水稻转录因子OsHRS1突变体构建方法及其在水稻干旱胁迫中的应用与流程

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及水稻转录因子oshrs1突变体构建方法及其在水稻干旱胁迫中的应用。

背景技术：

水资源短缺是一个主要的农业问题，缺极大地影响了植物的生长和发育，降低了作物产量。在人类总用水量中，70％是农业用水。因此对于研究作物节水抗旱机制，减少当前和未来的干旱风险具有重要意义。水稻是中国最主要的粮食作物之一，也是农业用水第一大户，如何提高水稻水分利用效率，开展水稻节水抗旱研究，发展节水型水稻，缓解水资源的供需矛盾，在农业节水抗旱中具有突出意义。因此对水稻进行抗旱性研究，减少农业生产用水显得尤为重要。在干旱条件下，植物激活各种代谢防御系统维持生长，例如通过降低蒸腾速率提高水稻的节水耐旱性。植物主要是通过蒸腾消耗大量水分，而蒸腾主要是通过调节气孔运动(张开和关闭)来减少水分流失(sirichandraetal.2009)。气孔位于植物叶片表皮，位于植物叶子表皮中的气孔控制co2在蒸腾过程中对光合作用和水分流失的吸收，因此在节水耐旱中具有重要作用。

oshrs1是myb家族转录因子，大部分myb蛋白具有转录激活作用，但有的myb蛋白也可以降低目的基因表达。有研究表明，在拟南芥中atmyb2蛋白在对脱水、盐胁迫和aba的应答过程中起到转录调控作用。到目前为止，有关myb家族转录因子的研究大部分来自拟南芥，而在水稻中的研究报道并不多。本发明以水稻为研究材料，有关oshrs1的研究主要是与花发育相关而在非生物胁迫中没有报道。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明的目的是利用水稻转录因子oshrs1基因的敲除材料，并进一步公开了水稻转录因子oshrs1基因在水稻节水耐旱中的应用。

本发明提供水稻转录因子oshrs1基因的敲除引物，所述的敲除引物序列如seqidno.1-2所示。本发明还提供水稻转录因子oshrs1基因的敲除靶位点，所述的靶位点如seqidno.3所示。

通过crispr-cas9技术，获得水稻转录因子oshrs1基因敲除材料。具体包括以下步骤：

(1)克隆水稻转录因子oshrs1基因；

(2)rt-pcr方法获得水稻转录因子oshrs1基因片段，依据crispr-cas9技术原理，设计oshrs1的突变靶位点，将带有靶位点的核苷酸序列与bgk03载体相连得到转化质粒，转化农杆菌；

(3)将带有转化质粒的农杆菌采用转基因方法转化日本晴水稻，得到oshrs1敲除材料；

(4)oshrs1敲除材料蒸腾表型分析；

(5)oshrs1敲除材料蒸腾速率气孔导度的测定；

(6)oshrs1敲除材料气孔观察。

本发明公开水稻转录因子oshrs1突变体构建方法，通过crispr-cas9技术，获得水稻转录因子oshrs1基因敲除材料，敲除材料即水稻转录因子oshrs1突变体。

本发明通过对oshrs1基因在水稻受干旱胁迫时的表达模式判断，推断该基因参与植物抗逆途径。根据该基因的序列设计敲除靶位点引物(seqidno.3)，利用rt-pcr技术从水稻品种日本晴总cdna中扩增得到oshrs1基因。通过crispr-cas9技术获得oshrs1敲除材料，研究其敲除后水稻中的抗逆功能，为oshrs1基因在其它植物上的应用提供了很好的基础。

本发明所述的水稻oshrs1基因可用于水稻转化，将其敲除后降低水稻的节水耐旱能力。

本发明还公开了一种提高水稻节水耐旱能力的方法，即利用水稻oshrs1基因敲除载体(即水稻oshrs1基因敲除质粒)转化目标水稻，从而获得oshrs1敲除材料。

所述的提高植物耐旱能力的方法，包括下述步骤：

(1)获得水稻转录因子基因oshrs1核酸序列及氨基酸序列；

(2)用rt-pcr方法获得水稻转录因子oshrs1基因片段(利用seqidno.1-2)；根据crispr/cas9技术原理，在oshrs1外显子区域靠近起始密码atg区域选择一段19bp的序列(5’-ctggacctgaagatgttcg-3’)(seqidno.3)作为靶位点；即rt-pcr合成的水稻转录因子oshrs1基因片段，在基因片段5'端加上靶位点序列seqidno.3以形成水稻转录因子oshrs1基因敲除片段(即带有靶位点的核苷酸序列)，然后将水稻转录因子oshrs1基因敲除片段连接到百格公司的bgk03载体得到水稻oshrs1基因敲除质粒，再转化农杆菌感受态细胞；

