一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用的制作方法

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用。
背景技术：
：癌症，又称恶性肿瘤，它是严重危害人类健康、导致现代人类死亡的第一大恶疾和顽症。据联合国统计数据显示，目前全球平均每8个死亡病例中就有1人死于癌症，这比艾滋病、结核病和疟疾导致的死亡人数还要高。而且每年全球还有1000多万人被确诊患上癌症(世界卫生组织发布的《2014年世界癌症报告》)。一直以来，肿瘤治疗的基础都是手术、化疗以及放疗。然而传统的治疗方式仅能延长恶性肿瘤患者的生存期，治愈的可能性很低，恶性肿瘤依然是“绝症”。在过去20年中，通过特异性识别肿瘤细胞表面特异性蛋白、从而杀死肿瘤细胞的靶向疗法比如西妥昔单抗和曲妥珠单抗治疗方法，使得它们成为很多癌症的标准治疗方法，然而上述方法并不能够有效治疗实体瘤。但在过去几年中，免疫疗法，一种通过招募并加强病人的免疫系统以攻击肿瘤的方法，已经成为肿瘤治疗方法的第5大支柱。其中，最热门且目前最接近fda获批的治疗方法为car-t细胞治疗方法。然而，直到最近，car-t细胞治疗法一直局限于小规模的临床试验，并且大部分是用于晚期血液癌症的治疗，而除淋巴瘤以外的恶性实体肿瘤效果不佳。car-t细胞用于实体瘤治疗的最大障碍在于肿瘤免疫抑制微环境，是肿瘤发生发展过程中形成的内环境。恶性实体肿瘤主要由癌/瘤细胞和基质细胞(例如成纤维细胞和炎症细胞)细胞外基质及血管/淋巴管构成。与正常组织相比，肿瘤组织中的基质细胞、细胞外基质和血管/淋巴管系统一般是异常的，具有增加数目的成纤维细胞，并且血管系统呈现出高度分支或卷曲的结构。肿瘤和基质细胞产生并装配细胞外基质组分(胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸)形成致密团块(clinoncol31:2205-2218.2013)。以上因素造成了肿瘤组织结构致密、营养缺乏、ph偏低、缺氧，抑制了car-t细胞有效发挥肿瘤杀伤作用。想要有效治疗肿瘤，car-t细胞必须能够克服上述微环境，进入到肿瘤组织、在肿瘤组织中存活并对肿瘤细胞进行杀伤。尽管可能已经产生了针对肿瘤微环境的car-t细胞，即表达透明质酸酶ph20的car-t细胞(专利cn107400664a)，但是这种细胞产生的技术手段存在问题，发挥杀伤作用的原理及技术效果未得到揭示。首先，在透明质酸酶的设计上，cn107400664a认为：在自然状态下，透明质酸酶是以分泌蛋白质形式(即游离透明质酸酶)而不是以跨膜蛋白质的形式表达，这种分泌型透明质酸酶或者透明质酸酶跨膜融合蛋白质基因序列中的透明质酸酶编码序列可以是全部蛋白质编码序列，也可以是含有编码透明质酸酶活性的部分序列。但未公布制备分泌透明质酸酶ph20car-t细胞的技术手段，且指出了与游离型扩散的透明质酸酶相比较，跨膜型透明质酸酶疗效更好。其次，在具体实施例中公开的表达透明质酸酶跨膜融合蛋白的car-t细胞制备方法，即采用透明质酸酶ph20跨膜融合蛋白慢病毒感染car-t细胞，通过透明质酸酶抗体磁珠分离得到表达跨膜透明质酸酶的car-t细胞。该ph20跨膜融合蛋白的编码序列由ph20-人igg4铰链区-cd8跨膜区-cd28胞内区-4-1bb胞内区-cd3ζ胞内序列依次组成。但其未公布该car-t细胞的透明质酸降解活性，car-t细胞的肿瘤细胞杀伤活性，car-t细胞的体内肿瘤抑制活性。本发明人通过实验发现，采用cn107400664a公开的表达透明质酸酶跨膜融合蛋白的制备方法很难获得具有透明质酸酶活性的car的阳性细胞；另一方面，采用两个慢病毒分别感染t细胞后，t细胞状态差，car阳性细胞几乎无法检测到透明质酸酶活性。鉴于以上缺陷，现有技术中亟待需要一种有效的包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是为了克服目前现有技术当中无法得到具有透明质酸降解活性的car-t细胞、同时car的阳性率也很低或者含有透明质酸酶的car-t细胞难以分泌透明质酸酶，因而无法得到有效的包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞的缺陷，提供一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用。所述免疫细胞可以进入实体瘤内部杀死肿瘤细胞；在可溶型ph20蛋白的帮助下，包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞也能进入实体瘤内部，杀死肿瘤细胞。本发明提供一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞，其表达透明质酸酶，所述透明质酸酶为：a)锚定于所述免疫细胞上的全长蛋白；或b)分泌至所述免疫细胞外的可溶型蛋白。透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族。在人类中，存在编码具有不同性质和位置的透明质酸酶的6个基因，hyal1、hyal2、hyal3、hyal4、hyal5(又被称为spam1或者ph-20)、hyal6(又被称为hyalp1)。同工型hyal1和hyal2存在于大多数组织中。hyal2为gpi膜锚定蛋白，主要负责剪切高分子透明质酸，得到的小片段透明质酸被细胞内吞至内溶酶体(endolysosome)后，被hyal1进一步降解。在肿瘤组织中，透明质酸由透明质酸合成酶合成(has1、has2以及has3)。hyal3存在于骨髓和睾丸中，但是其功能还没有被良好地表征。透明质酸酶ph20在睾丸中高表达，并参与卵母细胞被精子受精的过程。所述透明质酸酶较佳地为哺乳动物睾丸透明质酸酶；更佳地为人类睾丸透明质酸酶，也被称为spam1、精子黏附分子1或者ph20。编码所述ph20的基因产生两种转录变体，分别对应两种形式的酶序列：一种形式为包含膜锚定序列的ph20序列，该所述ph20序列可以锚定在包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞的表面。因此，获得了表达细胞膜锚定ph20的包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞；本发明中所述透明质酸酶的氨基酸序列较佳地如序列表中seqidno.1所示，编码该所述ph20的核苷酸序列较佳地如序列表中seqidno.2或者3所示。另一种形式为缺失了对应于羧基端膜结合结构域的序列，所述缺失后的序列的最后一位氨基酸通常位于全长序列的第430～454位，以产生可溶型ph20，该羧基端结构域的缺失导致透明质酸酶分泌到细胞外介质。因此，获得了表达在中性及偏酸性ph条件下具有酶活性的分泌性透明质酸酶的包含car或者tcr的t细胞或者nk细胞，所述的nk细胞为nk-92细胞；该种形式的透明质酸酶的氨基酸序列为如序列表中seqidno.1所示的氨基酸序列的第1～447位；较佳地，其核苷酸序列为如序列表中seqidno.2或者seqidno.3所示的核苷酸序列的第1～1341位。所述的肿瘤抗原识别受体为嵌合抗原受体(car)或者t细胞受体(tcr)，其中：所述的tcr包含，如tcr的α链、tcr的β链、tcr的γ链、tcr的δ链或它们的组合，所述α链包含可变区和恒定区，较佳地，所述可变区为人tcrα链的可变区，所述恒定区鼠α链的恒定区，较佳地，所述β链包含可变区和恒定区，所述可变区为人tcrβ链的可变区，所述恒定区为鼠β链的恒定区；其中，所述tcr的α链和所述tcr的β链之间可以通过接头序列连接，所述接头序列可以为p2a、t2a、e2a、f2a或者ires；更佳地为e6tcr。