静息状态的电压敏感元件，而后者是捕获处于开放状态的电压敏感元件。
目前所使用的钠通道阻滞剂，例如，卡马西平、利多卡因以及上述多肽毒素，存在非选择性作用于钠通道的多个业型，易引起中枢系统、循环系统副作用(如眩晕、共济失调、失眠、恶心和头痛等)的缺陷，或存在有效性低、安全性低的缺陷，因而限制了它们的临床应用和广泛使用。
技术实现要素：
如上所述，由于各钠通道的药物结合点非常保守，即使是毗邻序列也极为相似，目前还没有公认的nav1.7特异性阻断剂。本发明的目的之一在于提供ccotx1毒素，尤其是提供一种对nav1.7具有高度选择性和高效作用性的多肽毒素。
本发明的具体技术方案如下：
ccotx1毒素，所述多肽毒素包含以下序列：
x1clgx2fx3x4cx5px6ndkccx7x8x9x10csx11x12x13x14wckx15x16l(seqidno:2)，其中：
x1为d,i或z；
x5为a,i或m；
x7为k或a；
x8为s；
x10为d；
x12为e或k；
x18为y或k；
x19为r或n；
x20为l或y；
x21为v或t；
x24为k或r；
x25为s或r；
x26为h或d；
x27为n或r；
x31为w或y；
x32为k或d。
作为对上述技术方案的进一步改进，末端氨基酸l被氨基化。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述多肽毒素包含seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8或seqidno:9。
本发明的又一目的在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含上述多肽毒素。
本发明的又一目的在于提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述多肽毒素。
本发明的又一目的在于提供一种载体，所述载体包含编码上述多肽毒素的多核苷酸。
本发明的又一目的在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述载体。
本发明的又一目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物上述多肽毒素和药学上可接受的赋形剂。
本发明的又一目的在于提供上述多肽毒素在制备用于治疗nav1.7相关的疾病的药物中的用途。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述nav1.7相关的疾病是疼痛。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中疼痛是慢性疼痛、急性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、内脏疼痛、背部疼痛、术后疼痛、热疼痛、幻肢痛、或与炎性病症相关联的疼痛、原发性红斑肢痛症(pe)、阵发性剧痛症(pepd)、骨关节炎、类风湿性关节炎、腰椎间盘切除、胰腺炎、纤维肌痛、痛性糖尿病神经病变(pdn)、疱疹后神经病变(phn)、三叉神经痛(tn)、脊髓损伤或多发性硬化症。
现有的源于天然毒素的鈉离子阻断剂不具有选择性，在阻断nav1.7而镇痛的同时会阻断nav1.4，1.5，1.6等钠离子通道，会干扰呼吸和心跳，严重时会导致呼吸中断，心跳停顿等致命后果，所以不能用作镇痛药物。本发明的多肽毒素是nav1.7的有效专一抑制剂，与现有的毒素相比，本发明的多肽毒素能够增强选择性，可以只选择性的抑制nav1.7而不会抑制其它钠离子通道，从而避免上述副作用，因而可用作镇痛药物。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。虽然本文描述了示例性的组合物和方法，但类似或等同于本文所述的组合物和方法的任何组合物和方法都可用于本发明的实践或测试。
本文所使用的术语“多肽”是指由两个或多个氨基酸通过共价键结合而构成的化合物，所述共价键是通过从一个氨基酸的氨基基团和下一个氨基酸的羧基中消除h2o分子而形成的。
术语“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其它等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链dna和单链dna以及双链rna和单链rna是多核苷酸的典型示例。本发明的多核苷酸还可以包含至少一个非编码序列，诸如转录但不翻译的序列、终止信号、核糖体结合位点、mrna稳定序列、内含子和聚腺苷酸化信号。多核苷酸序列还可以包含编码另外的氨基酸的另外的序列。这些另外的多核苷酸序列可以(例如)编码标记或熟知的标签序列，诸如六聚组氨酸或ha标签，这些标签有利于融合多肽的纯化。
