PgSND1-like基因在促进石榴籽粒硬度形成的用途的制作方法

本发明涉及一种pgsnd1-like基因在促进石榴籽粒硬度形成的用途，属于植物基因用途领域。
背景技术：
：石榴（punicagranatuml.），属于石榴科石榴属落叶果树，在阿富汗、伊朗、中国等地广泛栽培。我国石榴品种资源丰富，具有丰富的遗传多样性。石榴果实中营养保健价值高，被誉为超级水果。软籽石榴核软可食，深受大家的重视和市场的欢迎。研究表明石榴籽粒硬度性状可能受到多个基因的调控，同时也受到光照等环境因素的影响。张永明和曹丹琴等人指出石榴籽粒硬度和种皮木质素含量呈正相关关系。木质素是由松柏醇、香豆醇及芥子醇三种单体通过氧化聚合而形成的一种复杂多酚类物质。研究表明：木质素的合成途径包括莽草酸途径、苯丙氨酸途径和木质素特异合成途径。人们利用分子生物学手段对木质素生物合成关键酶基因进行了研究，主要有苯丙氨酸解氨酶（pal）、香豆酸-3-羟基化酶（c3h）、咖啡酸-3-o-甲基转移酶（comt）、咖啡酰coa3-o-甲基转移酶（ccoaomt）、4-香豆酸辅酶a连接酶（4cl）、阿魏酸-5-羟化酶（f5h）、过氧化物酶等。木质素的生物合成不仅受到这些酶基因的调控，同时还受到转录因子的调控。研究表明，myb、nac、wrky等转录因子在木质素生物合成中起重要的调控作用。1997年，aida等人发现在矮牵牛nam基因、拟南芥ataf1/2和cuc2基因编码蛋白的n端都包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名为nac，所以后来就把含有nac结构域的蛋白统称为nac转录因子。zhong和ye等2007年指出snd1/nst3是控制次生壁合成代谢的一种主要转录调控开关，调控下游myb转录因子，继而调控次生壁合成基因的表达。已有研究发现：过表达snd1可激活次生壁生物合成基因的表达，导致次生壁的增厚。但是未见涉及石榴籽粒硬度的基因有关方面的研究，因此分析研究石榴软籽性状的形成机理，能够加快石榴育种进程。技术实现要素：本发明提供了一种pgsnd1-like基因及其用途，通过过量表达pgsnd1-like基因，拟南芥能明显增加次生壁木质素的合成，进而提高了石榴籽粒硬度。具体的本发明的内容包括以下几个方面：一种促进石榴籽粒硬度形成的核苷酸序列，其特征在；所述核苷酸序列由seqidno：1所示的核苷酸序列组成，其具体基因序列如下：atgccacgagacatgaatctgtccataaatggtcagtcccaggttcccccaggcttccgcttccatccgaccgaagaagagctcctccactattacctgaggaagaaagtcgcccaggagaagatcgacctcgatgtgatccgcgaagttgatctcaacaagctcgagccgtgggatattcaagagaagtgcagaatagggtcgacgccacaaaatgattggtacttcttcagtcacaaggacaagaagtacccgacagggactcggacaaaccgagcgactgcagccggattctggaaggcgacagggcgcgacaagataatctacagcgggttcagaaggattgggttgcggaagaccctggtgttttacaaggggcgtgctccacatggacagaagtcggactggatcatgcacgaataccggctagacgagactccaagcattgatccgagtgctctgaatcctacagtcgatcagttgagtacagaagaaggatgggtagtatgccgagtttttcggaagaagaacttccagaaaaccctagaccacagtcccaagagctcatcctccacctccatggactcaaaactcatccacaacctcagcaccacaaacaaccttaatattaacaacatcaaagacaatcctagcagtgtcctggaccagattctcctctacatgggggaaagaaacagtgcgtgcaagatcgagactagtcaaccccgaatgcctgtcacactcgacccttccgactactgcgacacagtctccagcatcaagcttattcaccagcctctgcccgacctccacgaacggttcatgcacctcccgaggctcgagtgcccagcaaccctcccttccatcttccccacaccaccacttgatcaacacaacgtccatcagccgttcgatgagttgactgatcataatcaagatcagtcaacgcagtcactcacagttggagactgggctgcgttcgaccggcttgttgcttcccagcttaacggccaagcagagacaccaagcgactcggcctttggactccagctagccaatgaagaagaggaggaagaagaagaagaagatgccaatgaagggcaggtcccatcgattccgaggttcagaataagcaggcctcatcatcagaatctgcaaccgtacaacgggaacgaaaacgccgatttgtggagcttcaccaagtcttcatcgccgcagccatctgaccccttacgccacttatcggtataa其蛋白质序列如下：mprdmnlsingqsqvppgfrfhpteeellhyylrkkvaqekidldvirevdlnklepwdiqekcrigstpqndwyffshkdkkyptgtrtnrataagfwkatgrdkiiysgfrriglrktlvfykgraphgqksdwimheyrldetpsidpsalnptvdqlsteegwvvcrvfrkknfqktldhspksssstsmdsklihnlsttnnlninnikdnpssvldqillymgernsackietsqprmpvtldpsdycdtvssiklihqplpdlherfmhlprlecpatlpsifptppldqhnvhqpfdeltdhnqdqstqsltvgdwaafdrlvasqlngqaetpsdsafglqlaneeeeeeeeedanegqvpsiprfrisrphhqnlqpyngnenadlwsftkssspqpsdplrhlsv本发明涉及一种表达载体，所述的表达载体含有pgsnd1-like的核苷酸序列，所述载体可以通过例如将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。