一种添加油茶粕蛋白酶解液提高茶薪菇液体发酵菌丝体产量的方法与流程

本发明涉及一种添加油茶粕蛋白酶解液提高茶薪菇液体发酵菌丝体产量的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术：

茶薪菇属层菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田头菇属，又名茶树菇，茶薪菇味道鲜美，盖嫩柄脆，香气浓郁，富含蛋白质、氨基酸、维生素等，且有清热、平肝、明目之药用功效，可以利尿、健脾、防癌、抗衰老、降血压，是一种实用性与药用性相结合的绿色产品并具有较高开发价值。

伴随着人们生活质量的提高，仅依靠人工栽培获得子实体已满足不了人们对食用菌日益增长的需求，且人工栽培有易染杂菌或遭病虫害、周期长的缺点，而通过深层培养可以大量生产菌丝体，短期内可以从菌丝体和发酵醪液中提取抗肿瘤多糖、有机酸、核酸、抗生素、香味物质和具生物活性的代谢产物等。研究表明茶薪菇通过深层发酵获得的菌丝体中有效成分含量丰富，其蛋白质含量可达到20%，茶树菇菌丝体中8种必须氨基酸含量丰富，其含量最高的氨基酸为谷氨酸，其谷氨酸含量达2.9%，总氨基酸含量可以达到17.5%，茶薪菇深层发酵的周期短、产量高、成本低、工艺设备简单，其生产效率是传统栽培法无法比拟的，因此开展食用菌的深层发酵研究，以菌丝体替代子实体在食品、医药、保健品等方面的应用已成为一个新的发展方向。找到一种有效提高茶薪菇液体发酵菌丝体产量的方法变得尤为重要。

油茶饼粕是油茶籽榨油之后的得到的副产品，其数量相当于茶油的3倍之多，年平均产量约为39.71万吨。通过对油茶饼粕的成分分析，脱去残油，去除茶皂素后的油茶饼粕含有大量可被利用的蛋白质。因为蛋白质分子量大和和复杂的长链多聚体结构，利用蛋白酶酶解油茶饼粕，转化成易吸收和利用的小分子物质，应用于茶薪菇液体发酵菌丝体，提高茶薪菇菌丝体产量，开辟了油茶饼粕合理利用的新途径。

现有技术缺陷：茶薪菇液体发酵生产，仍存在发酵周期长、产率低、成本高的问题，关于茶薪菇菌种液体发酵技术有待优化。油茶饼粕未能充分有效地开发利用，造成了资源浪费和环境污染。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种添加油茶粕蛋白酶解液提高茶薪菇液体发酵菌丝体产量的方法，以解决现有技术中存在的问题。

本发明的技术方案是：一种添加油茶粕蛋白酶解液提高茶薪菇液体发酵菌丝体产量的方法，（1）茶薪菇菌种的活化：将菌种接种于pda固体斜面培养基，于26-28℃恒温培养箱培养7-9d,将培养好的菌种再次移接，重复上述操作2次即可；（2）一级种子液的制备：将步骤1中活化好的菌种接入液体发酵培养基中，26-28℃恒温培养箱中静置12-24h，然后在恒温振荡器上培养7-9d；（3）油茶饼粕蛋白酶解液的制备：取油茶饼粕于多功能粉碎机中粉碎并过筛，脱脂，烘干备用；脱脂油茶饼粕于乙醇中超声浸提，烘干备用，脱脂脱皂的油茶饼粕加入蒸馏水中调ph至10.0超声，加入碱性蛋白酶、50℃恒温恒ph酶解4h，灭酶,再次调节ph至7.0，添加中性蛋白酶，40℃恒温恒ph酶解2h，灭酶,离心留取上层蛋白酶解液，备用；（4）配制添加油茶蛋白酶解液的茶薪菇深层发酵的液体培养基：葡萄糖2-3%（m/v）、蛋白胨0.6-0.8%(m/v)、磷酸二氢钾0.14-0.18%(m/v)、七水合硫酸镁0.07-0.09%(m/v)，维生素b10.007-0.009%(m/v)、油茶粕蛋白酶解液10-30%（v/v）、70-90%蒸馏水（v/v)；（5）茶薪菇深层发酵菌丝体：将配制好的液体培养基灭菌,冷却至室温于超净工作台内接种10%的一级种子液，在温度24-26℃，转速120-160r/min的基础培养条件在恒温振荡器上培养6-8d，培养结束后取其发酵液离心，发酵上清液可留存备用，将菌丝体烘干即可。