术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的非天然多核苷酸。载体多核苷酸通常包含编码目标蛋白质的cdna以及另外的元件，诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的示例可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分重构的生物系统。包含载体的多核苷酸可为dna或rna分子或这些分子的杂合分子。
术语“宿主细胞”是指已引入载体的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的主体细胞，还指这种细胞的子代。因为由于突变或者由于环境影响，在后代中可发生某些修饰，因此这种子代可与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。
“药物组合物”包含本发明的多肽毒素和药学上可接受的赋形剂。合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有在非肠道给药的组合物中常见的其它材料。另外的示例性媒介物是中性缓冲盐水或混合有血清白蛋白的盐水。这些溶液是无菌的，并且基本上不含颗粒物，并且可通过常规熟知的杀菌技术(例如，过滤)进行杀菌。组合物可包含接近生理条件所需的药学上可接受的赋形剂，诸如ph调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和染色剂等。根据所选的具体施用模式，此类药物组合物中的本发明的多肽毒素浓度可广泛的变化，例如约0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1.0重量％、1.1重量％、1.2重量％、1.3重量％、1.4重量％、1.5重量％、1.6重量％、1.7重量％、1.8重量％、1.9重量％、2重量％，或在2重量％至5重量％之间，至多达15重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％或70重量％，并且主要基于流体体积、粘度和其它因素进行选择。
在整个本申请中，各实施方式的描述使用“包括”的语言；然而，本领域技术人员将理解到，在某些具体实例中，可以可替换地使用语言“基本由……组成”或“由……组成”来描述实施方式。
本文所描述的多肽毒素可用于治疗疼痛或诱导镇痛。如本文所使用的，术语“治疗”也包括预防具有发展这样的疼痛倾向的患者或受试者的疼痛，以及当疼痛被确定时改善或消除已发展的疼痛或减轻这样的疼痛的特有症状。
本文所述的疼痛可以为任何已知类型的疼痛，包括外周性疼痛。例如，待治疗的疼痛可以为一种或多种疼痛，其被描述为神经源性疼痛、神经性疼痛、癌症疼痛、术后疼痛、口腔或牙齿疼痛、来自所提及的三叉神经痛的疼痛、来自疱疹后神经痛的疼痛、或由于反射交感性营养不良引起的疼痛和/或与炎性病症相关的疼痛。
疼痛可以表征为例如，伤害性疼痛、非伤害性疼痛、躯体痛、内脏痛、神经痛。疼痛可以是刺激应答热、冷、振动、拉伸以及由受损细胞所释放的化学刺激物的受体的结果。此外，疼痛可以是由神经细胞功能障碍所产生的疼痛的结果。根据本发明的主题，疼痛可以是与组织如皮肤、肌肉、关节、骨骼和韧带相关的疼痛-通常称为肌肉-骨骼痛。疼痛也可以是与主体腔的内脏器官相关的疼痛。在这方面，疼痛可以与胸部(心脏和肺)，腹部(肝、肾、脾和肠)，和/或盆腔(膀胱、子宫和卵巢)相关。此外，根据本发明主题所描述的疼痛可以为与神经系统自身相关的疼痛，例如与挟捏神经或压迫神经有关的疼痛。疼痛可源于外周神经系统，即组织和脊髓之间的神经，或源于中枢神经系统，即脊髓和大脑之间的神经。疼痛可与例如由多发性硬化、中风、脑出血和/或缺氧、神经压力、压迫神经、神经炎症、椎间盘破损或滑脱和/或神经感染如带状疱疹或其它病毒感染引起的神经退变相关。
炎性病症可以与一种或多种病症相关，所述病症选自由急性疼痛，偏头痛，头痛，周期性偏头痛，外伤性神经损伤，神经压迫，神经卡压，疱疹后神经痛，三叉神经痛，糖尿病性神经病变，慢性下腰痛，幻肢痛，慢性盆腔疼痛，神经瘤疼痛，复杂区域疼痛综合症，慢性关节炎疼痛，以及与癌症、化疗、hiv和hiv治疗诱导的神经病变、肠易激综合症和有关疾病和克罗恩病相关的疼痛组成的组。
如本文所使用是，术语疾病、障碍或病症的“治疗”或“处理”包括减轻其至少一种症状，降低其严重程度，或延缓，防止或抑制其进展。治疗不需要指疾病、障碍或病症完全治愈。为了有效治疗，本文所述的有用组合物仅需要降低疾病、障碍或病症的严重程度，降低与其相关的症状的严重程度，提高患者或受试者的生活质量，或延缓，防止或抑制疾病、障碍或病症的发作。
如本文所使用的其它术语通过本领域的熟知的含义来定义。
合成多肽毒素
