一种辣木籽小分子多肽及其制备工艺的制作方法

本发明涉及辣木籽深加工领域，且特别涉及一种辣木籽小分子多肽及其制备工艺。

背景技术：

辣木，是辣木科辣木属的植物，原产于印度北部的喜马拉雅山地区，广泛种植在亚洲和非洲热带和亚热带地区。辣木全身都是宝，其叶片、花朵、种子及嫩芽、嫩茎、根等均可食用，是药食同源的植物。印度和非洲国家常用辣木来治疗高血压、糖尿病、心血管疾病、风湿、关节炎等高发疾病。辣木籽中含有丰富的油脂以及蛋白质，是优质的蛋白质来源。辣木籽蛋白含有较丰富的供质子或供电子能力的氨基酸，具体包括：酪氨酸酶tyr、蛋氨酸met、半胱氨酸cys；还含有较丰富的疏水性氨基酸，具体包括：亮氨酸leu、脯氨酸pro、苯丙氨酸phe及缬氨酸val；以及丰富的酸性氨基酸：谷氨酸glu。因此，采用酶法可以制备得到具有强抗氧化活性的辣木籽肽，辣木籽肽可作为高效的抗氧化剂用于食品工业，具有较强的社会与经济效益。

虽然目前的酶解法对辣木籽提取得到的产品中的蛋白质含量可高达90％，但是蛋白质中的多肽含量较低，小分子多肽含量更低，小分子多肽是指分子量小于1000d的肽段，因此，产品的吸收性能较差。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术存在的至少一个技术问题，本发明实施例提供一种辣木籽小分子多肽及其制备工艺，产品的多肽含量较高，尤其小分子多肽含量高，具有良好的吸收性。

本发明实施例解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

第一方面，提供一种辣木籽小分子多肽，其主要是采用辣木籽粕和复合酶在自然ph条件下酶解得到，辣木籽小分子多肽中的多肽含量＞50％，多肽中分子量小于1000d的肽段含量≥85％。

上述技术方案中，辣木籽小分子多肽是采用辣木籽粕和复合酶在自然ph条件下酶解得到，实现辣木籽粕的高值化利用，避免了辣木籽蛋白的浪费，同时自然ph酶解工艺省去人为调节ph的步骤，减少工时，降低生产成本，避免灰分杂质带入产品，有利于产品品质的的提高。辣木籽小分子多肽的多肽含量＞50％，即多肽含量高，尤其多肽中分子量小于1000d的肽段含量≥85％，即小分子多肽含量高，小分子肽段具有优越的吸收性和低致敏性，因此，辣木籽小分子多肽具有良好的吸收性能。

在一种可能的实现方式中，辣木籽小分子多肽配制的质量浓度10％水溶液在620nm的透光率≥80％。

上述技术方案中，辣木籽小分子多肽配制的质量浓度10％水溶液在620nm的透光率达到80％以上，而透光率越高表明产品的溶解性越高，因此产品的溶解性好，应用范围广泛，比如可以制成粉剂、口服液等剂型；而且产品的吸收性能好。

在一种可能的实现方式中，复合酶包括占辣木籽粕质量0.5％-4％的中性蛋白酶、占辣木籽粕质量0.2％-5％碱性蛋白酶。

上述技术方案中，在自然ph条件下，采用一定量的中性蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解，能获得相对最佳的酶解效果。

在一种可能的实现方式中，复合酶还包括占辣木籽粕质量0.5％-2％的木聚糖酶，和/或，占辣木籽粕质量0.2％-1％的β-葡聚糖酶。

上述技术方案中，在自然ph条件下，中性蛋白酶和碱性蛋白酶能利用体系自身的ph及其变化，与一定量的木聚糖酶共同作用，对辣木籽粕进行充分酶解；在自然ph条件下，中性蛋白酶和碱性蛋白酶能利用体系自身的ph及其变化，与一定量的β-葡聚糖酶共同作用，对辣木籽粕进行充分酶解。

第二方面，提供一种辣木籽小分子多肽的制备工艺，其包括以下步骤：

将辣木籽粕和水按质量比1:10-20混合，加热至90-105℃，匀浆0.5-2h，得浆液；

将浆液冷却至50-60℃，在自然ph条件下，将浆液和占辣木籽粕质量0.5％-4％的中性蛋白酶、占辣木籽粕质量0.2％-5％的碱性蛋白酶，于50-60℃酶解2-8h，得到酶解液；

