一种曲尼司特共结晶体、制备方法及应用与流程

本发明属于制药领域，涉及一种新的曲尼司特共结晶体。本发明还涉及该共结晶体的制备方法和应用。

背景技术：

曲尼司特(tranilast，tl)化学名为n-(3’,4’-二甲氧基肉桂酰)氨茴酸，1982年由kissei药品工业株式会社(日本)研发上市，是一种抗变态反应药物，其化学结构式如式2所示。

曲尼司特的作用机理是抑制肥大细胞和嗜碱细胞释放化学介质，阻止细胞裂解脱颗粒，从而抑制组胺、5-羟色胺等过敏介质释放。临床上主要预防和治疗过敏性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎和荨麻疹等。市售剂型主要有片剂、胶囊等口服制剂以及经皮制剂。《中国药典》2010版收录了曲尼司特的片剂和胶囊制剂，现今日本已生产出治疗过敏性结膜炎的外用滴眼剂。曲尼司特口服方便、疗效显著、副作用相对较小，占有一定的市场份额。

曲尼司特具有很好的治疗效果，但其溶解度较小，水中溶解度大约为14.5μg/ml，在ph1.2hcl溶液中的溶解度为0.7μg/ml，导致曲尼司特每日服药量较大，为300mg/天。除此之外，曲尼司特结构中存在对光不稳定的肉桂酰胺基团，在暴露于光时转变成顺式异构体和二聚体形式，从而导致生物利用度降低。

目前，一些科研工作者试图改善曲尼司特的溶解性和光不稳定性，并且取得了一些成果。kawabata等制备出曲尼司特的固体分散体，其溶解度和光稳定性均优于曲尼司特原料本身(europeanjournalofpharmaceuticalsciences.2010,39:256-262)。hori等将紫外吸收剂添加到曲尼司特凝胶剂中用来提高光稳定性，也达到了预期的效果(chemical&pharmaceuticalbulletin.1999,47:1713-1716)。

近年来，国内外对药物多晶型和药物共晶的研究迅猛发展，从2009年起，连续四年召开中国晶型药物研发技术学术研讨会，为晶型药物在国内的发展奠定了基础。晶型药物作为一门交叉学科，对改善药物性质，提高药物生物利用度方面具有重要的研究意义，具有广泛的应用前景。

共晶，是指药物活性成分(activepharmaceuticalingredient，api)与一个或多个共晶配体(cocrystalformer，ccf)通过氢键、范德华作用力、π-π堆积、卤键等非共价键作用连接成的固定化学计量比的多组分物质。

通过形成api共结晶体，可能可以实现特定api的更理想性质。api的共结晶体是api和共晶配体形成的独特化学组合物，并且当与api和共晶配体的性质单独比较时，其一般具有不同的结晶和光谱性质。除了其他技术之外，结晶形式和光谱性质通常通过x射线粉末衍射(xrpd)和单晶x衍射晶体学来测量。共结晶体通常也表现不同的热行为。热行为通过如毛细管熔点、热重分析(tga)和差分扫描量热法(dsc)这样的技术在实验室中测定。作为结晶形式，共结晶体可具有更有利的固体形式、物理、化学、药物和/或药理学性质。

在晶型制备过程中，使用不同的方法或者改变制备条件，可能会得到不同的晶型状态。药物多晶型和共晶的制备方法有很多，如溶剂法，共沉淀法，混悬法、升华法、熔融法以及球磨法等。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种曲尼司特共结晶体、制备方法及应用。本发明提出了一种的新方法，以改善曲尼司特溶解性和/或光稳定性，即将曲尼司特制备成药物共晶。当与曲尼司特原型药相比时，本发明的新曲尼司特共结晶体具有其它有益的性质如提高的溶解度、改善的溶出度和/或增加的生物利用度。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种曲尼司特共结晶体，该共结晶体的通式如式1所示；

其中-r1为苯基、2-哌啶基、2-甲基-3-吡啶基的一种。

该共结晶体为曲尼司特与酰胺类化合物(r1-conh2)形成的共结晶体；该共结晶体选自曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺或曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体。

