一类聚集诱导发光型荧光材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医学用荧光材料技术领域，具体涉及一类具有聚集诱导发光性质的荧光材料，以及该荧光材料的制备方法和在标记脂滴中的应用。

背景技术：

荧光材料由于在光电器件、环境传感器、生物科学等领域具有重大的应用价值，近年来引起了科学家们的极大关注。荧光检测不仅具有很高的灵敏度，而且克服了在生物化学试验上需要昂贵和操作难的放射性追踪试剂的一系列问题。随着荧光在细胞和分子成像方面的应用研究增加，荧光成像揭示了对细胞内分子的定位和测量，并且有时会实现单个分子水平的检测。目前，有很多关于线粒体生物成像的文献报道，生物成像的研究也吸引了科研工作者的兴趣，但是传统的荧光材料在高浓度时易荧光猝灭且固体量子产率低。随着高发射效率、强的耐光性、良好生物相容性的聚集诱导发光(aie)荧光材料的发展，大量的aie荧光材料被用于生物成像。而脂滴(lds)作为动态复合细胞器，参与各种生理过程，其数量和活性与许多疾病甚至癌症有关，因此lds的定位和浓度监测对于科学的生物研究和保健非常重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一类具有聚集诱导发光性能的荧光材料，并为该荧光材料提供一种制备方法和应用。

针对上述目的，本发明所采用的荧光材料的结构通式如下所示：

式中r代表氢或连在苯环上的1～5个氟原子，r1代表c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、n,n-二烷基中的任意一种，r2代表氢、c1～c4烷氧基、c1～c4烷基中的任意一种；优选r代表氢或连接在苯环上的5个氟原子，r1代表甲基、甲氧基、n,n-二甲基、n,n-二乙基中任意一种，r2代表氢或甲氧基。

上述聚集诱导发光型荧光材料的制备方法如下：

1、以乙醇为溶剂，将化合物i和苯磺酰肼在室温下搅拌反应至完全，分离纯化，得到化合物ii。

2、将化合物ii、式iii所示苯胺衍生物、亚硝酸钠、浓盐酸在冰浴条件下反应0.5～2h后，撤去冰浴反应继续反应8～12h，得到化合物iv。

3、以乙酸乙酯为溶剂，将化合物iv与化合物v在光照条件下反应3～6h，分离纯化，得到聚集诱导发光型荧光材料。

上述步骤1中，优选化合物i与苯磺酰肼的摩尔比为1:1～2。

上述步骤2中，优选化合物ii与苯胺衍生物、亚硝酸钠、hcl的摩尔比为1:1～2:1～2:5～10。

上述步骤3中，优选化合物iv与化合物v的摩尔比为1:10～100。

本发明聚集诱导发光型荧光材料作为染料在标记脂滴中的应用，具体使用方法与现有脂滴标记的方法相同。

本发明以苯甲醛类衍生物、苯磺酰肼和苯胺类重氮盐为原料反应得到四唑，四唑再与烯烃类化合物光照开环，合成了一系列具有聚集诱导发光性的荧光材料。并且部分化合物可以响应缓冲液ph值。这些化合物都具有很好的细胞相容性，可以选择性地在活细胞中积聚和照亮lds，并具有卓越的分辨率和高对比度。它们在光稳定性方面与商用lds探针有相似的稳定性。结合高lds特异性，良好生物相容性，超高的光稳定性和低制备成本的优点，本发明化合物可成为研究与lds相关细胞内活性的有力工具，例如基于lds的病理学和药理学。