将酶解液灭酶、过滤得滤液，并将滤液浓缩、干燥。

上述技术方案中，采用辣木籽粕作为原料，能实现辣木籽粕的高值化利用，避免了辣木籽蛋白的浪费；将辣木籽粕和水在一定的温度条件下匀浆，能够将辣木籽粕中的有效成分溶解于水中，而且不破坏有效成分的活性，以便进行后续的酶解步骤；在自然ph条件下，采用一定量的中性蛋白酶和碱性蛋白酶在一定的温度条件下进行酶解，省去人为调节ph的步骤，减少工时，降低生产成本，避免灰分杂质带入产品，有利于产品品质的的提高。

在一种可能的实现方式中，灭酶的方法为：于95-100℃保持10-15min；和/或，真空浓缩采用的真空度为0.06-0.08。

上述技术方案中，采用一定的高温和时间处理进行灭酶，能消耗相对最少的能量使中性蛋白酶和碱性蛋白酶等复合酶均失活；采用一定的真空度进行浓缩，能快速去除水分，实现浓缩目的。

在一种可能的实现方式中，喷雾干燥的条件为：进风温度为180-220℃，出风温度为60-95℃，引风转子功率为30-40hz，喷头转子功率15-20hz。

上述技术方案中，采用一定的条件进行喷雾干燥，能获取粒度均匀，且主要成分为辣木籽多肽的固体产品，便于存储和应用。

在一种可能的实现方式中，碱性蛋白酶是按照以下制备方法制得：将svf4-21-7菌种经种子逐级扩大培养，转入发酵罐发酵，得碱性蛋白酶发酵液；将碱性蛋白酶发酵液经硫酸铵盐析、透析脱盐、离子交换层析、聚乙二醇包埋浓缩、凝胶过滤层析后冷冻干燥，制得碱性蛋白酶固体粉末；

和/或，中性蛋白酶是按照以下制备方法制得：将as1.398菌种经种子逐级扩大培养，转入发酵罐发酵，得种子液；在种子液中添加絮凝剂，得滤液；将滤液离心、粗滤、精滤，添加海藻糖和β-环状糊精，搅拌，收集沉淀，真空干燥，制得中性蛋白酶固体粉末。

上述技术方案中，按照上述制备方法制得的碱性蛋白酶和中性蛋白酶活性高，容易在工艺生产中控制酶解步骤的活性。

在一种可能的实现方式中，还加入占辣木籽粕质量0.5％-2％的木聚糖酶进行酶解，木聚糖酶是按照以下制备方法制得：将嗜热芽孢杆菌cctccno:m2013537的斜面菌种经活化、多级种子培养及一级种子罐逐级扩大培养得到种子液；将种子液按5％-8％接种量接入发酵罐，于37-45℃恒温培养10-15h；降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续降温至2-5℃，将种子液以2％-5％接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续升温至37-45℃，恒温培养15-20h，得发酵液；将发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得木聚糖酶固体粉末。

上述技术方案中，按照上述制备方法制得的木聚糖酶活性高，在自然ph条件下，中性蛋白酶和碱性蛋白酶能利用体系自身的ph及其变化，与一定量的木聚糖酶共同作用，对辣木籽粕进行充分酶解。

在一种可能的实现方式中，还加入占辣木籽粕质量0.2％-1％的β-葡聚糖酶进行酶解，β-葡聚糖酶是按照以下制备方法制得：将地衣芽孢杆菌cctccno:m2013538的斜面菌种经活化培养得到种子液；将种子液以2％-5％接种量接入发酵罐中，于35-45℃恒温培养10-15h；然后在发酵罐中补入发酵培养基，于35-45℃恒温培养15-20h；将种子液以1％-4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；继续在发酵罐中补入发酵培养基，于35-45℃恒温培养10-15h，得发酵液；将发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶固体粉末。

上述技术方案中，按照上述制备方法制得的β-葡聚糖酶活性高，在自然ph条件下，中性蛋白酶和碱性蛋白酶能利用体系自身的ph及其变化，与一定量的β-葡聚糖酶共同作用，对辣木籽粕进行充分酶解。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中不同产品的蛋白质多肽吸收率结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的辣木籽小分子多肽及其制备工艺进行具体说明。

本发明实施例提供一种辣木籽小分子多肽，其主要是采用辣木籽粕和复合酶在自然ph条件下酶解得到，辣木籽小分子多肽中的多肽含量＞50％，多肽中分子量小于1000d的肽段含量≥85％；可选的，辣木籽小分子多肽配制的质量浓度10％水溶液在620nm的透光率≥80％。