所述的car所包括的胞内区、铰链区以及跨膜区均可为本领域常规，所述的car的胞内区优选包括人的4-1bb胞内区和/或人的cd28胞内区，以及人的cd3ζ胞内区，更优选包括人的4-1bb胞内区、人的cd28胞内区，以及人的cd3ζ胞内区。所述的car的铰链区优选人的cd8α铰链区、所述的跨膜区优选人的cd8α跨膜区所述抗原识别区、所述铰链区、所述跨膜区以及所述胞内区之间可以通过接头序列连接，所述接头序列包含n个前后重复的基序，所述基序为gggs、ggggs、ssssg、gsgsa或者ggsgg，所述n为1～5的整数。较佳地，所述肿瘤抗原识别区识别的抗原可以为epcam、mesothelin、cea、il13、pdpn、vegf、egfr、egfrviii、psma、fap、cd171、gd2、glypican-2、glypican-3、her2、hpv抗原、cyclind1、p53、mmp-7、il13ralpha2、mmp-2、muc-1、g250、l1cam、ror1、gpc3或者msln；较佳地为ror1、gpc3、msln或者epcam。mesothelin、il13r、podoplanin(pdpn)、egfrviii以及egfr在胶质母细胞瘤中均有过量表达；epcam在上皮细胞癌中有过量表达。所述肿瘤抗原识别区为能够结合以上肿瘤抗原的区域例如抗体，目前常用的为scfv(单链抗体)。较佳地，识别所述ror1的scfv的核苷酸序列如序列表中seqidno.4所示，或者，识别所述gpc3的scfv的核苷酸序列如序列表中seqidno.5所示，或者，识别所述epcam的scfv的核苷酸序列如序列表中seqidno.6所示。将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学方法转移入宿主细胞。物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等；化学方法包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠，和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体；其中生物方法包括使用dna和rna载体。在一种实施方式中，所述的载体被递送(例如，通过转染或电穿孔)到细胞，例如，t细胞或nk细胞，其中所述的载体包含编码如本发明中描述的透明质酸酶的核酸分子，该核酸分子被转录为mrna分子，并且从所述的rna分子翻译为所述的透明质酸酶并表达在所述细胞的表面上。表达所述透明质酸酶的基因可以与表达上述免疫细胞中的肿瘤抗原识别受体的基因位于不同或者同一个载体上。在所述位于同一个表达载体上的情况下，所述的表达载体包括以下表达单元：信号肽+scfv+人cd8α铰链区+人cd8α跨膜区+人4-1bb胞内区+人cd3ζ胞内区+连接肽+透明质酸酶，其中，所述信号肽位于5’端，所述透明质酸酶位于3’端；或者，e6tcr+连接元件+透明质酸酶，其中，所述e6tcr位于5’端，所述透明质酸酶位于3’端；在所述位于不同的表达载体上的情况下，其中一个所述表达载体包括以下表达单元：信号肽+scfv+人cd8α铰链区+人cd8α跨膜区+人4-1bb胞内区+人cd3ζ胞内区，另一个所述表达载体包括以下表达单元：透明质酸酶+连接元件+标签蛋白，其中，所述的透明质酸位于5’端，所述的标签蛋白位于3’端；所述的连接元件优选t2a连接肽、p2a连接肽、e2a连接肽、f2a连接肽或者ires元件；所述的标签蛋白优选tegfr。较佳地表达所述透明质酸酶的基因位于上述免疫细胞中的肿瘤抗原识别受体表达载体上。本发明中所述的表达载体可为本领域内常规的、用于在哺乳动物中过表达外源基因的载体，其被用于目的基因的表达，所述表达载体对于复制和整合真核细胞为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节目的基因表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。较佳地为质粒、噬菌体、噬菌体衍生物、动物病毒或者粘粒；其中使用病毒载体已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物细胞(例如人类细胞)的方法。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。当本发明所述表达载体选用动物病毒作为表达载体时，优选逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、孢疹病毒或者慢病毒，更优选逆转录病毒或者慢病毒。不论表达所述的透明质酸酶的基因与表达所述的肿瘤抗原识别受体的基因位于同一个表达载体上或者不同的表达载体上，两者在包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞中的表达均可为本领域常规；为保证目的基因可以高效地表达，本发明所述的核苷酸序列可以通过多种方式被操作，例如：所述透明质酸酶或者肿瘤抗原识别受体的表达可以受到一个或者多个调控序列的调控。所述的调控序列可以是：(1)合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列，终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端操作性连接，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明；(2)合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mrna的非翻译区，前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接，在选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列都可用于本发明；(3)合适的启动子序列，合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、eb病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期望表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在不期望表达时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。本发明中的启动子较佳地为巨细胞病毒启动子、腺病毒主要晚期启动子、sv40启动子、单纯性疱疹病毒胸苷激酶启动子、cmv启动子、eflα启动子、泛素c启动子、pgk启动子、ires启动子、mmtv、hivltr启动子、momulv启动子、alv启动子、ebv启动子、rsv启动子或者人类基因的启动子，所述人类基因启动子为肌凝蛋白启动子、血红蛋白启动子、肌酸激酶启动子、β-肌动蛋白启动子、人类il-2启动子、人类il-4启动子、ifn启动子、e2f启动子或者人类gm-csf启动子；更优选ef1α启动子。上述免疫细胞可为本领域内常规的免疫细胞，例如t细胞或nk细胞或巨噬细胞；较佳地所述t细胞为cd3抗体刺激活化后的t细胞；更佳地，所述t细胞来源于肿瘤患者的外周血单个核细胞(pbmc)。本发明还提供一种上述免疫细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用；所述肿瘤较佳地为实体肿瘤。