前述的曲尼司特共结晶体的制备方法，包括下列步骤：

(1)称定等摩尔比的曲尼司特与酰胺类化合物r1-conh2，置于试管中；

(2)移取有机溶剂至试管内，加塞密封，超声处理：频率40khz，温度30℃，时间30min；

(3)再置于室温条件下搅拌12h-18h；

(4)将混悬液过滤，滤饼部分真空干燥，得曲尼司特共结晶体粉末；

(5)滤液置于室温下挥发有机溶剂培养单晶，直至得到无色透明柱状晶体；

(6)使用单晶x射线衍射仪测定。

酰胺类化合物r1-conh2选自苯甲酰胺，2-哌啶甲酰胺或2-甲基烟酰胺，优选苯甲酰胺。所述的有机溶剂是丙酮，甲醇或乙醇，优选丙酮。

其中，一种曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，具有选自11.24、12.64、13.06、16.26、18.65、21.01、22.51°2θ±0.2°2θ的至少三个峰的粉末x射线衍射图案；或具有与图1基本类似的粉末x射线衍射图案。

一种曲尼司特2-哌啶甲酰胺共结晶体，具有选自8.70、8.94、14.75、22.67、23.00、28.16、28.46°2θ±0.2°2θ的至少三个峰的粉末x射线衍射图案；或具有与图2基本类似的粉末x射线衍射图案。

一种曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体，具有选自9.87、16.01、18.37、20.91、26.17°2θ±0.2°2θ的至少三个峰的粉末x射线衍射图案；或具有与图3基本类似的粉末x射线衍射图案。

本发明还提供曲尼司特共结晶体在制备具有提高的光稳定性和溶解性及生物利用度的曲尼司特药物中的应用。

此外，本发明还提供曲尼司特共结晶体在提高曲尼司特原料药抗纤维化作用方面的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果：本发明公开了一种新的曲尼司特共结晶体的合成方法和应用。该共结晶体为曲尼司特与酰胺类化合物(r1-conh2)形成的共结晶体。该共结晶体与曲尼司特原形药相比，光稳定性更高，且溶解度提高，并具有更高的口服生物利用度。此外，曲尼司特苯甲酰胺共结晶体可以提高曲尼司特原有的抗纤维化作用。该共结晶体制备方法简单，适合工业化生产。

附图说明

图1为曲尼司特苯甲酰胺共结晶体的xrpd图；

图2为曲尼司特2-哌啶甲酰胺共结晶体的xrpd图；

图3为曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体的xrpd图；

图4为曲尼司特原料药，曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺和曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体分别加入到ph1.2盐酸溶液中的溶解度曲线图；

图5为曲尼司特原料药，曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺和曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体分别加入到ph4.5醋酸盐缓冲液中的溶解度曲线图；

图6为曲尼司特原料药，曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺和曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体分别加入到ph6.8磷酸盐缓冲溶液中的溶解度曲线图；

图7为曲尼司特原料药，曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺和曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体分别加入到纯化水中的溶解度曲线图；

图8为溶解在溶液中时曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺和曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体的光稳定性示意图；

图9为体内生物利用度研究的血药浓度-时间曲线图；

图10为adr肾纤维化大鼠模型的大鼠尿蛋白量图；

图11为肾小管间质纤维化评分结果；

图12为肾小球硬化指数评分结果。

具体实施方式

下面通过实施例说明本发明，这些实施例并不意味着对本发明的限制。

实施例1曲尼司特苯甲酰胺共结晶体

1.1曲尼司特苯甲酰胺共结晶体的制备

称定327mg曲尼司特与121mg尿素，以等摩尔比置于试管中，移取3ml

丙酮溶剂至试管内，加塞密封，超声处理(频率40khz，温度30℃)30min。

再置于室温条件下搅拌15h。将混悬液过滤，滤饼部分真空干燥12h，得曲尼司特苯甲酰胺共结晶体的粉末。滤液置于室温下挥发溶剂培养单晶，1天后得到无色透明柱状晶体。使用单晶x射线衍射仪测定。