本实施例中，复合酶可以包括占辣木籽粕质量0.5％-4％的中性蛋白酶、占辣木籽粕质量0.2％-5％碱性蛋白酶。在其他实施例中，复合酶还可以包括占辣木籽粕质量1％-3％的中性蛋白酶、占辣木籽粕质量1％-3％碱性蛋白酶。例如，复合酶还可以包括占辣木籽粕质量0.5％、1％、2％、3％、4％的中性蛋白酶、占辣木籽粕质量0.2％、1％、2％、3％、4％、5％碱性蛋白酶。

本实施例中，复合酶还包括占辣木籽粕质量0.5％-2％的木聚糖酶，例如，复合酶还包括占辣木籽粕质量0.5％、1％、1.5％、2％的木聚糖酶；和/或，复合酶还包括占辣木籽粕质量0.2％-1％的β-葡聚糖酶，例如，复合酶还包括占辣木籽粕质量0.2％、0.5％、1％的β-葡聚糖酶。

本发明实施例提供一种辣木籽小分子多肽的制备工艺，其包括以下步骤：

(1)、将辣木籽粕和水按质量比1:10-20混合，加热至90-105℃，匀浆0.5-2h，得浆液。

在其他实施例中，辣木籽粕和水还可以按质量比1:12-18，例如1:10、1:12、1:15、1:18、1:20混合；在其他实施例中，还可以加热至95-100℃，例如加热至90℃、95℃、100℃、105℃；在其他实施例中，还可以匀浆1-1.5h，例如匀浆0.5h、1h、1.5h、2h。

(2)、将浆液冷却至50-60℃，在自然ph条件下，将浆液和占辣木籽粕质量0.5％-4％的中性蛋白酶、占辣木籽粕质量0.2％-5％的碱性蛋白酶，于50-60℃酶解2-8h，得到酶解液。

在其他实施例中，还可以于52-57℃酶解4-6h，例如，于50℃、52℃、55℃、57℃、60℃酶解2h、4h、6h、8h。

(3)、将酶解液灭酶、过滤得滤液，并将滤液浓缩、干燥。

本实施例中，灭酶的方法为：于95-100℃保持10-15min，例如，于95℃、98℃、100℃灭酶10min、12min、15min。和/或，真空浓缩采用的真空度为0.06-0.08，例如，真空度为0.06、0.065、0.07、0.08。

本实施例中，喷雾干燥的条件为：进风温度为180-220℃，例如180℃、185℃、190℃、200℃、210℃、220℃，出风温度为60-95℃，例如60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、87℃、90℃、95℃；引风转子功率为30-40hz，例如30、35、40hz，喷头转子功率15-20hz，例如15、18、19hz。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

a、制备中性蛋白酶：将枯草芽孢杆菌as1.398菌种经种子逐级扩大培养，转入发酵罐发酵，得种子液；在种子液中添加絮凝剂，搅拌均匀，静置30分钟，使杂质与絮凝剂结合成团状，将絮凝反应完成后的种子液进行板框过滤，得滤液；将滤液高速离心，转速为10000rpm，进料流速为80l/h，收集离心液；粗滤，采用孔径为0.22um和0.1um的聚偏氟乙烯滤膜进行过滤，操作压力0.1mpa；采用截留分子量为10k的聚砜超滤膜进行过滤浓缩，操作压力0.1mpa，得浓缩液；添加酶活保护剂海藻糖和β-环状糊精，海藻糖的重量为浓缩液的重量的1％，β-环状糊精的重量为浓缩液的重量的0.5％，搅拌均匀；边缓慢搅拌边添加食用乙醇，收集絮状的中性蛋白酶沉淀，真空干燥，制得中性蛋白酶固体粉末。

b、制备碱性蛋白酶：将碱性蛋白酶高产菌株svf4-21-7(cgmccno.6417)菌种经种子逐级扩大培养，转入发酵罐发酵，得碱性蛋白酶发酵液；将碱性蛋白酶发酵液经硫酸铵盐析、透析脱盐、离子交换层析、聚乙二醇包埋浓缩、凝胶过滤层析后冷冻干燥，制得碱性蛋白酶固体粉末。

c、制备木聚糖酶：将保存完好的嗜热芽孢杆菌cctccnom2013537的斜面菌种经活化和一、二、三级种子培养及一级种子罐逐级扩大培养得到种子液，以6％接种量接入发酵罐，培养温度40℃，搅拌速度500rpm，通风量1:2v/v，培养10-15h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至10℃，恒温培养20h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至4℃，此时，将种子液以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养24h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至10℃，恒温培养15h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至40℃，恒温培养20h，得发酵液；发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得木聚糖酶固体粉末。

d、制备β-葡聚糖酶：地衣芽孢杆菌cctccno:m2013538的斜面菌种活化培养获得种子液；将种子液以3％接种量接入含有3l发酵培养基的发酵罐中，培养温度40℃，搅拌速度300r/min，通风量1:2v/v，培养时间10,h；然后将1l经过121℃灭菌20min、温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至40℃时恒温培养20h；此时，将种子液以2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养12h；继续将1l经过121℃灭菌20min、温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至40℃时恒温培养12h，得发酵液；将发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶固体粉末。