所述实体肿瘤为本领域内常规的实体肿瘤，优选表达透明质酸的实体肿瘤，例如乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤或者肺癌。本发明还提供一种药物组合物，其包含上述免疫细胞。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明的包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞，可以改变微环境的细胞外基质结构正常化肿瘤免疫微环境的效果，从而使得其可以有效接近并杀死肿瘤细胞。在可溶性ph20蛋白的帮助下，包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞也能改善肿瘤微环境，有效杀死肿瘤细胞。附图说明图1为ppwt质粒。图2为胰腺癌pdx选定样本免疫组化图；a.he染色；b.msln染色；c.ha染色；d.经ph20处理后进行ha染色；图中比例尺为100μm。图3为胃癌pdx选定样本免疫组化图；a.he染色；b.epcam染色；c.ha染色；d.经ph20处理后进行ha染色；图中比例尺为100μm。图4为表达ph20的免疫细胞对人胰腺癌pdx模型小鼠移植瘤的抑制作用。图5为表达ph20的免疫细胞对人胃癌pdx模型小鼠移植瘤的抑制作用。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1.car/tcr序列的设计本发明涉及的蛋白包括ph20、cd8α铰链区、人的cd8α跨膜区、人的4-1bb胞内区和人的cd3ζ胞内区、msln、has2(透明质酸酶合成基因)以及靶向各靶点的scfv序列、tcr序列。其中ph20氨基酸序列的ncbi收录号为np_694859.1(cdna为nm_153189.2)；has2的ncbi收录号为np_005319.1(cdna为nm_005328.3)；msln的ncbi收录号为np_037536.2(cdna为nm_013404.4)；tegfr为egfr的第iii和iv结构域，egfr的ncbi收录号为np_005219.2(cdna为nm_005228.4)。mslnscfv(ss1)的氨基酸序列及编码碱基序列来源于专利us7977457(seqidno12)；gpc3scfv的氨基酸序列来源于专利cn104140974a(seqidno22)，碱基序列为针对人进行密码子优化得到；ror1scfv的氨基酸序列及编码碱基序列来源于专利us20170283497a1(seqidno93)，碱基序列为针对人进行密码子优化得到；epcamscfv(moc31)的氨基酸序列来源于专利us7858088(seqidno2)，碱基序列为针对人进行密码子优化得到；her2scfv(frp5)的氨基酸序列及编码碱基序列来源于专利us7887801(seqidno2)；e6tcr的氨基酸序列及编码碱基序列来源于专利cn105452288a(seqidno30)。用于本发明各种细胞制备涉及蛋白的氨基酸序列信息如表1所示，相关表达区域的结构如表2所示，编码氨基酸的碱基序列如表3所示。表1.氨基酸序列表表2.碱基序列表表3.慢病毒goi载体表达蛋白的连接顺序按照表2的碱基序列以及表3的顺序委托genewiz公司进行car或者tcr序列的全基因合成。实施例2.载体构建实施例1中合成得到的ph20、car/tcr碱基序列通过ecori和xbai酶切、经dnaligationkit(takara)连接插入慢病毒载体pcdh-ef1a(sbi)的对应位点(图1)，得到目的基因表达载体lenti-goi。msln碱基序列通过bamhi和ecori酶切、经dnaligationkit(takara)连接插入pcdna3.1载体(invitrogen)的对应位点；has2碱基序列通过nhei和bamhi酶切、经dnaligationkit连接插入pcdna3.1-hyg载体(invitrogen)的对应位点。连接产物分别转化至感受态大肠杆菌(top10)。转化后第二天，挑取克隆至含100μg/ml氨苄西林(生工生物)lb液体培养基中进行培养，并测序鉴定。选择测序结果正确的克隆，接种至50ml规模含100μg/ml氨苄西林的lb液体培养基中培养约16小时。收集菌体，使用质粒中抽试剂盒(qiagen)提取并纯化质粒。得到的msln-pcdna3.1质粒采用pvui进行线性化酶切，has2-pcdna3.1-hyg质粒采用fspi进行线性化酶切。酶切产物采用酚氯仿进行抽提，得到初步的线性化质粒。质粒制备所用限制性内切酶均购自thermo公司。质粒除菌处理：在得到的质粒中分别加入1/14体积的3mnacl溶液，使盐离子浓度达到200mm。后加入2.5倍体积-20℃预冷的无水乙醇，反复颠倒混匀，于-20℃保留30min。将该得到的溶液12,000rpm，4℃离心20min，小心地弃去上清，收集沉淀。用1ml70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm，离心5min后弃去上清。无菌风干沉淀，加入100～200μl无菌水溶解dna。无菌取5μl用tebuffer稀释50倍，紫外测od260和od280。最终得到浓度确定可用于转染的质粒。实施例3.慢病毒包装准备10cm细胞培养皿，接种5×106个293细胞/皿，加入完全培养基dmem高糖(gibco)+10％fbs(gibco)，置于37℃、5％co2培养箱，过夜培养。取出1mg/ml的聚醚酰亚胺(pei，polyscience)转染试剂及慢病毒包装质粒(lenti-goi、pmd2.g、pspax2)，室温解冻。取出hbss缓冲液，温热至室温。取2mlpbs至6孔板的一个孔，分别加入10μglenti-goi、7μgpspax2、4μgpmd2.g混匀，加入63μlpei转染试剂并用移液器混匀，室温静置10分钟。将dna/pei复合物逐滴加入到10cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％co2培养箱，培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基并放回培养箱中继续培养。培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养上清，用0.45μm滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，加入5ml20％蔗糖，然后沿着离心管内壁轻轻加入含有病毒的培养基上清。50000×g于4℃离心2小时，离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入400μlpbs缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。复苏ht1080细胞并将细胞状态调整至对数生长期。按照每孔8×105个细胞接种ht1080至6孔板，培养体积为3ml，将6孔板置于37℃、5％co2培养箱中过夜培养。将浓缩后的慢病毒按照0.1、1、10μl的量加入至上述6孔板中，同时添加终浓度为6μg/ml的聚凝胺(polybrene，sigma)。将6孔板重新放回37℃、5％co2培养箱中，连续培养96小时。培养结束后，使用pbs洗涤每孔的细胞，然后使用基因组dna提取试剂盒(tiangen)提取基因组dna，并使用nanodrop2000测定所提取的基因组dna的浓度。采用荧光定量pcr的方法测定慢病毒拷贝数。按照sybrpremixextaqⅱ(takara)说明书配制qpcr的反应体系，制备pcr反应预混液，使用rochelightcycler480进行pcr反应。