(3)用带有水稻oshrs1基因敲除质粒(即前述的转化质粒)的农杆菌转化目标植物，之后进行转基因阳性苗的鉴定；

(4)目标植物转基因t2代阳性纯合植株的筛选；

(5)转基因纯合植株的节水耐旱分析。

本发明根据oshrs1基因的序列设计如下引物：

上游引物f：5’-acccttcctccagttcttg-3’(seqidno.1)，

下游引物r:5’-tccacgagcacgatctttc-3’(seqidno.2)。

利用rt-pcr技术从水稻日本晴总cdna中扩增得到oshrs1基因全长cdna(开放阅读框部分)。按roche公司的revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit说明书操作进行第一链合成。根据oshrs1基因的序列设计如下引物，f：5’-acccttcctccagttcttg-3’(seqidno.1)和r：5’-tccacgagcacgatctttc-3’(seqidno.2)为rt-pcr引物，利用rt-pcr进行cdna扩增，扩增条件为：95℃预热3min；95℃,10s，60℃,30s，72℃,2min，共35个循环；72℃,10min。pcr结束后进行电泳分析，采用康为世纪公司的胶回收试剂盒回收约1700bp的扩增片段。将胶回收片段连接t载体转化感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落pcr以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到南京金斯瑞公司测序经测序表明为myb家族转录因子，oshrs1的全长cdna为1227bp，编码一个由409个氨基酸组成的蛋白。

根据crispr/cas9技术原理，在oshrs1外显子区域靠近起始密码atg区域选择一段19bp的序列(5’-ctggacctgaagatgttcg-3’)(seqidno.3)作为靶位点，该序列3’端pam序列为cgg。crispr/cas9表达载体bgk03的靶序列由水稻u6启动子驱动，编码cas9蛋白基因由加强型玉米(ubi)启动子驱动。将合成靶位点的核苷酸序列与百格公司的bgk03载体相连命名为bgk03-oshrs1。

本发明根据oshrs1基因的敲除靶位点序列设计如下检测引物，扩增大小为419bp：

f:5’-gttgtgattggaggctggca-3’(seqidno.4)，

r:5’-ttttgtgtgtgcaggtccga-3’(seqidno.5)。

本发明的oshrs1基因是能够针对性调控植物节水能力提高的转录因子基因；且该抗逆基因来自水稻本身，对环境影响较小。

本发明通过对oshrs1基因转化水稻进行该基因的功能研究，获得了对水稻节水耐旱具有重要研究价值的转基因水稻；oshrs1基因在水稻节水耐旱过程中具有重要作用，为利用该基因在其他植物上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。

附图说明

图1oshrs1的核苷酸序列及其氨基酸序列；

图2oshrs1基因的亚细胞定位；

图3oshrs1敲除材料t1代纯合株系内荧光定量检测；wt：野生型；hrs1-2、hrs1-8、hrs1-15为oshrs1敲除材料

图4oshrs1敲除材料在溶液中的耐旱性研究，wt：野生型；hrs1-2、hrs1-8、hrs1-15为oshrs1敲除材料；

图5oshrs1敲除材料蒸腾速率、气孔导度的测定，wt：野生型；hrs1-2、hrs1-8、hrs1-15为oshrs1敲除材料；

图6oshrs1敲除材料热成像观察，wt：野生型；mut-2、mut-8、mut-15为oshrs1敲除材料；

图7oshrs1敲除材料气孔观察，wt：野生型；mut-2、mut-8、mut-15为oshrs1敲除材料。

具体实施方式

实施例1：水稻转录因子oshrs1核苷酸序列及氨基酸序列的获得

登陆水稻数据库中心主页(http://www.ricedata.cn/gene/)，根据其loc_os03g55590号搜索到oshrs1核苷酸序列及氨基酸序列。参考序列如图1所示。

实施例2：水稻转录因子oshrs1的亚细胞定位

通过pext06/g空载体序列的多克隆位点，在目的基因oshrs1的cds区两端设计分别带有pext06/g载体序列的正向引物和反向引物，pext06/g载体带有gfp标签，在荧光下显示绿色。引物如下(加粗为载体序列，后面的为目的基因的cds区的首尾两端)：

通过pcr获得oshrs1带有载体序列的片段，利用dna回收试剂盒回收1259bp左右的dna片段，将此片段与相应的pext06/g载体通过同源重组方法相连。获得载体命名为pext06/g-hrs1。经测序无误后转化农杆菌gv3101。