1.2曲尼司特苯甲酰胺共结晶体的xrpd表征

曲尼司特苯甲酰胺共结晶体的xrpd图如图1所示。与曲尼司特原料药和苯甲酰胺对比，特征峰发生明显的改变，可以证明有新相生成。用mercury软件模拟出的曲尼司特苯甲酰胺共结晶体图与实测图相符合，证明制备的共晶体纯度较高。

表1衍射特征峰位、d值以及峰强度

表1中列出了衍射特征峰位、d值以及峰强度。除了通过与图1基本类似的xrpd图案，峰的整个列表或者其子集可足以表征共结晶体。例如，本发明的曲尼司特苯甲酰胺共结晶体可表征为具有选自11.24、12.64、13.06、16.26、18.65、21.01、22.51°2θ±0.2°2θ的至少三个峰的粉末x衍射图案。

实施例2曲尼司特2-哌啶甲酰胺共结晶体

2.1曲尼司特2-哌啶甲酰胺共结晶体的制备

实验步骤与曲尼司特苯甲酰胺共结晶体相似，将128mg2-哌啶甲酰胺替代苯甲酰胺。

2.2曲尼司特2-哌啶甲酰胺共结晶体的xrpd表征

曲尼司特2-哌啶甲酰胺共结晶体的xrpd图如图2所示。与曲尼司特原料药和2-哌啶甲酰胺对比，特征峰发生明显的改变，可以证明有新相生成。用mercury软件模拟出的曲尼司特2-哌啶甲酰胺共结晶体图与实测图相符合，证明制备的共结晶体纯度较高。

表2衍射特征峰位、d值以及峰强度

表2中列出了衍射特征峰位、d值以及峰强度。除了通过与图2基本类似的xrpd图案，峰的整个列表或者其子集可足以表征共结晶体。例如，本发明的曲尼司特2-哌啶甲酰胺共结晶体可表征为具有选自8.70、8.94、14.75、22.67、23.00、28.16、28.46°2θ±0.2°2θ的至少三个峰的粉末x衍射图案。

实施例3曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体

3.1曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体的制备

实验步骤与曲尼司特苯甲酰胺共结晶体相似，将136mg2-甲基烟酰胺替代苯甲酰胺。

3.2曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体的xrpd表征

曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体的xrpd图如图3所示。与曲尼司特原料药和2-甲基烟酰胺对比，特征峰发生明显的改变，可以证明有新相生成。用mercury软件模拟出的曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体图与实测图相符合，证明制备的共结晶体纯度较高。

表3衍射特征峰位、d值以及峰强度

表3中列出了衍射特征峰位、d值以及峰强度。除了通过与图3基本类似的xrpd图案，峰的整个列表或者其子集可足以表征共结晶体。例如，本发明的曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体可表征为具有选自9.87、16.01、18.37、20.91、26.17°2θ±0.2°2θ的至少三个峰的粉末x衍射图案。

实施例4粉末溶解度研究

分别称定曲尼司特原料药，曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺和曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体50mg分别加入到50mlph1.2盐酸溶液、ph4.5醋酸盐缓冲液、ph6.8磷酸盐缓冲溶液以及纯化水中，在37℃水浴中以100rpm的速率搅拌，每隔5，15，30，45，60，90，120min取样，样品通过0.45μm尼龙滤头过滤后，稀释到适当体积，使用紫外分光光度仪检测。研究结果如图4(ph1.2)、图5(ph4.5)、图6(ph6.8)和图7(水)所示。

从图中可见在四种溶出介质中，曲尼司特共结晶体的最大溶解度和溶解速率对比曲尼司特原料药均有一定程度的改善，其中曲尼司特苯甲酰胺共结晶体溶解度与溶出速率改善最大。在ph6.8磷酸盐缓冲液中，曲尼司特苯甲酰胺共结晶体在45min即达到溶出平台；在ph1.2盐酸、ph4.5醋酸盐缓冲液和水中，结晶曲尼司特几乎没有溶出，而制成曲尼司特苯甲酰胺共结晶体后，两小时的溶出度分别提高至41％、66％和55％。