计算拷贝数，根据计算结果将病毒滴度调整至约为1×108tu/ml。实施例4.表达ph20的t细胞、car-t以及tcr-t细胞的制备调整t细胞密度至1×106细胞/ml，加入终浓度为100iu/ml的白介素2(novatis)及终浓度为100ng/ml的anti-cd3-okt3抗体(thermo)，培养约48hr。核转染方式制备采用lonzat细胞转染试剂盒(vpa-1002)进行t细胞的转染。对t细胞转染程序进行优化，首先选择试剂盒推荐优选方案，v-024/u-014，这两种方式转染后得到细胞活力特别低，因此优化方案至u-010/t-010再进行实验。取出转染所需的质粒至室温融化，打开核转仪，选定不同程序进行转染：v-024/u-014/u-010/t-010(转染强度依次降低)。准备核转染试剂，取20×4μlsupplement加入至90×4μlnucleofectorsolution中，即1:4.5的比例，轻轻混匀后平衡此混合溶液至室温。取xvivo培养基于6孔板，2.5ml/孔，共8个孔，按5.3.4的规则编号，将6孔板放入37℃培养箱预热。从细胞培养箱拿出ss1-car-t细胞，计数并再次确认，取相应体积细胞液200×g离心5min，弃净上清，离心过程中取出预热的6孔板。取100ul中平衡至室温的混合溶液重悬细胞，再依次加入质粒，混匀后用试剂盒中配套的吸管将细胞液轻轻转至电转杯中。将电转杯放入核转仪，按下“x”键开始电转。电转结束后，取出电转杯，立即吸取500μl预热的培养基稀释电转的细胞悬液，轻柔的混匀后均匀的加至2个含预热培养基的6孔板孔中。转染后2±0.5hr，去掉培养基上清，用新鲜培养基x-vivo15(lonza)(含100iu/ml白介素2)重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的方瓶中。继续培养3天，得到car-t细胞。慢病毒感染方式制备从-80℃冰箱取出含有慢病毒的重悬溶液后，迅速在37℃水浴锅中融化。在方瓶中加入含有慢病毒的重悬溶液，添加终浓度为5μg/ml的polybrene，充分混匀后，800×g离心1.5小时。离心结束后，将方瓶置于37℃5％co2培养箱中继续培养24小时。250×g离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基x-vivo15(lonza)(含100iu/ml白介素2)重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的方瓶中。继续培养3天，得到car/tcr-t细胞。阳性率检测取1×106个细胞使用facs检测t细胞表面car/tcr分子的表达情况。通过proteinl抗体(thermo)检测car阳性率，对应的二抗为streptavidinpe和streptavidinfitc(bdbioscience)。通过erbitux抗体(bms)及对应二抗pe山羊抗人iggfc抗体(thermo)检测mph20-t及sph20-t细胞阳性率。通过fitchamsteranti-mousetcrβchain(bdbioscience)抗体检测tcr阳性率。阳性率检测结果见表4。表4.表达ph20的t细胞、car-t以及tcr-t细胞的阳性率免疫细胞体外实验(％)体内实验(％)mph20-twt27.5/sph20-twt24.9/mph20-t25.6/sph20-t30.2/msln-car-t核转染*2.8/msln-mph20-car-t核转染*1.7/msln-sph20-car-t核转染*2.1/msln-car-t22.133.6msln-mph20-car-t19.729.7msln-sph20-car-t18.730.4gpc3-car-t26.4/gpc3-mph20-car-t16.7/gpc3-sph20-car-t20.3/ror1-car-t35.4/ror1-mph20-car-t23.5/ror1-sph20-car-t25.2/epcam-car-t25.9/epcam-mph20-car-t31.2/epcam-sph20-car-t28.7/e6tcr-t/45.7mph20-e6tcr-t/46.1sph20-e6tcr-t/39.8*注：采用4种核转染程序(v-024/u-014/u-010/t-010)得到的细胞，其状态均不好，t细胞转染前活力为93％，转染msln-car后，活力依次为26％、22％、37％、66％；转染msln-mph20-car后，活力依次为23％、31％、35％、71％；转染msln-sph20-car后，活力依次为10％、19％、22％、60％。选用活力最高的组别进行car阳性的检测。每隔2天对细胞进行传代处理，观察细胞状态，进行细胞计数，并更换至新鲜培养基进行培养。采用核转染方式进行car的瞬时转染实验发现，转染后细胞状态及活力均较差，扩增缓慢，因此未再使用该方式制备car-t或者其他类型细胞。慢病毒方式制备的细胞培养约8～14天后，收集细胞备用。培养过程中发现，同时表达ph20没有影响t细胞的增值及阳性率。实施例5.表达ph20的nk细胞、car-nk细胞的制备采用nk-92细胞(atcccrl-2407)进行car-nk细胞的制备。nk-92采用rpmi1640(gibco)培养基进行培养，添加10％胎牛血清(gibco)，加入终浓度为500iu/ml的白介素2(novatis)。nk细胞感染慢病毒的方法从-80℃冰箱取出含有慢病毒的重悬溶液后，迅速在37℃水浴锅中融化。在方瓶中加入含有慢病毒的重悬溶液，添加终浓度为8μg/ml的polybrene，充分混匀后，800×g离心1.5小时。离心结束后，将方瓶置于37℃5％co2培养箱中继续培养24小时。250×g离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基(rpmi1640+10％fbs+500iu/ml)重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的方瓶中。继续培养2天后，加入抗生素进行加压筛选，每隔2-3天换液。培养约10天后，对细胞进行有限稀释，接种至96孔板，0.5细胞/孔。37℃5％co2培养15～25天。表达ph20的nk-92细胞制备通过慢病毒感染并进行有限稀释的方式，分别用sph20慢病毒和mph20慢病毒感染nk-92细胞。采用400μg/ml终浓度的潮霉素进行加压筛选。待有限稀释的克隆形成后，检测克隆的透明质酸酶活性。其中sph20-nk92的克隆，检测上清中的酶活性；而mph20-nk-92则检测细胞的酶活性。选择有活性的克隆用于后续实验。表达car的nk-92细胞制备通过慢病毒感染并进行有限稀释的方式，用frp5-car慢病毒分别感染nk-92细胞、sph20-nk92细胞、mph20-nk92细胞。采用600μg/ml终浓度的g418进行加压筛选。待有限稀释的克隆形成后，分别检测克隆的透明质酸酶活性以及car阳性。通过proteinl抗体(thermo)检测car阳性率，对应的二抗为streptavidinpe和streptavidinfitc(bd)。保留car阳性的frp5-car-nk92克隆、具有酶活性的car阳性frp5-sph20-nk92克隆、具有酶活性的car阳性frp5-mph20-nk92克隆用于后续实验。实施例6.靶细胞的制备msln阳性靶细胞制备准备24孔板，接种1×105个bxpc3细胞/孔，加入完全培养基(dmem、10％fbs)，置于37℃、5％co2培养箱，过夜培养。