附图说明

图1是实施例1制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的荧光发射光谱图。

图2是实施例1制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的相对荧光强度图。

图3是实施例2制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的荧光发射光谱图。

图4是实施例2制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的相对荧光强度图。

图5是实施例3制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的荧光发射光谱图。

图6是实施例3制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的相对荧光强度图。

图7是实施例4制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的荧光发射光谱图。

图8是实施例4制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的相对荧光强度图。

图9是实施例5制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的荧光发射光谱图。

图10是实施例5制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的相对荧光强度图。

图11是实施例6制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的荧光发射光谱图。

图12是实施例6制备的荧光材料在乙腈与水混合体系中的相对荧光强度图。

图13是实施例2制备的荧光材料的细胞毒性。

图14是实施例5制备的荧光材料的细胞毒性。

图15是实施例6制备的荧光材料的细胞毒性。

图16是实施例2制备的荧光材料的细胞成像图。

图17是实施例2制备的荧光材料的细胞免洗成像图。

图18是商业bodipy的细胞免洗成像图。

图19是实施例2制备的荧光材料标记脂滴随时间的细胞成像图。

图20是实施例2制备的荧光材料粉末的酸碱响应图。

图21是实施例2制备的荧光材料粉末的酸碱响应循环图。

图22是实施例2制备的荧光材料聚集态溶液的发射波长随ph变化的曲线图。

图23是实施例2制备的荧光材料聚集态溶液的发射波长随ph变化的折线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、将3.27g(19mmol)苯磺酰肼溶于10ml无水乙醇中，然后滴加3.10g(16mmol)2,3,4,5,6-氟苯甲醛(化合物i-1)，室温搅拌3h，有固体析出，过滤得到化合物ii-1。

2、在冰浴条件下，将0.52g(2.6mmol)n,n-二乙基对苯二胺盐酸盐(化合物iii-1)加入圆底烧瓶中，用乙醇和水将其悬浮，再加入1.1ml(13mmol)浓盐酸，搅拌5min后，加入0.23g(3.38mmol)溶于1ml水的亚硝酸钠，冰浴反应30mim；然后滴加到9ml含0.70g(2mmol)化合物ii-1的吡啶溶液中，撤去冰浴，室温反应10h，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝100:1～50:1)得到化合物iv-1。

3、将38.3mg(0.1mmol)iv-1与115ul(1mmol)苯乙烯(化合物v-1)在365nm光照条件下反应6h，反应完后减压浓缩，浓缩产物经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝10:1～5:1)，得到式vi-1所示的聚集诱导发光型荧光材料，其产率为80％。

所得荧光材料的结构表征数据为：¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.39-7.27(m,5h),6.96(d,j＝9.0hz,2h),6.60(d,j＝8.9hz,2h),5.19(dd,j＝12.3,9.0hz,1h),3.92-3.74(m,1h),3.32-3.10(m,5h),1.07(t,j＝7.0hz,6h).

实施例2

合成式vi-2所示的聚集诱导发光型荧光材料

本实施例的步骤3中，用等摩尔量的对甲氧基苯乙烯替换实施例1中的苯乙烯，其他步骤与实施例1相同，得到式vi-2所示的聚集诱导发光型荧光材料，其产率为84％，结构表征数据为：¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.24(s,2h),6.92(dd,j＝25.3,8.8hz,4h),6.60(d,j＝8.9hz,2h),5.14(dd,j＝12.2,9.0hz,1h),3.82(d,j＝17.8hz,4h),3.31-3.03(m,5h),1.08(t,j＝7.0hz,6h).

实施例3

合成式vi-3所示的聚集诱导发光型荧光材料

本实施例的步骤2中，用等摩尔量的n,n-二甲基对苯二胺盐酸盐替换实施例1中的n,n-二乙基对苯二胺盐酸盐，其他步骤与实施例1相同，得到式vi-3所示的聚集诱导发光型荧光材料，其产率80％，结构表征数据为：¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.37-7.30(m,4h),7.30-7.26(m,1h),6.98(d,j＝8.8hz,2h),6.66(d,j＝8.5hz,2h),5.25-5.17(m,1h),3.92-3.82(m,1h),3.21(dd,j＝17.3,8.4hz,1h),2.83(s,6h).