实施例1

本实施例提供一种辣木籽小分子多肽，其按照以下制备工艺制得：

步骤1、辣木籽粕与水按质量比1:15，加热至100℃，匀浆1h，得浆液。

步骤2、将浆液冷却至55℃，在自然ph条件下，在浆液中加入占辣木籽粕质量3％的中性蛋白酶固体粉末、占辣木籽粕质量3％的碱性蛋白酶固体粉末，酶解6h，得到酶解液。

步骤3、将酶解液于100℃灭酶15min，过滤得滤液。

步骤4、将滤液于真空度0.065真空浓缩。

步骤5、喷雾干燥，控制各工艺参数为：进风温度185℃，出风温度87℃，引风转子功率35hz，喷头转子功率18hz，制得辣木籽小分子多肽。

经检测，本实施例的辣木籽小分子多肽中多肽含量为55％，分子量小于1000d的肽段含量高达90％以上，10％水溶液的t60为82％。

实施例2

本实施例提供一种辣木籽小分子多肽，其按照以下制备工艺制得：

步骤1、辣木籽粕与水按质量比1:10混合，加热至90℃，匀浆2h，得浆液。

步骤2、将浆液冷却至50℃，在自然ph条件下，在浆液中加入占辣木籽粕质量4％的中性蛋白酶固体粉末、占辣木籽粕质量1％的碱性蛋白酶固体粉末，酶解6h，得到酶解液。

步骤3、将酶解液于100℃灭酶10min，过滤得滤液。

步骤4、将滤液于真空度0.06真空浓缩。

步骤5、喷雾干燥，控制各工艺参数为：进风温度180℃，出风温度70℃，引风转子功率30hz，喷头转子功率15hz，制得辣木籽小分子多肽。

经检测，本实施例的辣木籽小分子多肽中多肽含量为53％，分子量小于1000d的肽段含量高达87％以上，10％水溶液的t60为81％。

实施例3

本实施例提供一种辣木籽小分子多肽，其按照以下制备工艺制得：

步骤1、辣木籽粕与水按质量比1:20混合，加热至100℃，匀浆0.5h，得浆液。

步骤2、将浆液冷却至60℃，在自然ph条件下，在浆液中加入占辣木籽粕质量1％的中性蛋白酶固体粉末、占辣木籽粕质量4％的碱性蛋白酶固体粉末，酶解6h，得到酶解液。

步骤3、将酶解液于100℃灭酶10min，过滤得滤液。

步骤4、将滤液于真空度0.08真空浓缩。

步骤5、喷雾干燥，控制各工艺参数为：进风温度190℃，出风温度95℃，引风转子功率40hz，喷头转子功率20hz，制得辣木籽小分子多肽。

经检测，本实施例的辣木籽小分子多肽中多肽含量为51％，分子量小于1000d的肽段含量高达88％以上，10％水溶液的t60为85％。

实施例4

本实施例提供一种辣木籽小分子多肽，其制备工艺与实施例1的制备工艺大致相同，不同之处在于：

在自然ph条件下，在浆液中加入占辣木籽粕质量2％的中性蛋白酶固体粉末、占辣木籽粕质量2％的碱性蛋白酶固体粉末、占辣木籽粕质量2％的木聚糖酶固体粉末，最后制得辣木籽小分子多肽。

经检测，本实施例的辣木籽小分子多肽中多肽含量为57％，分子量小于1000d的肽段含量高达91％以上，10％水溶液的t60为83％。

实施例5

本实施例提供一种辣木籽小分子多肽，其制备工艺与实施例1的制备工艺大致相同，不同之处在于：

在自然ph条件下，在浆液中加入占辣木籽粕质量2％的中性蛋白酶固体粉末、占辣木籽粕质量2％的碱性蛋白酶固体粉末、占辣木籽粕质量2％的β-葡聚糖酶固体粉末，最后制得辣木籽小分子多肽。

经检测，本实施例的辣木籽小分子多肽中多肽含量为58％，分子量小于1000d的肽段含量高达93％以上，10％水溶液的t60为83％。

实施例6

本实施例提供一种辣木籽小分子多肽，其制备工艺与实施例1的制备工艺大致相同，不同之处在于：

在自然ph条件下，在浆液中加入占辣木籽粕质量2％的中性蛋白酶固体粉末、占辣木籽粕质量2％的碱性蛋白酶固体粉末、占辣木籽粕质量1％的木聚糖酶固体粉末、1％的β-葡聚糖酶固体粉末，最后制得辣木籽小分子多肽。