(1)挑取转化后的农杆菌gv3101单菌落于3mllb+利福平+庆大霉素液体培养基>36h，至od600＝1.1；

(2)4℃、5000rpm离心10min，用重悬液(表2.3)重悬菌体沉淀至od600＝0.7；

(3)取1ml重悬液注射烟草叶片，并做好相应标记；

(4)荧光显微镜2d后扫描烟草叶片，观察并拍照。

表1重悬液配方

从图2中可以看出，hrs1定位在细胞核，并可以形成二聚体，说明oshrs1是myb家族转录因子。

实施例3：oshrs1敲除材料t0代阳性植株的鉴定

利用rt-pcr技术从水稻日本晴总cdna中扩增得到oshrs1基因全长cdna(开放阅读框部分)。按roche公司的revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit说明书操作进行第一链合成。根据oshrs1基因的序列设计如下引物，f：5’-acccttcctccagttcttg-3’(seqidno.1)和r：5’-tccacgagcacgatctttc-3’(seqidno.2)为rt-pcr引物，利用rt-pcr进行cdna扩增，扩增条件为：95℃预热3min；95℃,10s，60℃,30s，72℃,2min，共35个循环；72℃,10min。pcr结束后进行电泳分析，采用康为世纪公司的胶回收试剂盒回收约1700bp的扩增片段。将胶回收片段连接t载体转化感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落pcr以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到南京金斯瑞公司测序经测序表明为myb家族转录因子，oshrs1的全长cdna为1227bp，编码一个由409个氨基酸组成的蛋白。根据crispr/cas9技术原理，在oshrs1外显子区域靠近起始密码atg区域选择一段19bp的序列(5’-ctggacctgaagatgttcg-3’)(seqidno.3)作为靶位点，该序列3’端pam序列为cgg。crispr/cas9表达载体bgk03的靶序列由水稻u6启动子驱动，编码cas9蛋白基因由加强型玉米(ubi)启动子驱动。即rt-pcr合成的水稻转录因子oshrs1基因片段，在基因片段5'端加上靶位点序列seqidno.3以形成水稻转录因子oshrs1基因敲除片段(即带有靶位点的核苷酸序列)。将按上述方法得到的带有靶位点的核苷酸序列与百格公司的bgk03载体相连命名为bgk03-oshrs1，bgk03-oshrs1转化农杆菌感受态细胞，再次测序验证。将带有bgk03-oshrs1的农杆菌通过转基因的方法转化水稻日本晴，得到t0代阳性水稻。

采用快速抽提dna的方法提取t0代阳性水稻基因组dna，其步骤如下：

(1)采集植物幼嫩叶片10mg装入2ml的离心管，放置于冰盒中。

(2)加入250ul提取缓冲液buffer及小钢珠(两颗)，在磨样机中研磨3分钟。

(3)放置于94-100℃水浴培养10分钟。(温度95℃适宜，不宜过高，时间不宜超过12分钟，影响质量。)

(4)12000rpm离心5分钟。

(5)吸取上清液(根据需要，最多可吸50ul)因其上清还浑浊，可进行二次离心，取上清50ul(可加入ddh2o稀释10倍)

(6)-20℃保存。

表2抽提液配方

取1μldna作为模板，根据oshrs1基因的敲除靶位点序列设计如下检测引物，f:5’-gttgtgattggaggctggca-3’(seqidno.4)，r:5’-ttttgtgtgtgcaggtccga-3’(seqidno.5)。扩增大小为419bp，扩增条件为：94℃预热5min；94℃,30s,58℃,30s,72℃,1min，共35个循环；72℃,10min。以转基因水稻dna为模板，能扩增出长度为419bp的目的片段，将pcr产物测序与敲除位点用软件snapgene进行序列比对，若比对结果为双峰且有突变则为杂合突变，还需进行t1代的筛选(筛选方法与t0代的筛选过程相同)，若比对结果是单峰且有突变位点则为纯合突变。

实施例4：转录因子oshrs1敲除材料t1代纯合株系内荧光定量检测

为了了解所获得的3个oshrs1敲除材料纯合基因的表达量情况，进行各个转基因水稻t2代纯合株系荧光定量pcr检测。将生长到三叶一芯期的水培水稻幼苗每个株系进行取样，每个株系至少取10株幼苗，取水稻每株幼苗的旗叶迅速置于液氮中速冻，并转移到-70℃冰箱保存，直至rna抽提。总rna抽提采用takara公司的rnaisoplus试剂盒提取。水稻cdna的合成按fermentas公司的revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit说明书操作进行第一链合成。荧光定量pcr在abi公司的7500定量pcr仪上进行，以设计的f:5’-ccaaagcaaatcagggaggt-3’(seqidno.8)和r:5’-cgacttgtcatcatcctcgca-3’(seqidno.9)为引物进行荧光定量pcr，反应条件为：95℃1min；95℃,15s,60℃,20s,72℃,31s,采集荧光信号，共40个循环；60℃to95℃,每1℃采集一次荧光信号,持续1s。