实施例4

合成式vi-4所示的聚集诱导发光型荧光材料

本实施例的步骤3中，用等摩尔量的对甲氧基苯乙烯替换实施例3中的苯乙烯，其他步骤与实施例3相同，得到式vi-4所示的聚集诱导发光型荧光材料，其产率为82％，结构表征数据为：¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.23(s,2h),6.99(d,j＝8.5hz,2h),6.87(d,j＝8.6hz,2h),6.66(d,j＝7.8hz,2h),5.17(s,1h),3.79(s,4h),3.30-3.09(m,1h),2.84(s,6h).

实施例5

合成式vi-5所示的的聚集诱导发光型荧光材料

本实施例的步骤2中，用等摩尔量的对甲苯胺替换实施例1中的n,n-二乙基对苯二胺盐酸盐，其他步骤与实施例1相同，得到式vi-5所示的聚集诱导发光型荧光材料，其产率为85％，结构表征数据为：¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.36-7.27(m,3h),7.25-7.18(m,2h),7.00-6.84(m,4h),5.24(dd,j＝12.6,7.6hz,1h),3.85(dd,j＝17.6,12.6hz,1h),3.17(dd,j＝17.6,7.6hz,1h),2.19(s,3h).

实施例6

合成式vi-6所示的的聚集诱导发光型荧光材料

本实施例的步骤2中，用等摩尔量的对甲氧基苯胺替换实施例1中的n,n-二乙基对苯二胺盐酸盐，其他步骤与实施例1相同，得到式vi-6所示的聚集诱导发光型荧光材料，其产率为90％，结构表征数据为：¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.22(d,j＝8.7hz,2h),7.04-6.95(m,2h),6.87(d,j＝8.7hz,2h),6.81-6.70(m,2h),5.19(dd,j＝12.3,8.2hz,1h),3.92-3.82(m,1h),3.79(s,3h),3.73(s,3h),3.20(dd,j＝17.5,8.3hz,1h).

发明人对上述实施例1～6制备的荧光材料进行了聚集诱导发光性能测试，具体测试方法为：配制含水量分别为0％、10％、30％、50％、70％、90％、95％、99％的乙腈水溶液，将荧光材料加入所得溶液中，得到浓度为1×10^-5mol/l的荧光材料溶液，采用日立f-7000荧光分光光度计测试荧光材料的聚集诱导发光性质，结果见图1～12。由图可见，本发明实施例1～6得到的荧光材料均具有聚集诱导发光性质。

实施例7

本发明聚集诱导发光型荧光材料作为染料在标记脂滴中的应用

1、细胞毒性实验

采用mtt法分别检测实施例2、5、6制备的荧光材料的细胞毒性，评估生物相容性。将hela细胞以1×10⁴个细胞/ml每孔的密度接种于96孔培养板中，培养48h。待细胞贴壁并长满96孔板之后，除去细胞培养液，加入含有不同浓度荧光材料(0、0.1、0.2、0.5、1、5和10μmol/l)的dmem溶液100μl，在37℃的细胞培养箱中孵化培养12h，然后给每孔加入10μlmtt培养液，继续孵化培养4h，待4h过后，给每孔加入100μl甲臜溶解液，紧接着在振荡器上匀速振荡10min并继续在培养箱中孵化培养4h，最后在酶标仪上测定570nm下的紫外吸收，每组实验重复7组。同时以含有dmso的pbs溶液为培养基作对照，其细胞毒性如图13～15所示。由图13～15的细胞毒性结果可以得知，细胞的存活率均在90％以上，表明本发明荧光材料均具有良好的生物相容性。