进一步，优选地：所述的表达载体，所述的表达载体为pbi121质粒。本发明也提供了一种重组细胞，所述重组细胞可以通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如：根癌农杆菌细胞lba4404、eha105、gv3101等。本发明的核苷酸序列和/或载体和/或重组细胞在促进石榴籽粒硬度形成的用途。本发明的有益效果：pgsnd1-like过量表达转基因拟南芥能明显增加次生壁木质素的合成，石榴籽粒硬度与种皮木质素含量呈正相关关系，说明它可能参与石榴籽粒硬度的形成。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为系统进化树；图2为不同株系的表达水平结果；图3为种植实验结果；图4为石蜡切片染色结果；图5为转基因株系和野生型株系木质素含量变化结果；图6为四个次生壁木质素合成基因在转基因主茎中表达量的变化结果。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。一、总rna提取及第一链cdna合成用rna提取试剂盒提取三白硬籽石榴60天籽粒总rna，具体操作步骤参照其说明书。测量其浓度，并跑琼脂糖电泳检测rna的质量。接下来进行cdna第一链的合成。具体步骤如下：totalrna500ng,oligo(dt)181ul,2xreactionmix10ul,transscriptrtenzymemix1ul,补rnase-freewater至20ul。42℃孵育30min,85℃加热5s。-20℃保存。提取的总rna作如下分析：经分析所述pgsnd1-like基因的cds全长1251bp,编码416个氨基酸，具有保守的a、b、c、d、e五个亚基组成的nac结构域，如图1所示，系统进化分析表明其与拟南芥snd1亲缘关系较近。二、基因cds全长序列克隆及测序根据参考基因组中pgsnd1-like(突尼斯)已知序列，ncbiprimerblast设计克隆引物，以三白硬籽石榴花后60天籽粒cdna为模板，pfu高保真酶进行扩增该基因cds全长。上游引物：5’-gggtctagaatgccacgagacatgaat-3’，下游引物：5’-cttggatccttataccgataagtggcg-3’。pcr扩增采用高保真pfudna聚合酶进行扩增。反应体系：5×pfuflybuffer,10ul；2.5mmdntp，4μl；上游引物1μl；下游引物1μl；pfu高保真酶1μl；模板cdna1μl；补ddh2o至50μl。pcr反应程序为：95℃2min；95℃20s，58℃20s，72℃90s，30个循环；72℃5min；4℃保存。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，将回收后的pcr产物连接到peasybluntsimplecloning载体上，转化到大肠杆菌dh5α感受态中。克隆反应体系（1）加入componentvolumepcrproduct0.5~4ulpeasy–t1cloningvector1ul（2）轻轻混合，室温反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上。转化（1）加连接产物于50uldh5α感受态中（在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴20~30分钟。（2）42℃水浴热激30s，立即置于冰上2分钟。（3）加250ullb培养基，200rpm、37度培养1h。（4）取8ul500mmiptg和40ul20mg/mlx-gal混合，均匀地涂在准备好的平板上，37℃培养箱中放置30分钟。（5）待iptg和x-gal被吸收后，取200ul菌液均匀地涂在平板上，在37℃培养箱中过夜培养。挑取白色单菌落进行pcr检测。测序：将检测为阳性的单克隆摇成菌液，送去公司测序。用m13forwardprimer和m13reverseprimer进行测序。测序结果：序列全长1251bp,与公司大数据分析碱基序列比对没有发生碱基突变。三、过量表达载体的构建，具体步骤如下：1、提取携带有pgsnd1-like基因的peasy–t1cloningvector质粒，以此质粒为模板，利用上述克隆引物进行pcr扩增，琼脂糖凝胶回收得到pgsnd1-like基因片段；2、利用限制性内切酶bamhi/xbai对pbi121载体进行酶切；3、t4快速连接酶连接pgsnd1-like基因片段与pbi121载体10min；4、将连接产物转化到大肠杆菌感受态dh5α中；5、将其涂布于含卡那霉素的lb培养基中，37度培养箱，倒置培养过夜。6、挑取单克隆，进行pcr检测。7、接种阳性克隆，提取质粒，进行跑胶、测序检验。测序结果：没有发生碱基突变。四、表达载体导入农杆菌1、农杆菌转化从-80℃冰箱取出100ul农杆菌gv3101感受态细胞，加1ug重组质粒，冰浴5min，液氮速冻5min，放置于37℃水浴锅5min，冰浴5min，然后加入1mllb液体培养基；28℃，220rpm震荡培养2-4h，将菌液涂于含有kan和rif的lb固体平板上。28℃培养箱倒置培养2-3d，观察结果。挑取单菌落进行pcr检测。2、拟南芥的遗传转化挑取携带有目的基因的农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素的lb液体培养基中进行活化，然后将活化过的菌液转接到新鲜的200ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，28℃摇床，220rpm，待od值达到0.8~1时，5000rpm，10min，收集沉淀，用160mlms悬浮，加入silwet2.7760ul，将带有花苞的拟南芥倒置在菌液中30s，用保鲜袋罩住，2天后去袋子，正常培养。五、转基因拟南芥植株获得收获转基因拟南芥t0代种子，消毒后铺于含50mg/ml卡那霉素的ms培养基上,培养一周后，将筛选得到的绿苗移栽到营养钵中生长，两周后，提取其叶片基因组dna进行pcr检测。。采用以下方法提取dna，步骤如下：1、70%乙醇擦洗拟南芥叶片，保持叶片清洁。2、吸取600ulgdna提取buffer置于研钵，加入叶片，快速研磨。