反应结束后，用abi7500自带的软件进行分析及绘图(图3)。结果显示每个敲除材料的表达情况都有所降低，各突变体材料降低的大小有所不同，可能是由于目的基因的敲除位点的不同有关。

实施例5：转录因子基因oshrs1敲除水稻材料节水抗旱分析

获得3个纯合转化株系，对oshrs1-2、oshrs1-8、oshrs1-15、三个敲除材料做进一步分析，主要有以下四个方面：

1)植株蒸腾表型分析。

选择大小一致、籽粒饱满的野生型(wt)和oshrs1纯合敲除材料表面消毒、浸种、催芽后，置于培养箱内水培45天左右，每天16h光照8h黑暗。种子萌发后将清水换成营养液，培养至三叶期。

分别选取长势一致的三叶期的野生型(wt)和oshrs1纯合敲除材料各45株。将不同水稻株系放置在相同大小的透明方盆内，加满营养液后，在培养箱内放置3天，观察透明方盆内水位变化并以黑线标记水位，对野生型(wt)和敲除材料蒸腾表型进行拍照分析。如图4所示，oshrs1敲除材料的水位明显低于野生型对照，表明oshrs1敲除材料的蒸腾速率高于野生型对照。这些结果均表明oshrs1敲除材料的蒸腾速率高于对照，证明是oshrs1参与了调节植物节水耐旱的功能。

表3水稻营养液配方

2)蒸腾速率气孔导度测定。

采用便携式光合仪li-6400分别测定五叶期野生型对照及oshrs1敲除材料水稻第二片展开叶的蒸腾速率和气孔导度，如图5所示，oshrs1敲除材料第二片展开叶的蒸腾速率和气孔导度均极显著(p＜0.01)高于对照。该结果与oshrs1敲除材料观察到的蒸腾表型结果相符，因此证明oshrs1在调节植物蒸腾速率气孔导度中具有重要作用。

3)热成像分析。

采用热成像仪在田间测定野生型材料和oshrs1敲除材料相同叶的温度，然后采用flirtools对材料叶片表面温度取点进行统计，最后通过平均值比较不同材料的叶片表面温度。如图6所示，oshrs1敲除材料叶片的温度极显著低于对照。叶片温度越高，蒸腾速率越低；温度越低，蒸腾速率越高。这些结果与oshrs1敲除材料观察到的蒸腾表型的结果相符，因此推测水稻可能是通过oshrs1调节水稻的气孔导度和蒸腾速率。

4)气孔观察

上述结果表明，oshrs1敲除材料蒸腾速率气孔导度均显著高于野生型对照。有研究表明，气孔导度的降低可能与气孔开度、气孔密度和气孔长度相关，因此我们采用环境扫描电子显微镜(xl-30esem，philips，荷兰)测定水稻三叶期的野生型对照及oshrs1敲除材料第二片展开叶的气孔开度、气孔密度和气孔长度。然后采用软件image-proplus6.0对叶片表面的气孔开度、气孔密度和气孔长度进行统计。如图7所示oshrs1四个敲除材料oshrs1-2、oshrs1-8、oshrs1-15完全张开的气孔显著高于对照，而完全关闭的气孔显著低于对照。此外如图7所示oshrs1敲除材料的气孔长度显著高于对照，表明oshrs1的突变不仅影响气孔开度的变化而且通过影响气孔长度的改变，从而影响水稻蒸腾速率。而气孔密度并没有显著差异。表明oshrs1参与调节气孔大小和气孔长度，调节水稻的蒸腾速率气孔导度。

以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>扬州大学

<120>水稻转录因子oshrs1突变体构建方法及其在水稻干旱胁迫中的应用

<130>xhx2018120703

<141>2018-12-10

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acccttcctccagttcttg19

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tccacgagcacgatctttc19

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctggacctgaagatgttcg19

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gttgtgattggaggctggca20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ttttgtgtgtgcaggtccga20

<210>6

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tcagcagtcgaagagcatggggctggacgtggggga36

<210>7

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ttagcgtgtgaagagcttttcggacatagccttcc35

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ccaaagcaaatcagggaggt20

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

cgacttgtcatcatcctcgca21