2、细胞成像实验

(1)共染

使用hela细胞进行测试，用胰酶消化对数期生长的hella细胞，经5min离心之后，移除上层清液，加入新鲜的dmem不完全高糖培养液1.0ml，制成单细胞悬浮液，并计数以1×10⁴个细胞/mldmem不完全高糖培养液2.0ml接种于35mm培养皿上，培养48h，并在一定时间段观察细胞形态。待细胞可用于细胞成像时，用pbs缓冲溶液洗去漂浮的细胞，并分别加入配制好的500nmol/l实施例2制备的荧光材料的dmem溶液，在37℃的细胞培养箱中孵化培养30min，然后小心移走培养液，并用pbs缓冲溶液洗两次之后，加入配制好的500nmol/lbodipy/nilered溶液，在37℃细胞培养箱中孵化培养30min。待样品培养之后，小心移走培养液，用pbs缓冲溶液洗三次，并加入不含酚红的dmem溶液，在奥林巴斯荧光共聚焦显微镜下进行细胞成像，结果见图16，图中a为实施例2荧光材料对脂滴成像，b为商业染料bodipy对细胞脂滴成像，d为细胞明场成像，c为图像a、图像b重合后的叠加图。由图16可以清楚的看出，实施例2制备的荧光材料与商业染料bodipy的重合度很高，说明实施例2制备的荧光材料对脂滴具有特异性标记功能，而且实现了对脂滴标记的免洗和快速染色。

(2)免洗

使用hela细胞进行测试，用胰酶消化对数期生长的hella细胞，经5min离心之后，移除上层清液，加入新鲜的dmem不完全高糖培养液1.0ml，制成单细胞悬浮液，并计数以1×10⁴个细胞/mldmem不完全高糖培养液2.0ml接种于35mm培养皿上，培养48h，并在一定时间段观察细胞形态。待细胞可用于细胞成像时，用pbs缓冲溶液洗去漂浮的细胞，一盘细胞加入配制好的500nmol/l实施例2制备的荧光材料，在37℃的细胞培养箱中孵化培养30min，不需要洗直接在奥林巴斯荧光共聚焦显微镜下进行细胞成像，结果见图17，图中a为实施例2荧光材料对脂滴成像，c为细胞明场成像，b为图像a、图像c重合后的叠加图。另一盘细胞加入配制好的500nmol/l的商业染料bodipy的不含酚红的dmem溶液，在37℃的细胞培养箱中孵化培养30min，不需要洗直接在奥林巴斯荧光共聚焦显微镜下进行细胞成像，结果见图18，图中a为商业染料bodipy对细胞脂滴成像，c为细胞明场成像，b为图像a、图像c重合后的叠加图。

由图17和18可以看出，实施例2制备的荧光材料可以实现对细胞脂滴染色的免洗，而商业染料bodipy对细胞脂滴染色不洗会存在背景，无法实现对细胞脂滴染色的免洗。

(3)快速染色

使用hela细胞进行测试，用胰酶消化对数期生长的hella细胞，经5min离心之后，移除上层清液，加入新鲜的dmem不完全高糖培养液1.0ml，制成单细胞悬浮液，并计数以1×10⁴个细胞/mldmem不完全高糖培养液2.0ml接种于35mm培养皿上，培养48h，并在一定时间段观察细胞形态。待细胞可用于细胞成像时，用pbs缓冲溶液洗去漂浮的细胞，并分别加入配制好的500nmol/l实施例2制备的荧光材料的不含酚红的dmem溶液，在奥林巴斯荧光共聚焦显微镜下随时间进行细胞成像，结果见图19。由图19可以看出，本发明实施例2制备的荧光材料可以实现随时间对细胞脂滴进行染色，在染色时间为15min时，就可实验对细胞脂滴高分辨率、高对比度的染色。

3、酸碱响应

将实施例2制备的荧光材料的粉末与hcl气体接触5min后，其发射峰的位置会蓝移到460nm左右。再用nh3气体进行了5min的熏蒸后，样品则变成了其最初的橙红色的发射颜色，其发射峰出现在562nm处(见图20)。而且在经过hcl-nh3多次处理后，波长变化范围不大，重复性较好，有很好的循环性(见图21)。

将实施例2制备的荧光材料加入不同ph的b-rbuffer中，使其浓度为1×10^-5mol/l，且为聚集态(即含水量99％)。由图22和23可见，在酸性条件下，溶液的发射位置均在460nm左右，当溶液ph大于等于7后，溶液的发射位置红移到560nm左右。该过程也说明本发明荧光材料对酸碱存在很好地响应。