吸取研磨液置于新的ep管中，12000rpm，4℃离心，10min。3、取上清到一个新的ep管中，加入等体积酚和氯仿进行抽提，12000rpm，4℃离心，5min。4、吸取上清到一个新的ep管中，然后加入等体积的异丙醇，混匀，12000rpm，4℃，5min。5、倒掉上清，向ep管中加入1ml75%乙醇清洗沉淀，12000rpm,4℃，5min。6弃上清，将ep管倒置在一个干净的滤纸上，晾干，加入约30ul水，溶解沉淀。利用taqdna聚合酶进行pcr扩增，引物选用克隆引物，上游引物：5’-gggtctagaatgccacgagacatgaat-3’，下游引物：5’-cttggatccttataccgataagtggcg-3’。扩增反应程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃90s，32个循环；72℃10min，4℃保存。对于pcr检测基因组dna为阳性的株系进行了rna的提取，rna提取采用传统的trizol法，并进行逆转录成cdna。然后进行了半定量分析和定量分析，分析不同株系的表达水平（图2）。引物选用pgsnd1-like表达引物：上游引物:5’-tcaacgcagtcactcacagtt-3’；下游引物:5’-gatgaagacttggtgaagctc-3’内参引物actin:上游引物：5’-gaaatcacagcacttgcacc-3’；下游引物：5’-aagcctttgatcttgagagc-3’六、将野生型拟南芥种子和t3代转基因拟南芥种子点种于ms固体培养基上，一周后移栽到土里面，一个月后观察转基因拟南芥植株表型，发现转基因拟南芥出现叶片变小且上卷的表型，并且其荚果变小且有部分不育现象，表明pgsnd1-like基因可能参与到次生壁的加厚过程（图3）。七、对野生型拟南芥和转基因拟南芥生长六周的花序主茎做石蜡切片，并进行番红固绿染色。结果如下图4所示：表明转基因株系拟南芥木质素合成增加，次生壁加厚。八、对野生型拟南芥和转基因拟南芥生长六周的花序主茎进行木质素进行测量，结果表明转基因株系拟南芥木质素合成明显高于野生型拟南芥（图5）。九、提取花序主茎基部的rna，逆转录为cdna，进行rt-pcr。检测ccoaomt、pal1、4cl、f5h四个个次生壁木质素合成基因在转基因主茎中表达量的变化，结果发现这些次生壁木质素合成基因的表达水平相对于野生型有明显的提高，说明pgsnd1-like可能参与正调控次生壁木质素的合成(图6)。引物如下：atpal1-up:tagattcgtgagggaagagctatpal1-dn:ccacttcacagacaatcatttggatccoaomt-up:tcgttgatgctgacaaagacaatccoaomt-dn:actgatccgacggcagatagat4cl-up:ggttacctcaacaatccggcaat4cl-dn：caaatgcaacaggaacttcacatf5h-up：ggtctcttgtaacgttggtaatf5h-dn：agatcattacgggccttcac综合以上结果：pgsnd1-like过量表达转基因拟南芥能明显增加拟南芥次生壁木质素的合成，石榴籽粒硬度与石榴种皮木质素含量呈正相关关系，说明它可能参与石榴籽粒硬度的形成。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国农业科学院郑州果树研究所<120>pgsnd1-like基因在促进石榴籽粒硬度形成的用途<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1251<212>dna<213>石榴(punicagranatuml)<400>1atgccacgagacatgaatctgtccataaatggtcagtcccaggttcccccaggcttccgc60ttccatccgaccgaagaagagctcctccactattacctgaggaagaaagtcgcccaggag120aagatcgacctcgatgtgatccgcgaagttgatctcaacaagctcgagccgtgggatatt180caagagaagtgcagaatagggtcgacgccacaaaatgattggtacttcttcagtcacaag240gacaagaagtacccgacagggactcggacaaaccgagcgactgcagccggattctggaag300gcgacagggcgcgacaagataatctacagcgggttcagaaggattgggttgcggaagacc360ctggtgttttacaaggggcgtgctccacatggacagaagtcggactggatcatgcacgaa420taccggctagacgagactccaagcattgatccgagtgctctgaatcctacagtcgatcag480ttgagtacagaagaaggatgggtagtatgccgagtttttcggaagaagaacttccagaaa540accctagaccacagtcccaagagctcatcctccacctccatggactcaaaactcatccac600aacctcagcaccacaaacaaccttaatattaacaacatcaaagacaatcctagcagtgtc660ctggaccagattctcctctacatgggggaaagaaacagtgcgtgcaagatcgagactagt720caaccccgaatgcctgtcacactcgacccttccgactactgcgacacagtctccagcatc780aagcttattcaccagcctctgcccgacctccacgaacggttcatgcacctcccgaggctc840gagtgcccagcaaccctcccttccatcttccccacaccaccacttgatcaacacaacgtc900catcagccgttcgatgagttgactgatcataatcaagatcagtcaacgcagtcactcaca960gttggagactgggctgcgttcgaccggcttgttgcttcccagcttaacggccaagcagag1020acaccaagcgactcggcctttggactccagctagccaatgaagaagaggaggaagaagaa1080gaagaagatgccaatgaagggcaggtcccatcgattccgaggttcagaataagcaggcct1140catcatcagaatctgcaaccgtacaacgggaacgaaaacgccgatttgtggagcttcacc1200aagtcttcatcgccgcagccatctgaccccttacgccacttatcggtataa1251<210>2<211>416<212>prt<213>石榴(punicagranatuml)<400>2metproargaspmetasnleuserileasnglyglnserglnvalpro151015proglypheargphehisprothrgluglugluleuleuhistyrtyr202530leuarglyslysvalalaglnglulysileaspleuaspvalilearg354045gluvalaspleuasnlysleugluprotrpaspileglnglulyscys505560argileglyserthrproglnasnasptrptyrphepheserhislys65707580asplyslystyrprothrglythrargthrasnargalathralaala859095glyphetrplysalathrglyargasplysileiletyrserglyphe100105110argargileglyleuarglysthrleuvalphetyrlysglyargala115120125prohisglyglnlysserasptrpilemethisglutyrargleuasp130135140gluthrproserileaspproseralaleuasnprothrvalaspgln145150155160leuserthrglugluglytrpvalvalcysargvalphearglyslys165170175asnpheglnlysthrleuasphisserprolysserserserserthr180185190sermetaspserlysleuilehisasnleuserthrthrasnasnleu195200205asnileasnasnilelysaspasnproserservalleuaspglnile210215220leuleutyrmetglygluargasnseralacyslysilegluthrser225230235240glnproargmetprovalthrleuaspproserasptyrcysaspthr245250255valserserilelysleuilehisglnproleuproaspleuhisglu260265270argphemethisleuproargleuglucysproalathrleuproser275280285ilepheprothrproproleuaspglnhisasnvalhisglnprophe290295300aspgluleuthrasphisasnglnaspglnserthrglnserleuthr305310315320valglyasptrpalaalapheaspargleuvalalaserglnleuasn325330335glyglnalagluthrproseraspseralapheglyleuglnleuala340345350asngluglugluglugluglugluglugluaspalaasngluglygln355360365valproserileproargpheargileserargprohishisglnasn370375380leuglnprotyrasnglyasngluasnalaaspleutrpserphethr385390395400lysserserserproglnproseraspproleuarghisleuserval405410415<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gggtctagaatgccacgagacatgaat27<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cttggatccttataccgataagtggcg27<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcaacgcagtcactcacagtt21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gatgaagacttggtgaagctc21<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gaaatcacagcacttgcacc20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aagcctttgatcttgagagc20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tagattcgtgagggaagagct21<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ccacttcacagacaatcatttgg23<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tcgttgatgctgacaaagaca21<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12actgatccgacggcagatag20<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ggttacctcaacaatccggca21<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14caaatgcaacaggaacttcac21<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ggtctcttgtaacgttggta20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16agatcattacgggccttcac20当前第1页12