经检测，本实施例的辣木籽小分子多肽中多肽含量为60％，分子量小于1000d的肽段含量高达94％以上，10％水溶液的t60为87％。

对比例1

本对比例提供一种辣木籽蛋白肽的方法，其提取方法包括以下步骤：

(1)高温蒸煮：将新鲜辣木籽烘干后去壳粉碎，过60目筛，在100℃条件下蒸煮辣木籽粉30min。

(2)高压均质：取经高温蒸煮后的辣木籽粉，按照料液比1:6g/ml加入去离子水，以8000rpm的速率剪切10分钟，过胶体磨2次，得辣木籽匀浆液，20mpa高压均质2次。

(3)碱法提取：在辣木籽粉匀浆液中加入氢氧化钠，调节ph值至7.0，在温度为40℃的条件下，提取40min，冷却至室温，得混悬液。

(4)酶解：调节混悬液ph值至7.0，加入质量为辣木籽质量1％的蛋白酶(胰酶和ns37071蛋白酶的质量比为2:3)，在50℃的条件下酶解18小时，90℃灭酶30min，离心20min；分离，去除上层油脂，所得上清液为酶解液。

(5)分级醇沉：真空浓缩酶解液至固形物含量30％，加入预冷至4℃的无水乙醇，使得体系中乙醇质量含量达到10％，200r/min室温匀速搅拌4h后，离心20min，得到上清液；将上清液浓缩至固形物含量30％，加入预冷至4℃的无水乙醇，使得体系中乙醇质量含量达到40％，200r/min室温匀速搅拌4h后，离心20min，得到沉淀；加入沉淀湿重8倍的去离子水，溶解后，真空浓缩，冷冻干燥，得到粉末；

(6)大孔树脂富集：将粉末溶于水中，浓度为100mg/ml，过安伯莱特xad-16大孔树脂柱，采用0-60vol％乙醇溶液进行8个柱体积梯度洗脱，流速为2ml/min，具体为：1-5个柱体积采用100vol％水、0vol％乙醇洗脱；6-7个柱体积采用50vol％水、50vol％乙醇洗脱；7-8个柱体积采用40vol％水、60vol％乙醇洗脱；收集60％(v/v)乙醇洗脱液，冷冻干燥，得具有强抗氧化活性的辣木籽蛋白肽。

经检测辣木籽蛋白肽中蛋白质含量为92％，水分含量为7％，orac值为1455μmoltroloxequiv/g。

以下通过大鼠离体小肠吸收试验对本发明实施例的辣木籽小分子多肽的吸收性能进行评价。

选在体重180-200gsd大鼠作为受试动物，向大鼠腹腔内注射巴比妥钠溶液进行麻醉，开腹，由胃幽门部位确认十二指肠，将空肠上端结扎，于结扎端口侧端剪断小肠，并将其剥离7cm，置于tyrode液中清洗3-4次，并在结扎口侧端插入玻璃棒将其翻转，去除肠内容物，待用。

将两端均开口的硬质玻璃管的尖端插入小肠断端，并用棉线将小肠断端扎紧，由硬质玻璃管的粗端向肠管浆膜侧注入2ml的tyrode液，在另一只大试管内注入试样液10ml，作为粘膜侧液。具体提供三种试样液进行试验，分别为辣木籽柏配制的溶液、实施例1的辣木籽小分子多肽配制的溶液、大豆多肽(购买于武汉天天好生物制品有限公司)配制的溶液，试样液均是用tyrode液配制而成，且质量浓度为0.1％。

将其放入37℃恒温槽固定，持续通入混合气体(5％二氧化碳+95％氧气)，培养1h，抽取粘膜侧液和硬质玻璃管内的液体进行检测，采用福林酚法测定液体蛋白质多肽含量，其结果图1所示。

由图1可以看出，辣木籽小分子多肽在小肠的吸收率明显优于辣木籽粕在小肠的吸收率，且差异具有极显著性；虽然辣木籽小分子多肽在小肠中的吸收率略低于大豆多肽在小肠中的吸收率，但不具有差异性，综合说明本发明实施例的辣木籽小分子多肽具有优越的吸收性能。

综上所述，本发明实施例的辣木籽小分子多肽及其制备工艺，产品的多肽含量较高，尤其小分子多肽含量高，具有良好的吸收性。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。