实施例5固态光稳定性研究

众所周知，纯结晶曲尼司特在固体形式中是光稳定的，因此，进行研究以确定曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺和曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体的固态光稳定性，并比较其与纯结晶曲尼司特的固态光稳定性。分别将纯结晶曲尼司特与三个共结晶形式称重并分散在透明玻璃小瓶的底部表面。将小瓶放入vindon科学耐光柜中，并且用uv光照射，平均klux＝18.2lux/小时，平均uv值＝2.55瓦特/分钟，温度＝31.0-32.0℃。在每个样品中剩余的曲尼司特百分比使用hplc在3、24和48小时测定。色谱条件如下：高效液相色谱(lc-20a，日本shimadzu公司)，配以二极管阵列检测器，在333nm的波长下检测。以inertsilods-3c18(5m×4.6mm×150mm)为色谱柱。流动相为甲醇：0.3％甲酸(75:25)，流速1.0ml/min，进样量为10μl；

本研究的结果如表4所示。从表4可以看出，在固态中，共结晶体在这些条件下全部是光稳定的，没有任何光降解的指示。研究表明，曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺和曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体都具有与纯结晶曲尼司特相似的固态中的光稳定性。

表4固态光稳定性

实施例6溶液光稳定性研究

一旦溶于溶液中，结晶曲尼司特是光学不稳定的。本研究探索了当溶解在溶液中时曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺和曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体的光稳定性，并比较这些共结晶体与结晶曲尼司特的溶液光稳定性。结晶曲尼司特和三个共结晶体的样品各称重到透明的玻璃小瓶中，每个样品溶解在dmso(200μl)、甲醇(600μl)和水(600μl)中。将小瓶放入vindon科学耐光柜中，并且用uv光照射，平均klux＝18.2lux/小时，平均uv值＝2.55瓦特/分钟，温度＝31.0-32.0℃。分别于2，12，24，48，72，96h取样测定每个样品中剩余的曲尼司特百分比。该研究的结果如图8所示。

从图8可以看出，与纯结晶的曲尼司特相比，曲尼司特共结晶体形式在溶液中具有更高的光稳定性，其中曲尼司特苯甲酰胺共结晶体光稳定性最好，96h后仅降解了2.5％。

实施例7体内生物利用度研究

提高药物的溶解度可有效改善其口服生物利用度。由于曲尼司特溶解度较低，其生物利用度也较低。由上述研究结果可知，相对纯结晶的曲尼司特，曲尼司特结晶体的溶解度显著提高，因此，将曲尼司特制成共结晶体后，其生物利用度也应有所提高。进行药动学实验以验证曲尼司特共结晶体在提高生物利用度方面的作用。具体实施方式如下。

将结晶曲尼司特，曲尼司特苯甲酰胺共结晶体，曲尼司特2-哌啶甲酰胺和曲尼司特2-甲基烟酰胺共结晶体用生理盐水溶解。大鼠分为4组，每组6只，实验前禁食12小时(但不禁水)，灌胃给予药物，给药量为10mg/kg。并在给药后0.5，1，2，4，8，12和24h大鼠眼眶静脉取血，分离血清测定其中的药物浓度。

实验所得药动学参数如表5所示，血药浓度-时间曲线如图9所示：

表5药动学参数

由表5及图9可知，相对纯结晶曲尼司特，曲尼司特共结晶体能达到更高的血药浓度并能维持较长时间，且达峰时间(tmax)更早，预示了曲尼司特共结晶体起效更快。由此可见，将曲尼司特制成共结晶体能够有效提高其口服生物利用度。

实施例8

曲尼司特可以治疗哮喘和特异性皮炎。在过去十年研究中已经发现，曲尼司特能减少糖尿病肾纤维化，从而延缓和或预防肾功能不全。因此，考察曲尼司特共结晶体在抗纤维化方面的作用。具体实施方法如下。

1、建立adr肾纤维化大鼠模型

大鼠10％水合氯醛(300mg/kg)腹膜下麻醉后，取俯卧位并四肢固定，常规备皮消毒，后背正中旁开右0.5cm切口，长约2cm，逐层剪开皮肤、肌肉、筋膜,暴露右肾，剥离脂肪囊，止血钳夹住肾动脉、输尿管，并结扎，摘除右侧肾脏，关闭腹腔，分层缝合。术后肌肉注射青霉素钠(8万单位/kg)，预防术后感染，连续3天，术后第l周尾静脉注射adr5mg/kg,术后第2周按3mg/kg重复给药1次，正式实验前行预实验，如肾脏病理显示肾小球系膜区基质增加，肾小管姜缩，间质纤维化则提示造模成功。