取出1mg/ml的聚醚酰亚胺(pei，polyscience)转染试剂及msln-pcdna3.1质粒，室温解冻。取质粒dna(3.3μg)加入至165μlopti-mem培养基中，混合均匀。取pei(10.5μg)加入165μlopti-mem培养基(gibco)中，混合均匀。按1:1比例混合以上两种溶液，室温孵育20mins以形成dna/pei复合物。按100μl/well将dna/pei溶液加入种板细胞，前后左右摇晃混匀培养板，置于37℃、5％co2培养箱孵育24hr。消化各转染孔中的细胞，混合均匀后计数，按照100000个细胞/皿的比例将转染细胞接种于10cm培养皿，10ml/孔。接种后24hr，更换培养基为dmem+10％fbs+600μg/mlg418。培养皿置于37℃、5％co2培养箱继续培养。后续每2～4天更换培养基，至克隆长出，长出后的克隆混合后进行有限稀释，0.5个细胞/孔接种至96孔板。培养15～25天待克隆长出后，扩增克隆。扩增后的克隆取1×106个细胞使用facs检测表面msln分子的表达情况。通过抗人mslnpe抗体(r&d)检测car阳性率，对应的二抗为streptavidinpe和streptavidinfitc(bdbioscience)。得到表达msln的bxpc3靶细胞。表5.靶细胞及培养方法no.细胞名称细胞类型atcc细胞培养基1bxpc3胰腺癌细胞crl-1687rpmi1640+10％fbs2bxpc3-msln胰腺癌细胞/rpmi1640+10％fbs+200μg/mlg4183mda-mb-231乳腺癌细胞htb-26dmem+10％fbs4scc152头颈鳞状细胞癌细胞crl-3240dmem+10％fbs5hep3b肝癌细胞hb-8064dmem+10％fbshas2过高表达靶细胞制备通过has2的稳定转染及筛选得到ha高表达靶细胞，作为体外细胞模型，评价ph20对于免疫细胞杀伤靶细胞效果的影响。各靶细胞按照表5列出的培养基进行培养，其中培养试剂均购自gibco。取出1mg/ml的聚醚酰亚胺(pei，polyscience)转染试剂及has2-pcdna3.1-hyg质粒，室温解冻。取质粒dna(3.3μg)加入至165μlopti-mem培养基中，混合均匀。取pei(10.5μg)加入165μlopti-mem培养基中，混合均匀。按1:1比例混合以上两种溶液，室温孵育20mins以形成dna/pei复合物。按100μl/well将dna/pei溶液加入种板细胞，前后左右摇晃混匀培养板，置于37℃、5％co2培养箱孵育24hr。消化各转染孔中的细胞，混合均匀后计数，按照100000个细胞/皿的比例将转染细胞接种于10cm培养皿，10ml/孔。接种后24hr，更换培养基为细胞培养基+400μg/ml潮霉素(gibco)。培养皿置于37℃、5％co2培养箱继续培养。后续每2～4天更换培养基，至克隆长出，长出后的克隆混合后进行有限稀释，0.5个细胞/孔接种至96孔板。培养15～25天待克隆长出后，对克隆进行换液处理。换液后24hr，采用透明质酸elisa定量试剂盒(r&d)检测培养上清中的透明质酸含量。选择透明质酸分泌量高、生长良好的克隆扩增至24孔板。待满层后，按照1×105个细胞每孔接种至24孔板，每孔培养体积1ml。培养24hr后，取培养上清，依据试剂盒提供的检测方法、采用试剂盒中的稀释液稀释培养上清以检测其中的透明质酸含量，选择透明质酸分泌量高、生长良好的克隆各一株用于后续实验(表6)。表6.靶细胞透明质酸表达量实施例7表达ph20的car-t细胞具有透明质酶活性以及细胞杀伤活性慢病毒感染后第7天，取细胞检测透明质酸酶活性。针对分泌透明质酸酶的免疫细胞，取1×106个细胞接种至24孔板，培养体积1ml。培养24hr后，取上清用于酶活性检测。针对表达膜结合透明质酸酶的免疫细胞，取1×106个目的蛋白表达阳性细胞，酶活性检测缓冲液重悬细胞沉淀至1×106个细胞/ml，取细胞液用于酶活性检测。按照《中国药典》2015年版四部中的通则《1207玻璃酸酶测定法》进行car-t细胞的透明质酸酶活性检测。慢病毒感染后第7天，进行体外细胞杀伤实验。取靶细胞按照1×105细胞/ml的密度、1ml/孔接种至24孔板。car-t细胞按照1×106、3×105分别接种至含靶细胞的24孔板中。将24孔板放置于37℃、5％co2培养箱中培养16～24hr。培养结束后，取培养上清，按照cytotox非放射性细胞毒性检测试剂盒(promega)说明书的方法检测培养上清中的ldh以确认杀伤效果。表7.表达不同密码子ph20的t细胞及培养上清中的透明质酸酶活性检测注：od640nm值越高，酶活性越小；值越低，酶活性越高。对比不同核苷酸序列的ph20表达情况。针对表达膜结合透明质酸酶的免疫细胞，采用酶活性检测缓冲液将细胞密度调正未如表7所示，取细胞液用于酶活性检测。结果显示细胞密度达到1×106时，mph20-t细胞的透明质酸酶表达量高于mph20-twt(野生型密码子)。针对分泌透明质酸酶的免疫细胞，取1×106个细胞接种至24孔板，培养体积1ml。培养24hr后，取上清用于酶活性检测，以玻璃酸酶国家标准品作为标准品进行酶活性的计算。sph20-t的分泌酶活性为67±25单位/ml，sph20-twt的分泌酶活性为58±23单位/ml。以上结果显示，经优化的密码子其表达量高于野生型密码子。表8.表达ph20的car-t细胞及培养上清中的透明质酸酶活性检测注1：od640nm值越高，酶活性越小；值越低，酶活性越高。注2：#核转染的细胞，由于阳性率过低，1×106个细胞/ml的阳性细胞实际密度约为1×108个细胞/ml，这个密度的细胞对于活性检测存在干扰，结果显示偏高。注3：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。实验结果表明，在has2过表达型mda-mb-231细胞中，携带ph20的ror1-car-t细胞及加入ph20共培养的ror1-car-t细胞，其对靶细胞的杀伤效果显著好于对照ror1-car-t细胞。实施例8表达ph20的car-nk细胞具有透明质酶活性以及细胞杀伤活性取细胞检测透明质酸酶活性。针对分泌透明质酸酶的免疫细胞，取1×106个细胞接种至24孔板，培养体积1ml。培养24hr后，取上清用于酶活性检测。针对表达膜结合透明质酸酶的免疫细胞，取1×106个细胞，酶活性检测缓冲液重悬细胞沉淀至1×106个细胞/ml，取细胞液用于酶活性检测。按照《中国药典》2015年版四部中的通则《1207玻璃酸酶测定法》进行car-nk细胞的透明质酸酶活性检测。取靶细胞按照1×105细胞/ml的密度、1ml/孔接种至24孔板。car-nk细胞按照1×106、3×105分别接种至含靶细胞的24孔板中。将24孔板放置于37℃、5％co2培养箱中培养16～24hr。培养结束后，取培养上清，按照cytotox非放射性细胞毒性检测试剂盒(promega)说明书的方法检测培养上清中的ldh以确认杀伤效果。表9.表达ph20的car-nk细胞及培养上清中的透明质酸酶活性检测注1：od640nm值越高，酶活性越小；值越低，酶活性越高。注2：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。实验结果表明，表达ph20蛋白的免疫细胞在体外细胞杀伤实验中，针对野生型mda-mb-231和has2过表达的mda-mb-231细胞，携带ph20的frp5-car-nk细胞及加入ph20共培养的frp5-car-nk细胞杀伤效果均更好。实施例9表达ph20的tcr-t细胞具有透明质酶活性以及细胞杀伤活性取细胞检测透明质酸酶活性。针对分泌透明质酸酶的免疫细胞，取1×106个细胞接种至24孔板，培养体积1ml。