所述的液体发酵培养基：葡萄糖4%（m/v）、蛋白胨1%(m/v)、磷酸二氢钾0.2%(m/v)、七水合硫酸镁0.1%(m/v)，维生素b10.01%(m/v)。

所述的pda斜面固体培养基：马铃薯20%(m/v)、葡萄糖2%(m/v)、琼脂2%(m/v)、磷酸二氢钾0.2%(m/v)、七水合硫酸镁0.1%(m/v)、维生素b10.01%(m/v)。

本发明有益效果：设备投资少，在减少成本的基础上缩短了发酵时间，提高了茶薪菇液体发酵菌丝体产量，为提取茶薪菇相关生物活性物质，提供了原料基础，为油茶饼粕的再利用开辟了新途径。

附图说明

图1为（对照组）不添加油茶饼粕蛋白酶解液液体发酵茶薪菇菌丝体6d时（培养条件120r/min,25℃，装液量40%，接种10%一级种子液）

图2为添加10%油茶饼粕蛋白酶解液液体发酵茶薪菇菌丝体6d时（培养条件120r/min,25℃，装液量40%，接种10%一级种子液）。

具体实施方式

茶薪菇菌种，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.茶薪菇菌种的活化：将菌种接种于pda固体斜面培养基，于26-28℃恒温培养箱培养7-9d,将培养好的菌种再次移接，重复上述操作2次即可。

2.一级种子液的制备：将步骤1中活化好的菌种用接种针刮取二块大约0.5cm×0.5cm大小的菌块接入液体发酵培养基中，按40%装瓶量、温度25℃，转速120r/min的基础培养条件在恒温振荡器上培养7-9d，进行摇床培养之前先在28℃恒温培养箱中静置24h。

液体发酵培养基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、磷酸二氢钾0.2%、七水合硫酸镁0.1%，维生素b10.01%。

3.油茶饼粕蛋白酶解液的制备：

取适量油茶饼粕于多功能粉碎机中粉碎并过100目筛，用石油醚在60℃下回流脱脂5h，烘干备用；称取适量脱脂油茶饼粕于50%的乙醇中超声浸提1次，超声波功率100w，超声提取20min，烘干备用。称取20g脱脂脱皂的油茶饼粕加入1l蒸馏水中并用0.1mol/lnaoh调ph至10.0超声40min，超声波功率100w，加入0.5%碱性蛋白酶、50℃恒温恒ph（0.1mol/lnaoh）酶解4h，96℃灭酶15min,再次调节ph至7.0，添加0.3%中性蛋白酶，40℃恒温恒ph（0.1mol/lnaoh、hci）酶解2h，96℃灭酶15min,4000r/min离心15min留取上层蛋白酶解液，保存于4℃冰箱备用，其水解度为24.7%。

4.配制添加油茶蛋白酶解液的茶薪菇深层发酵的液体培养基

葡萄糖2-3%（m/v）、蛋白胨0.6-0.8%(m/v)、磷酸二氢钾0.14-0.18%(m/v)、七水合硫酸镁0.07-0.09%(m/v)，维生素b10.007-0.009%(m/v)、油茶粕蛋白酶解液10-30%（v/v）、70-90%蒸馏水（v/v)；

对照组：葡萄糖4%、蛋白胨1%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%，维生素b10.01%

5.茶薪菇深层发酵菌丝体：

将配制好的液体培养基按40%装瓶量121℃灭菌15min,冷却至室温于超净工作台内接种10%的一级种子液，在温度25℃，转速120r/min的基础培养条件在恒温振荡器上培养6-8d，培养结束后取其发酵液4000r/min离心10-20min，发酵上清液可留存备用，将菌丝体置于60℃烘箱中烘干，其菌丝干重同不添加油茶粕蛋白酶解液的相比，提高了46.60%-69.44%。