可以通过化学合成制备或可以使用重组dna技术生产本文所描述的多肽毒素。为了通过化学合成来制备本发明的多肽毒素，可以使用公开的已知方法，例如可通过使用叠氮化物、酰基氯、酸酐、复合酸酐、dcc、活化酯、伍德沃德试剂k、羰基咪唑、去氧化、dcc/honb、bop试剂的方法来获得本发明的多肽毒素。此外，可使用自动肽合成仪(例如peappliedbiosystemsco.)通过化学合成来制备本文所描述的肽。诸如在bulajg.等人(2006)biochemistry45，7404中描述的方法也可用于合成本文所描述的肽和再折叠程序中。
此外，在反应完成后，可通过已公开的已知纯化方法对本文所描述的多肽毒素进行纯化和分离。例如，可通过溶剂提取、蒸馏、柱色谱、液相色谱、重结晶等的组合对本发明的多肽毒素进行纯化和分离。当通过上述方法获得的本文所述的多肽毒素为游离形式时，可使用公开的已知方法将其转换为盐形式，并且另一方面，当获得的多肽毒素为盐形式时，可使用公开的已知方法将其转换为游离形式。
实施例1
本实施例gptx-1多肽毒素的氨基酸序列如下表1所示。
表1
备注：seqidno:5～seqidno:8末端的l氨基酸进行了氨基化，即，加上了氨基。实验方法
1、药物样本
细胞内液：145mmkcl,5mmnacl,2mmcacl2,2mmmgcl2,4mm乙二醇四乙酸(ethyleneglycoltetra-aceticacid),10mmhepes；kohph7.3；渗透压:300mosmol；细胞外液：140mmnacl,4mmkcl,1mmmgcl2,1.8mmcacl2,10mm水合葡萄糖(d-glucosemonohydrate,)10mmhepes；hclph7.4；
玻璃电极：wpi：1b150-3；
细胞：hek293细胞(商业化购买)，表达nav电流。
2、主要仪器
电极拉制仪(美国sutter；p97)；
膜片钳系统(德国heka；epc-10)；
渗透压分析仪(美国wescor；)；
微量进样针(美国hamilton；)；
ph测定仪(意大利米克仪器有限公司)。
3、实验步骤
3.1细胞培养
细胞的复苏
(1)室温平衡培养基，取出包被过基质(matrix)的培养皿/瓶，吸去包被液并加入适量培养基，置于5％co2的37℃恒温细胞培养箱中；
(2)37℃解冻细胞，快速摇晃使细胞融化至仅剩一小块冰晶(避免冻存管盖接触水面)，迅速取出并用75％酒精消毒冻存管外表面；
(3)用1ml移液器小心的将细胞悬液转移至一个新的15ml离心管，避免剧烈吹吸；
(4)用1ml培养基清洗冻存管，以收集剩余细胞，然后逐滴加入含有细胞悬液的15ml离心管，由于最初滴加的稀释比例较大，应维持在5秒1滴(50μl)的较慢速率，1分钟左右滴加完此1ml培养基，滴加过程中不断轻摇混匀；
(5)以每秒1滴的速率，逐滴加入4ml培养基，滴加过程中不断轻摇混匀；
(6)200g离心5min；
(7)用培养基重悬细胞，轻柔吹打混匀，并接种到准备好的培养皿/瓶中，水平十字摇匀；
(8)5％co2的37℃恒温培养箱中培养48h，更换培养基。
维持培养
(1)室温平衡培养基；
(2)获得的细胞用培养基培养，每48h换液一次；或者加入标准量150％的维持培养基，每72h换液一次。
3.2膜片钳检测电流
(1)提前配制细胞外液和细胞內液：
(2)使用灌流系统向孵育槽里灌流细胞外液，流速为5ml/min，并调整孵育槽内温度为35-36℃。
(3)全细胞记录：将培养好的细胞从培养箱取出，弃去培养液，加入细胞外液，放置在正置显微镜下，选取光滑细胞进行记录；
(4)拉制玻璃电极，使用相应的程序拉制电极入夜后的电阻为3-5mω；
(5)通过微操作仪使记录电极正压入水，持续调整微操，使记录电极接触细胞表面，此时由于电极电阻的突然增加，膜测试窗口显示的封接测试脉冲所代表的电流值下降，撤掉正压，并施以10～30cmh2o负压，观察封接电阻迅速上升，直至达到吉欧封接。
(6)进行电极电容补偿，抵消由于记录电极产生的瞬时电容电流后，继续增大负压至破膜，形成全细胞记录。
(7)观察到来自整个细胞膜的电容电流，进行膜电容补偿和串联电阻补偿，抵消所造成的电压降，尽量使观察的电流线平滑
(8)药物配制成2000x的母液于-20℃储存备用，取50ml的电极外液按照对应的终浓度配制成工作药液。系统稳定的记录5min后灌流工作药液5min，接着使用正常细胞外液将chamber中的药液洗脱记录5min。
(9)计算抑制百分比和ic50数值。
实验结果如下表2所示。
表2
备注：n.d.表示超出监测极限值，没有数据
序列表
<110>青海芬陀利华生物科技有限公司
<120>ccotx1毒素及其应用
<130>
<160>9
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>33
<212>prt
<213>人工序列
<400>1
aspcysleuglytrpphelyssercysaspprolysasnasplys
151015
cyscyslysasntyrthrcysserargargaspargtrpcyslys
202530
tyraspleu
<210>2