培养24hr后，取上清用于酶活性检测。针对表达膜结合透明质酸酶的免疫细胞，取1×106个细胞，酶活性检测缓冲液重悬细胞沉淀至1×106个细胞/ml，取细胞液用于酶活性检测。按照《中国药典》2015年版四部中的通则《1207玻璃酸酶测定法》进行tcr-t细胞的透明质酸酶活性检测。慢病毒感染后第7天，进行体外细胞杀伤实验。取靶细胞按照1×105细胞/ml的密度、1ml/孔接种至24孔板。car-t细胞按照1×106、3×105分别接种至含靶细胞的24孔板中。将24孔板放置于37℃、5％co2培养箱中培养16～24hr。培养结束后，取培养上清，按照cytotox非放射性细胞毒性检测试剂盒(promega)说明书的方法检测培养上清中的ldh以确认杀伤效果。表10.表达ph20的tcr-t细胞及培养上清中的透明质酸酶活性检测注1：od640nm值越高，酶活性越小；值越低，酶活性越高。注2：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。实验结果表明，表达ph20蛋白的免疫细胞在体外细胞杀伤实验中，针对野生型scc152细胞，表现与未表达ph20的免疫细胞类似。has2过表达细胞的杀伤实验中，携带ph20的e6tcr-t细胞及加入ph20共培养的frp5-car-nk细胞杀伤效果均更好。实施例10pdx模型的筛选为了评价表达ph20的car-t细胞对高水平ha肿瘤组织的作用，建立ha高表达小鼠异种移植物肿瘤模型。采用免疫组化的方法检测pdx组织中的ha表达。小鼠的pdx组织生长至约500mm3时，取肿瘤组织，4％福尔马林固定，保存于2～8℃。常规脱水，石蜡包埋切片，片厚3μm。对切片进行脱蜡复水，依次采用二甲苯处理10分钟共两次、无水乙醇处理5分钟共两次、95％乙醇处理2分钟、85％乙醇处理2分钟、75％乙醇处理2分钟、蒸馏水洗2分钟。将切片至于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中高温热修复30分钟，自然冷却至室温。pbs冲洗三次，每次3分钟。使用3％h2o2孵育15分钟，封闭内源性过氧化物酶，随后采用pbs冲洗三次，每次3分钟。每个候选pdx组织选择4片切片，其中2片加入至含100单位/ml重组人ph20(rhinobio)的溶液中，在37℃环境下孵育2小时，得到的切片作为阴性对照。2片用ph20缓冲液(25mm哌嗪-1,4-二乙磺酸，70mm氯化钠，0.1％牛血清白蛋白，ph5.5)在37℃环境下孵育2小时。孵育完成后，使用2％山羊血清白(博士德)孵育30分钟进行封闭。将两种处理后的切片分别取一片用1μg/mlbiotin-habp(amsbio)进行孵育，4℃孵育过夜。pbs冲洗三次，每次5分钟。采用strepavidin-hrp(bdbioscience)溶液孵育30分钟。pbs冲洗三次，每次5分钟。随后采用dab显色液(thermo)进行显色。显色完成的切片进行拍照。每个候选pdx组织选择2片切片，进行抗原的染色。mesothelin蛋白采用抗人msln蛋白兔单抗(abcam)作为一抗。epcam采用抗人epcam蛋白兔单抗(abcam)作为一抗。山羊抗兔igg-hrp抗体(abcam)作为二抗。通过以上免疫组化的方法对胰腺癌病人来源的pdx样本进行msln以及ha表达水平的筛选，选择强msln以及ha染色级别的pdx样本进行小鼠的接种，最终选择的组织免疫组化结果见图2。通过以上免疫组化的方法对胃癌病人来源的pdx样本进行epcam以及ha表达水平的筛选，选择强epcam以及ha染色级别的pdx样本进行小鼠的接种，最终选择的组织免疫组化结果见图3。实施例11表达ph20的免疫细胞在胰腺癌pdx模型小鼠的体内活性复苏msln/ha高表达的胰腺癌pdx样本，接种于2～4只ncg小鼠皮下，当单个瘤体积超过500mm3时，根据实验方案进行肿瘤的大规模传代。取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。每天观察小鼠的生长情况，每周称重，确认小鼠荷瘤后，对肿瘤大小进行监测，监测频率根据实际情况确定。选择6～7周龄的ncg小鼠用pdx荷瘤接种至小鼠右侧腋窝皮下。通过测径器测量实体瘤团块的长度(l)和宽度(w)，肿瘤体积(tv)计算为：(l×w2)/2。当肿瘤的体积达到直径大约150～250mm3时，将小鼠分级成5个处理组：1)t细胞对照；2)msln-car-t细胞；3)msln-mph20-car-t细胞；4)msln-sph20-car-t细胞；5)msln-car-t细胞，ph20蛋白溶液。给药当日对小鼠的体重和肿瘤大小进行检测。对car-t细胞进行细胞计数，并根据car的阳性率计算需要给药的总细胞数量。取相应细胞数量体积的细胞进行离心，得到的细胞沉淀采用pbs(ph7.2)清洗两次。清洗后，使用pbs重悬car-t细胞，终体积为100μl，每只小鼠给药5×106阳性car-t细胞。car-t细胞采用瘤内注射方式给药一次，一周后采用相同方式再给药一次。肿瘤大小的检测频率为每周两次，药效观察周期为第二次注射后第21天，实行实验终点处理。人胰腺癌pdx模型小鼠移植瘤各实验组的不同时间的肿瘤体积如图4所示，car-t细胞/媒介对照给药28天后，组2-5均具有显著的抑瘤作用。msln-car-t细胞给药t/c值为50.4％，msln-mbph20-car-t细胞给药t/c值为7.4％，msln-sph20-car-t细胞给药t/c值为2.5％，msln-car-t细胞+ph20给药t/c值为8.9％。其中表达ph20或者和ph20共给药的car-t细胞给药效果均明显好于msln-car-t细胞。给药期间，各实验组对荷瘤鼠的体重变化无影响。各实验组小鼠状态较好，无体重下降。实施例12表达ph20的免疫细胞在胃癌pdx模型小鼠的体内活性复苏epcam/ha高表达的胃癌pdx样本，接种于2～4只ncg小鼠皮下，当单个瘤体积超过500mm3时，根据实验方案进行肿瘤的大规模传代。取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。每天观察小鼠的生长情况，每周称重，确认小鼠荷瘤后，对肿瘤大小进行监测，监测频率根据实际情况确定。选择6～7周龄的ncg小鼠用pdx荷瘤接种至小鼠右侧腋窝皮下。通过测径器测量实体瘤团块的长度(l)和宽度(w)，肿瘤体积(tv)计算为：(l×w2)/2。当肿瘤的体积达到直径大约150～250mm3时，将小鼠分级成5个处理组：1)t细胞对照；2)epcam-car-t细胞；3)epcam-mph20-car-t细胞；4)epcam-sph20-car-t细胞；5)epcam-car-t细胞，ph20蛋白溶液。给药当日对小鼠的体重和肿瘤大小进行检测。对car-t细胞进行细胞计数，并根据car的阳性率计算需要给药的总细胞数量。取相应细胞数量体积的细胞进行离心，得到的细胞沉淀采用pbs(ph7.2)清洗两次。清洗后，使用pbs重悬car-t细胞，终体积为100μl，每只小鼠给药5×106阳性car-t细胞。car-t细胞采用瘤内注射方式给药一次，一周后采用相同方式再给药一次。肿瘤大小的检测频率为每周两次，药效观察周期为第二次注射后第21天，实行实验终点处理。人胃癌pdx模型小鼠移植瘤各实验组的不同时间的肿瘤体积如图5所示，car-t细胞/媒介对照给药28天后，组2-5均具有显著的抑瘤作用。epcam-car-t细胞给药t/c值为68.7％，epcam-mph20-car-t细胞给药t/c值为0.7％，epcam-sph20-car-t细胞给药t/c值为12.0％，epcam-car-t细胞+ph20给药t/c值为11.9％。