本发明涉及的检测指标均按照国家标准检测得出。

实施例1：

1.茶薪菇菌种的活化：将菌种接种于pda固体斜面培养基，于26-28℃恒温培养箱培养7-9d,将培养好的菌种再次移接，重复上述操作2次即可；

pda斜面固体培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.2%、七水合硫酸镁0.1%、维生素b10.01%。

2.一级种子液的制备：将步骤1中活化好的菌种用接种针刮取二块大约大小的菌块接入液体发酵培养基中，按40%装瓶量、温度25℃，转速120--160r/min的基础培养条件在恒温振荡器上培养8d，进行摇床培养之前先在28℃恒温培养箱中静置24h。

液体培养基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、磷酸二氢钾0.2%、七水合硫酸镁0.1%，维生素b10.01%。

3.油茶饼粕蛋白酶解液的制备：

取适量油茶饼粕于多功能粉碎机中粉碎并过100目筛，用石油醚在60℃下回流脱脂5h，烘干备用；称取适量脱脂油茶饼粕于50%的乙醇中超声浸提1次，超声波功率100w，超声提取20min，烘干备用。称取20g脱脂脱皂的油茶饼粕加入1l蒸馏水中并用0.1mol/lnaoh调ph至10.0超声40min，超声波功率100w，加入0.5%碱性蛋白酶、50℃恒温恒ph（0.1mol/lnaoh）酶解4h，96℃灭酶15min,再次调节ph至7.0，添加0.3%中性蛋白酶，40℃恒温恒ph（0.1mol/lnaoh、hci）酶解2h，96℃灭酶15min,4000r/min离心15min留取上层蛋白酶解液，保存于4℃冰箱备用，其水解度为24.7%。

4.配制添加油茶蛋白酶解液的茶薪菇深层发酵的液体培养基

分别量取葡萄糖3.2%（m/v）、蛋白胨0.8%(m/v)、磷酸二氢钾0.16%(m/v)、硫酸镁0.08%(m/v)，维生素b10.008%(m/v)、油茶粕蛋白酶解液20%（v/v），80%蒸馏水（v/v）配制1l，以不添加油茶蛋白酶解液的液体培养基为对照。

5.茶薪菇深层发酵菌丝体：

将配制好的液体培养基按100ml/250ml装瓶，每个处理10个平行，121℃灭菌15min,冷却至室温于超净工作台内接种10%的一级种子液，在温度25℃，转速120r/min的基础培养条件在恒温振荡器上培养6d，培养结束后取其发酵液4000r/min离心15min，发酵上清液可留存备用，将菌丝体置于60℃烘箱中烘干至恒重并称重，添加20%油茶饼粕蛋白酶解液的菌丝体平均干重为1.73g/100ml，对照组菌丝体平均干重为1.10g/100ml，其菌丝干重同对照组相比，提高了57.27%。

实施例2：

1.茶薪菇菌种的活化：将菌种接种于pda固体斜面培养基，于26-28℃恒温培养箱培养7-9d,将培养好的菌种再次移接，重复上述操作2次即可；

pda斜面固体培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.2%、七水合硫酸镁0.1%、维生素b10.01%。

2.一级种子液的制备：将步骤1中活化好的菌种用接种针刮取二块大约大小的菌块接入液体发酵培养基中，按40%装瓶量、温度25℃，转速120--160r/min的基础培养条件在恒温振荡器上培养8d，进行摇床培养之前先在28℃恒温培养箱中静置24h。

液体培养基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%，维生素b10.01%。

3.油茶饼粕蛋白酶解液的制备：

取适量油茶饼粕于多功能粉碎机中粉碎并过100目筛，用石油醚在60℃下回流脱脂5h，烘干备用；称取适量脱脂油茶饼粕于50%的乙醇中超声浸提1次，超声波功率100w，超声提取20min，烘干备用。称取20g脱脂脱皂的油茶饼粕加入1l蒸馏水中并用0.1mol/lnaoh调ph至10.0超声40min，超声波功率100w，加入0.5%碱性蛋白酶、50℃恒温恒ph（0.1mol/lnaoh）酶解4h，96℃灭酶15min,再次调节ph至7.0，添加0.3%中性蛋白酶，40℃恒温恒ph（0.1mol/lnaoh、hci）酶解2h，96℃灭酶15min,4000r/min离心15min留取上层蛋白酶解液，保存于4℃冰箱备用，其水解度为24.7%。

