经修饰的Cas9蛋白及其用途的制作方法

本发明涉及可靶(靶向)的区域进一步扩张的、经修饰的cas9蛋白及其用途。
背景技术：
：：已知成簇的规律间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats：crispr)和cas(crispr-相关)基因一起在细菌和古细菌中构成提供对侵入外来核酸的获得耐性的适应免疫系统。crispr往往是由噬菌体或质粒dna引起的，由其间插入有大小类似的被称作间隔区(spacer)的独特可变dna序列的24～48bp的短保守重复序列构成。另外，在重复和间隔序列的附近存在编码cas蛋白家族的基因组。在crispr-cas系统中，外源性dna被cas蛋白家族切割成30bp左右的片段，并插入crispr中。作为cas蛋白家族之一的cas1和cas2蛋白识别外源性dna的被称作前间隔序列邻近基序(原间隔序列邻近基序，proto-spaceradjacentmotif，pam)的核苷酸序列(塩基配列)，切取其上游，插入到宿主的crispr序列中，这成为细菌的免疫记忆。包含免疫记忆的crispr序列转录生成的rna(称作pre-crrna。)与一部分互补的rna(反式激活crrna(trans-activatingcrrna：tracrrna))配对，被摄入到作为cas蛋白家族之一的cas9蛋白中。摄入到cas9中的pre-crrna和tracrrna被rnaseiii切割，成为包含外来序列(向导序列)的小的rna片段(crispr-rnas：crrnas)，形成cas9-crrna-tracrrna复合物。cas9-crrna-tracrrna复合物和与crrna互补的外来侵入性dna结合，作为切割dna的酶(核酸酶)的cas9蛋白切割外来侵入性dna，从而抑制和排除从外侵入的dna的功能。cas9蛋白识别外来侵入性dna中的pam序列，在其上游切割双链dna使形成平滑末端。pam序列的长度或核苷酸序列根据细菌种类而多种多样，在酿脓链球菌(streptococcuspyogenes(s.pyogenes))中识别“ngg”(n=a/c/t/g)这3个碱基(塩基)。嗜热链球菌(streptococcusthermophiles(s.thermophilus))持有2个cas9，分别将“nggng”(n=a/c/t/g)或“nnagaa”(n=a/c/t/g)这5～6个碱基识别为pam序列。在新凶手弗朗西丝氏菌(francisellanovicida(f.novicida))中识别“ngr”(n=a/c/t/g；r=a/g)这3个碱基。在金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus(s.aureus))中识别“nngrrt”(n=a/c/t/g；r=a/g)这6个碱基。近年来，正在积极开发将细菌中的crispr-cas系统应用于基因组编辑的技术。使crrna与tracrrna融合，作为tracrrna-crrna嵌合体(以下，称作向导rna(guiderna：grna)。)来表达，并进行有效利用。由此，称为核酸酶(rna-向导的核酸酶：rgn)，在目标部位(靶位点)切割基因组dna。使用了crispr-cas系统的方法不仅可以合成与目标dna序列同源的短grna，还可以使用作为单一蛋白的cas9蛋白进行基因组编辑。因此，不必像以往使用的锌指核酸酶(zfn)或类反式激活因子激动剂(talen)那样合成每个dna序列都不同的大的蛋白，即可简便且快速地进行基因组编辑。专利文献1中公开了：有效利用了来自s.pyogenes的crispr-cas系统的基因组编辑技术。专利文献2中公开了：有效利用了来自s.thermophilus的crispr-cas系统的基因组编辑技术。而且，专利文献2中还公开了：cas9蛋白的d31a或n891a突变体起到仅其中一条dna链带有切口的dna切割酶即切口酶的作用。而且，在根据dna切割后的修复机制容易发生插入缺失等突变的非同源末端结合的发生率少时，仍具有与野生型cas9蛋白同等程度的同源重组效率。非专利文献1中公开了：使用2个cas9蛋白的d10a突变体和与该d10a突变体形成复合物的1对靶特异性向导rna的双切口酶系统，其是使用了来自s.pyogenes的cas9的crispr-cas系统。各cas9蛋白的d10a突变体和靶特异性向导rna的复合物在与向导rna互补的dna链上仅制作1个切口。一对向导rna有约20个碱基左右的错配(ずれ)，仅识别位于靶dna的相反链的靶序列。由各cas9蛋白的d10a突变体和靶特异性向导rna的复合物制作的2个切口形成模仿dna双链切割(dnadouble-strandbreak：dsb)的状态，显示出：通过利用一对向导rna，在维持高水平的效率的同时，可以改善cas9蛋白介导型基因编辑的特异性。专利文献3中公开了来自s.pyogenes的cas9蛋白的各种突变体，专利文献4中公开了来自f.novicida的cas9蛋白的各种突变体。目前，作为基因组编辑工具，广泛利用spcas9，但遗留有分子量大、向病毒载体中的导入效率低等问题。作为该问题的解决对策而开发的是来自金黄色葡萄球菌的小型cas9(sacas9)(非专利文献2)，结构分析也正在进行(非专利文献3、专利文献5)。与spcas9(1368个残基)相比，sacas9(1053个残基)的分子量小、序列同源性也低(17%)。spcas9识别5’-ngg-3’作为pam，另一方面，sacas9识别5’-nngrrt-3’(r为嘌呤碱基，a或g)。现有技术文献专利文献专利文献1：wo2014/093661；专利文献2：日本特表2015-510778号公报；专利文献3：wo2016/141224；专利文献4：wo2017/010543；专利文献5：wo2016/205759；非专利文献非专利文献1：ran,f.a等人,doublenickingbyrna-guidedcrisprcas9forenhancedgenomeeditingspecificity.cell,第154卷,第1380-1389页,2013；非专利文献2：ran,f.a等人,invivogenomeeditingusingstaphylococcusaureuscas9.nature第520卷,第186-191页,2015；非专利文献3：nishimasuh等人,crystalstructureofstaphylococcusaureuscas9.cell.第162卷,no.5,第1113-1126页,2015。技术实现要素：发明所要解决的课题来自s.aureus的cas9(在本说明书中也称作sacas9)蛋白所能识别的pam序列是“nngrrt(n表示任意的碱基，r表示嘌呤残基(a或g))”这6个碱基。sacas9虽然具有较以往的cas9蛋白小的优点，但可识别的pam序列有限制，所以存在着可编辑的靶序列受到限制的问题。本发明的目的在于：提供一种在维持与向导rna的结合能力的同时靶序列的限制得到缓解的经修饰的cas9蛋白及其用途。用于解决课题的手段本发明人着眼于sacas9蛋白作为cas9蛋白，为了解决上述课题进行了深入研究。其结果，通过将sacas9蛋白的规定位置的氨基酸取代成特定的氨基酸(导入突变)，成功地在维持与向导rna的结合能力的同时将作为以往nngrrt的pam序列形成nngnnn序列，从而完成了本发明。本说明书中，有时将导入突变前的cas9蛋白称为野生型cas9蛋白，而将导入突变后的cas9蛋白称为经修饰的cas9蛋白或突变型cas9蛋白。即，本发明如下。[1]蛋白，该蛋白由包含在seqidno:2所表示的氨基酸序列中在985位和991位以及任意的986位具有突变、并且在选自782位、800位、888位、968位、988位、1017位和1021位的至少1个位点具有突变的氨基酸序列的序列构成，并且具有与向导rna的结合能力。[2]上述[1]所述的蛋白，其中，在选自782位、800位、888位、968位、988位、1017位和1021位的至少2个位点具有突变。[3]上述[1]所述的蛋白，其中，在选自782位、800位、888位、968位、988位、1017位和1021位的至少3个位点具有突变。[4]上述[1]所述的蛋白，其中，在选自782位、800位、888位、968位、988位、1017位和1021位的至少4个位点具有突变。[5]上述[1]所述的蛋白，其中，在选自782位、800位、888位、968位、988位、1017位和1021位的至少5个位点具有突变。[6]上述[1]所述的蛋白，其中，在选自782位、800位、888位、968位、988位、1017位和1021位的至少6个位点具有突变。[7]上述[1]～[6]中任一项所述的蛋白，其中，782位的突变是取代成赖氨酸或精氨酸；800位的突变是取代成精氨酸或赖氨酸；888位的突变是取代成选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸的氨基酸；968位的突变是取代成精氨酸或赖氨酸；985位的突变是取代成选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的氨基酸；986位的突变是取代成选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的氨基酸；988位的突变是取代成组氨酸；991位的突变是取代成非芳族氨基酸；1017位的突变是取代成选自苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸的氨基酸；1021位的突变是取代成选自丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺的氨基酸。[8]上述[1]～[7]中任一项所述的蛋白，其中，782位的突变是取代成赖氨酸；800位的突变是取代成精氨酸；888位的突变是取代成赖氨酸；968位的突变是取代成精氨酸；985位的突变是取代成丙氨酸；986位的突变是取代成丙氨酸；991位的突变是取代成丙氨酸；988位的突变是取代成组氨酸；1017位的突变是取代成苯丙氨酸；1021位的突变是取代成丝氨酸。[9]上述[1]～[8]中任一项所述的蛋白，该蛋白进一步具有下述突变：(i)927位和929位的突变；(ii)929位的突变；(iii)927位的突变；(iv)889位的突变；或者(v)927位、929位和889位的突变。