其中表达ph20或者和ph20共给药的car-t细胞给药效果均明显好于epcam-car-t细胞。给药期间，各实验组对荷瘤鼠的体重变化无影响。各实验组小鼠状态较好，无体重下降。sequencelisting<110>苏州康聚生物科技有限公司<120>一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用<130>p180117007c<150>2017113299674<151>2017-12-13<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>455<212>prt<213>homosapiens<400>1leuasnpheargalaproprovalileproasnvalpropheleutrp151015alatrpasnalaprosergluphecysleuglylyspheaspglupro202530leuaspmetserleupheserpheileglyserproargileasnala354045thrglyglnglyvalthrilephetyrvalaspargleuglytyrtyr505560protyrileaspserilethrglyvalthrvalasnglyglyilepro65707580glnlysileserleuglnasphisleuasplysalalyslysaspile859095thrphetyrmetprovalaspasnleuglymetalavalileasptrp100105110gluglutrpargprothrtrpalaargasntrplysprolysaspval115120125tyrlysasnargserilegluleuvalglnglnglnasnvalglnleu130135140serleuthrglualathrglulysalalysglnglupheglulysala145150155160glylysasppheleuvalgluthrilelysleuglylysleuleuarg165170175proasnhisleutrpglytyrtyrleupheproaspcystyrasnhis180185190histyrlyslysproglytyrasnglysercyspheasnvalgluile195200205lysargasnaspaspleusertrpleutrpasngluserthralaleu210215220tyrproseriletyrleuasnthrglnglnserprovalalaalathr225230235240leutyrvalargasnargvalargglualaileargvalserlysile245250255proaspalalysserproleuprovalphealatyrthrargileval260265270phethraspglnvalleulyspheleuserglnaspgluleuvaltyr275280285thrpheglygluthrvalalaleuglyalaserglyilevaliletrp290295300glythrleuserilemetargsermetlyssercysleuleuleuasp305310315320asntyrmetgluthrileleuasnprotyrileileasnvalthrleu325330335alaalalysmetcysserglnvalleucysglngluglnglyvalcys340345350ilearglysasntrpasnserserasptyrleuhisleuasnproasp355360365asnphealaileglnleuglulysglyglylysphethrvalarggly370375380lysprothrleugluaspleugluglnpheserglulysphetyrcys385390395400sercystyrserthrleusercyslysglulysalaaspvallysasp405410415thraspalavalaspvalcysilealaaspglyvalcysileaspala420425430pheleulysproprometgluthrglugluproglnilephetyrasn435440445alaserproserthrleuser450455<210>2<211>1365<212>dna<213>homosapiens<400>2ctgaatttcagagcacctcctgttattccaaatgtgcctttcctctgggcctggaatgcc60ccaagtgaattttgtcttggaaaatttgatgagccactagatatgagcctcttctctttc120ataggaagcccccgaataaacgccaccgggcaaggtgttacaatattttatgttgataga180cttggctactatccttacatagattcaatcacaggagtaactgtgaatggaggaatcccc240cagaagatttccttacaagaccatctggacaaagctaagaaagacattacattttatatg300ccagtagacaatttgggaatggctgttattgactgggaagaatggagacccacttgggca360agaaactggaaacctaaagatgtttacaagaataggtctattgaattggttcagcaacaa420aatgtacaacttagtctcacagaggccactgagaaagcaaaacaagaatttgaaaaggca480gggaaggatttcctggtagagactataaaattgggaaaattacttcggccaaatcacttg540tggggttattatctttttccggattgttacaaccatcactataagaaacccggttacaat600ggaagttgcttcaatgtagaaataaaaagaaatgatgatctcagctggttgtggaatgaa660agcactgctctttacccatccatttatttgaacactcagcagtctcctgtagctgctaca720ctctatgtgcgcaatcgagttcgggaagccatcagagtttccaaaatacctgatgcaaaa780agtccacttccggtttttgcatatacccgcatagtttttactgatcaagttttgaaattc840ctttctcaagatgaacttgtgtatacatttggcgaaactgttgctctgggtgcttctgga900attgtaatatggggaaccctcagtataatgcgaagtatgaaatcttgcttgctcctagac960aattacatggagactatactgaatccttacataatcaacgtcacactagcagccaaaatg1020tgtagccaagtgctttgccaggagcaaggagtgtgtataaggaaaaactggaattcaagt1080gactatcttcacctcaacccagataattttgctattcaacttgagaaaggtggaaagttc1140acagtacgtggaaaaccgacacttgaagacctggagcaattttctgaaaaattttattgc1200agctgttatagcaccttgagttgtaaggagaaagctgatgtaaaagacactgatgctgtt1260gatgtgtgtattgctgatggtgtctgtatagatgcttttctaaaacctcccatggagaca1320gaagaacctcaaattttctacaatgcttcaccctccacactatct1365<210>3<211>1365<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ph20（优化后）<400>3ctgaacttcagagccccccctgtgatccccaacgtgcctttcctgtgggcctggaatgcc60ccaagcgagttctgcctgggcaagtttgacgagcccctggatatgtctctgttcagcttt120atcggctcccccagaatcaatgccaccggccagggcgtgacaatcttttacgtggacagg180ctgggctactatccttatatcgattccatcaccggcgtgacagtgaacggcggcatccca240cagaagatcagcctgcaggaccacctggataaggccaagaaggatatcaccttctacatg300cccgtggacaatctgggcatggccgtgatcgattgggaggagtggcgcccaacatgggcc360agaaactggaagcccaaggacgtgtataagaatcgctctatcgagctggtgcagcagcag420aacgtgcagctgagcctgaccgaggccacagagaaggccaagcaggagttcgagaaggcc480ggcaaggactttctggtggagaccatcaagctgggcaagctgctgagacccaaccacctg540tggggctactatctgtttcctgattgctacaatcaccactataagaagccaggctacaac600ggctcttgtttcaatgtggagatcaagaggaacgacgatctgagctggctgtggaatgag660tccacagccctgtacccctctatctatctgaacacccagcagtcccctgtggccgccaca720ctgtatgtgcggaatagagtgagggaggccatccgcgtgagcaagatccctgacgccaag780tcccctctgccagtgttcgcctacacccggatcgtgtttacagaccaggtgctgaagttc840ctgagccaggatgagctggtgtataccttcggcgagacagtggccctgggcgccagcgga900atcgtgatctggggcaccctgtccatcatgcggtccatgaagtcttgcctgctgctggat960aactacatggagaccatcctgaacccctatatcatcaatgtgacactggccgccaagatg1020tgcagccaggtgctgtgccaggagcagggcgtgtgcatccgcaagaactggaacagcagc1080gattacctgcacctgaaccccgacaattttgccatccagctggagaagggcggcaagttc1140accgtgcggggcaagcctacactggaggacctggagcagttctccgagaagttttactgc1200agctgttattccaccctgtcttgtaaggagaaggccgatgtgaaggacacagatgccgtg1260gacgtgtgcatcgccgatggcgtgtgcatcgacgcctttctgaagccacccatggagacc1320gaggagcctcagattttctacaatgccagcccatccaccctgtct1365<210>4<211>711<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ror1scfv<400>4caggtacagctgaaggagagcggtcccggcctggtggccccctctcagaccctgagcata60acctgcaccgtgagcggattcagcctgaccagctacggggtgcactgggtgaggcagcct120cccggcaagggcctggagtggctgggcgtgatctgggccggtggcttcaccaactacaac180agcgccctgaagtctcgactgtcaatctcaaaggacaattctaagagccaggtgctgctc240aaaatgacatcattgcagaccgacgacaccgccatgtactactgcgccaggaggggcagc300tcctacagcatggactactggggccagggcacaagcgtgacggtgtcatcaggaggcggt360gggagtgggggaggagggagcggtggcggaggcagtgagatcgtgctgtctcagagcccc420gcaattactgccgccagcctgggccaaaaagtgaccataacatgcagcgccagtagcaac480gtaagctacatccactggtatcaacaaaggagcggaaccagccctaggccctggatctac540gagatcagcaagctggcctctggcgtgcccgtgaggtttagcggctcaggcagcggcact600tcttacagcttgacaatcagcagtatggaggccgaggacgccgccatctattattgccag660cagtggaactaccccctgatcaccttcggctctgggaccaagttggagatc711<210>5<211>729<212>dna<213>artificialsequence<220><223>gpc3scfv<400>5gacgtggtgatgacccagagcccactgtctctgcccgtgacccccggagagcccgccagc60atctcctgtaggagtagtcagagccttgtacacagcaacgccaacacctacctgcattgg120tatctgcaaaagcccggtcaaagcccacagctcctgatctacaaggtgagcaacaggttt180tcaggcgtgccggatcggttcagtgggtctgggagcggcaccgacttcaccctgaagatc240agcagggtcgaggccgaggacgtgggcgtgtactattgctctcagaacacccacgtgccc300cccaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagagggggggaggaggtagcgggggt360ggaggcagcggcggtggcggtagccaggtgcaactggtccagtccggcgcagaggtgaag420aaaccaggcgccagcgtgaaggtcagctgcaaggcaagcggctacacctttaccgattac480gagatgcactgggtgaggcaggcaccgggacagggcctggagtggatgggagcccttgat540cccaagaccggggacacggcatacagccagaagttcaaaggtcgagtgaccctgaccgcc600gacgagagcaccagcacggcctacatggagctgagcagcctgaggagcgaggacaccg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