<211>33
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>肽
<220>
<221>其他特征
<222>（1）…（1）
<223>xaa1独立选自asp,ile和glx
<220>
<221>其他特征
<222>（5）…（5）
<223>xaa5独立选自ala,ile和met
<220>
<221>其他特征
<222>（7）…（7）
<223>xaa7独立选自lys和ala
<220>
<221>其他特征
<222>（8）…（8）
<223>xaa8独立选自ser
<220>
<221>其他特征
<222>（10）…（10）
<223>xaa10独立选自asp
<220>
<221>其他特征
<222>（12）…（12）
<223>xaa12独立选自glu和lys
<220>
<221>其他特征
<222>（18）…（18）
<223>xaa18独立选自tyr和lys
<220>
<221>其他特征
<222>（19）…（19）
<223>xaa19独立选自arg和asn
<220>
<221>其他特征
<222>（20）…（20）
<223>xaa20独立选自leu和tyr
<220>
<221>其他特征
<222>（21）…（21）
<223>xaa21独立选自val和thr
<220>
<221>其他特征
<222>（24）…（24）
<223>xaa24独立选自lys和arg
<220>
<221>其他特征
<222>（25）…（25）
<223>xaa25独立选自ser和arg
<220>
<221>其他特征
<222>（26）…（26）
<223>xaa26独立选自his和asp
<220>
<221>其他特征
<222>（27）…（27）
<223>xaa27独立选自asn和arg
<220>
<221>其他特征
<222>（31）…（31）
<223>xaa31独立选自trp和tyr
<220>
<221>其他特征
<222>（32）…（32）
<223>xaa32独立选自lys和asp
<400>2
xaacysleuglyxaaphexaaxaacysxaaproxaaasnasplys
151015
cyscysxaaxaaxaaxaacysserxaaxaaxaaxaatrpcyslys
202530
xaaxaaleu
<210>3
<211>33
<212>prt
<213>人工序列
<400>3
aspcysleuglymetphelyssercysaspprogluasnasplys
151015
cyscyslysargleuvalcysserargserhisargtrpcyslys
202530
trplysleu
<210>4
<211>33
<212>prt
<213>人工序列
<400>4
ilecysleuglymetphelyssercysaspprogluasnasplys
151015
cyscyslysargleuvalcysserargserhisargtrpcyslys
202530
trplysleu
<210>5
<211>33
<212>prt
<213>人工序列
<400>5
ilecysleuglymetphelyssercysaspprogluasnasplys
151015
cyscyslysargleuvalcysserargserhisargtrpcyslys
202530
trplysleu
<210>6
<211>33
<212>prt
<213>人工序列
<400>6
glxcysleuglyilephelyssercysaspprogluasnasplys
151015
cyscyslysargleuvalcysserargserhisargtrpcyslys
202530
trplysleu
<210>7
<211>33
<212>prt
<213>人工序列
<400>7
glxcysleuglyilephelyssercysaspprogluasnasplys
151015
cyscystyrargleuvalcysserlysserhisargtrpcyslys
202530
trplysleu
<210>8
<211>33
<212>prt
<213>人工序列
<400>8
glxcysleuglyilephelyssercysaspprogluasnasplys
151015
cyscyslysargleuvalcysserargserhisasntrpcyslys
202530
trplysleu
<210>9
<211>33
<212>prt
<213>人工序列
<400>
aspcysleuglyalaphealasercysaspprogluasnasplys
151015
cyscyslysargleuvalcysserargserhisargtrpcyslys
202530
trplysleu