2、大鼠分组及给药

adr肾纤维化大鼠分为正常组，假手术组，模型组，曲尼司特组和曲尼司特苯甲酰胺共结晶体组，每组6只。正常组大鼠正常条件饲养，不造模，予以生理盐水腹腔注射；假手术组大鼠切除右肾后，不注射adr，予以生理盐水腹腔注射；模型组按上法造模后给予生理盐水腹腔注射；曲尼司特组和曲尼司特苯甲酰胺共结晶体组大鼠按上法造模后，予以曲尼司特组和曲尼司特苯甲酰胺共结晶体生理盐水溶液(10mg/kg.d)腹腔注射给药。连续给药8周后处死大鼠，各组大鼠处死前1天用代谢笼收集24小时尿量。处死大鼠时以10％水合氯醛(300mg/kg)腹膜下麻醉后，腹主动脉采血3-5ml后摘除左肾，生理盐水清洗血液后，放入液氮保存检测相关指标。

3、大鼠尿蛋白量测定

大鼠蛋白尿含量如图10所示，正常组和假手术组大鼠可见少量的尿蛋白排出，两组比较差异无统计学意义(p>0.05)；模型组大鼠尿蛋白排出显著增多，与假手术组比较，差异有统计学意义(p<0.01)；曲尼司特组与共结晶体组大鼠尿蛋白排出均少于模型组，差异有统计学意义(p<0.01)；给予曲尼司特苯甲酰胺共结晶体的大鼠更为显著，尿蛋白量降至40mg/d以下，相对曲尼司特组差异具有统计学意义(p<0.01)。

4、肾组织病理改变

对各组大鼠肾组织he染色一般组织学观察。模型组he染色可见肾小球系膜区增宽，球囊壁增厚及球囊粘连，肾小球呈局部灶节段硬化，小管灶状姜缩，周围可见炎症细胞浸润；msasno染色肾间质可见纤维化，曲尼司特组与共结晶体组大鼠肾组织虽可见模型组上述改变，但程度较轻。

肾小管间质病理损害评价方法：根据肾间质纤维化所占比例分值为1-4分，0分为正常(即没有肾小管扩张、萎缩、管型、坏死或小管炎)；1分为肾间质纤维化面积小于25％，2分为25％-49％，3分为50％-75％，4分为超过75％。

肾小管间质纤维化评分结果如图11所示，与假手术组比较，模型组肾小管间质纤维化评分显著升高，差异有统计学意义(p<0.01)；与模型组比较，曲尼司特组与共结晶体组肾小管间质纤维化评分下降，差异有统计学意义(p<0.01)，且与曲尼司特组相比，曲尼司特共结晶体组肾小管间质纤维化评分更低(p<0.01)。

采用raij的半定量法计算肾小球硬化指数(gsi)。肾小球硬化表现为毛细血管腔塌陷和/或玻璃样变，每张标本切片光镜(10×40)随机选取10个视野，分别计算评分，取平均值，作为该标本的gsi。具体方法为：每张切片至少观察30个完整肾小球，根据硬化灶所占肾小球比例分0-3级。0级为肾小球无病变或病变面积小于52％，1级为病变面积52％-50％，2级为病变面积51％-75％，3级为病变面积大于76％。计算gsi＝[(1×n1+2×n2+3×n3)/每片肾小球总数]×100％(n1为评分l级的肾小球个数，2n为评分2级的肾小球个数，n3为3级的肾小球个数)。

肾小球硬化指数评分结果如图12所示，与假手术组比较，模型组、曲尼司特组和共结晶体组大鼠肾小球硬化指数显著升高，差异有统计学意义(p<0.01)，但曲尼司特组与模型组比较，肾小球硬化指数明显降低(p<0.01)；曲尼司特共结晶体组与曲尼司特组相比，肾小球硬化指数更低(p<0.01)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。