4.配制添加油茶蛋白酶解液的茶薪菇深层发酵的液体培养基

分别量取葡萄糖3%（m/v）、蛋白胨0.75%(m/v)、磷酸二氢钾0.15%(m/v)、七水合硫酸镁0.075%(m/v)，维生素b10.007%(m/v)、油茶粕蛋白酶解液25%（v/v），75%蒸馏水（v/v）配制1l，以不添加油茶蛋白酶解液的液体培养基为对照。

5.茶薪菇深层发酵菌丝体：

将配制好的液体培养基按100ml/250ml装瓶，每个处理十个平行，121℃灭菌15min,冷却至室温于超净工作台内接种10%的一级种子液，在温度25℃，转速120r/min的基础培养条件在恒温振荡器上培养6d，培养结束后取其发酵液4000r/min离心15min，发酵上清液可留存备用，将菌丝体置于60℃烘箱中烘干至恒重并称重，添加25%油茶饼粕酶解的菌丝体平均干重是1.83g/100ml,对照组菌丝体平均干重为1.08g/ml，其菌丝干重同对照组相比，提高了69.44%。

实施例3：

1.茶薪菇菌种的活化：将菌种接种于pda固体斜面培养基，于26-28℃恒温培养箱培养7-9d,将培养好的菌种再次移接，重复上述操作2次即可；

pda斜面固体培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、磷酸二氢钾0.2%、七水合硫酸镁0.1%、维生素b10.01%。

2.一级种子液的制备：将步骤1中活化好的菌种用接种针刮取二块大约大小的菌块接入液体发酵培养基中，按40%装瓶量、温度25℃，转速120--160r/min的基础培养条件在恒温振荡器上培养8d，进行摇床培养之前先在28℃恒温培养箱中静置24h。

液体培养基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、磷酸二氢钾0.2%、七水合硫酸镁0.1%，维生素b10.01%。

3.油茶饼粕蛋白酶解液的制备：

取适量油茶饼粕于多功能粉碎机中粉碎并过100目筛，用石油醚在60℃下回流脱脂5h，烘干备用；称取适量脱脂油茶饼粕于50%的乙醇中超声浸提1次，超声波功率100w，超声提取20min，烘干备用。称取20g脱脂脱皂的油茶饼粕加入1l蒸馏水中并用0.1mol/lnaoh调ph至10.0超声40min，超声波功率100w，加入0.5%碱性蛋白酶、50℃恒温恒ph（0.1mol/lnaoh）酶解4h，96℃灭酶15min,再次调节ph至7.0，添加0.3%中性蛋白酶，40℃恒温恒ph（0.1mol/lnaoh、hci）酶解2h，96℃灭酶15min,4000r/min离心15min留取上层蛋白酶解液，保存于4℃冰箱备用，其水解度为24.7%。

4.配制添加油茶蛋白酶解液的茶薪菇深层发酵的液体培养基

分别量取葡萄糖3.6%（m/v）、蛋白胨0.9%(m/v)、磷酸二氢钾0.18%(m/v)、七水合硫酸镁0.09%(m/v)，维生素b10.009%(m/v)、油茶粕蛋白酶解液10%（v/v），90%蒸馏水（v/v）配制1l，以不添加油茶蛋白酶解液的液体培养基为对照。

5.茶薪菇深层发酵菌丝体：

将配制好的液体培养基按100ml/250ml装瓶，每个处理10个平行，121℃灭菌15min,冷却至室温于超净工作台内接种10%的一级种子液，在温度25℃，转速120r/min的基础培养条件在恒温振荡器上培养6d，培养结束后取其发酵液4000r/min离心15min，发酵上清液可留存备用，将菌丝体置于60℃烘箱中烘干至恒重并称重，添加10%油茶饼粕蛋白酶解液的菌丝体平均干重为1.51g/ml,对照组菌丝体平均干重为1.03g/ml,其菌丝干重同对照组相比，提高了46.60%。