[10]上述[9]所述的蛋白，其中，(i)的突变是927位的取代成赖氨酸或精氨酸，以及929位的取代成天冬酰胺、天冬氨酸或丙氨酸；(ii)的突变是929位的取代成精氨酸；(iii)的突变是927位的取代成赖氨酸或精氨酸；(iv)的突变是889位的取代成天冬酰胺、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸；(v)的突变是927位的取代成赖氨酸或精氨酸，929位的取代成天冬酰胺、天冬氨酸或丙氨酸，以及889位的取代成天冬酰胺。[11]上述[9]所述的蛋白，其中，(i)的突变是927位的取代成赖氨酸、以及929位的取代成天冬酰胺；(ii)的突变是929位的取代成精氨酸；(iii)的突变是927位的取代成赖氨酸；(iv)的突变是889位的取代成天冬酰胺；(v)的突变是927位的取代成赖氨酸、929位的取代成天冬酰胺、以及889位的取代成天冬酰胺。[12]上述[9]所述的蛋白，该蛋白由包含在seqidno:2所表示的氨基酸序列中发生了下述取代而得到的氨基酸序列的序列构成，并且具有与向导rna的结合能力：782位的谷氨酸被取代成赖氨酸；800位的亮氨酸被取代成精氨酸；968位的天冬酰胺被取代成精氨酸；985位的天冬酰胺被取代成丙氨酸；986位的天冬酰胺被取代成丙氨酸；991位的精氨酸被取代成丙氨酸；988位的亮氨酸被取代成组氨酸；1021位的丙氨酸被取代成丝氨酸；927位的苏氨酸被取代成赖氨酸；929位的赖氨酸被取代成天冬酰胺。[13]上述[9]所述的蛋白，该蛋白由包含在seqidno:2所表示的氨基酸序列中发生了下述取代而得到的氨基酸序列的序列构成，并且具有与向导rna的结合能力：782位的谷氨酸被取代成赖氨酸；800位的亮氨酸被取代成精氨酸；968位的天冬酰胺被取代成精氨酸；985位的天冬酰胺被取代成丙氨酸；986位的天冬酰胺被取代成丙氨酸；991位的精氨酸被取代成丙氨酸；988位的亮氨酸被取代成组氨酸；1021位的丙氨酸被取代成丝氨酸；889位的丙氨酸被取代成天冬酰胺；927位的苏氨酸被取代成赖氨酸；929位的赖氨酸被取代成天冬酰胺。[14]上述[1]所述的蛋白，该蛋白由包含在seqidno:2所表示的氨基酸序列中发生了下述取代而得到的氨基酸序列的序列构成，并且具有与向导rna的结合能力：782位的谷氨酸被取代成赖氨酸；800位的亮氨酸被取代成精氨酸；968位的天冬酰胺被取代成精氨酸；985位的天冬酰胺被取代成丙氨酸；986位的天冬酰胺被取代成丙氨酸；991位的精氨酸被取代成丙氨酸；988位的亮氨酸被取代成组氨酸；1021位的丙氨酸被取代成丝氨酸。[15]上述[1]所述的蛋白，该蛋白由包含在seqidno:2所表示的氨基酸序列中发生了下述取代而得到的氨基酸序列的序列构成，并且具有与向导rna的结合能力：782位的谷氨酸被取代成赖氨酸；800位的亮氨酸被取代成精氨酸；968位的天冬酰胺被取代成精氨酸；985位的天冬酰胺被取代成丙氨酸；991位的精氨酸被取代成丙氨酸；1021位的丙氨酸被取代成丝氨酸；927位的苏氨酸被取代成赖氨酸；929位的赖氨酸被取代成天冬酰胺；1017位的异亮氨酸被取代成苯丙氨酸。[16]上述[1]～[15]中任一项所述的蛋白，其中，在seqidno:2的施行了突变的位置以外的位点具有80%以上的同源性。[17]上述[1]～[15]中任一项所述的蛋白，其中，在seqidno:2的施行了突变的位置以外的位点取代、缺失、插入和/或添加了1个～多个氨基酸。[18]上述[1]～[17]中任一项所述的蛋白，该蛋白具有rna诱导性dna核酸内切酶活性。[19]上述[1]～[17]中任一项所述的蛋白，其中，在seqidno:2所表示的氨基酸序列中进一步具有缺失核酸酶活性的突变。[20]上述[1]～[17]中任一项所述的蛋白，其中，在上述[19]所表示的蛋白中，在相当于seqidno:2所表示的氨基酸序列的10位、556位、557位和/或580位的位置具有突变。[21]上述[20]所述的蛋白，其中，10位的突变是天冬氨酸被取代成丙氨酸，556位的突变是天冬氨酸被取代成丙氨酸，557位的突变是组氨酸被取代成丙氨酸，580位的突变是天冬酰胺被取代成丙氨酸。[22]上述[19]～[21]中任一项所述的蛋白，该蛋白连接有转录调控因子蛋白或结构域。[23]上述[22]所述的蛋白，其中，转录调控因子为转录激活因子。[24]上述[23]所述的蛋白，其中，转录调控因子为转录沉默子或转录抑制因子。[25]核酸，该核酸编码上述[1]～[24]中任一项所述的蛋白。[26]蛋白-rna复合物，该复合物具备上述[1]～[24]中任一项所述的蛋白和向导rna，所述向导rna包含由与靶双链多核苷酸中的pam(前间隔序列邻近基序，proto-spaceradjacentmotif)序列的从1个碱基上游到20个碱基以上且24个碱基以下上游的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的多核苷酸。[27]用于位点特异性地修饰靶双链多核苷酸的方法，该方法具备以下步骤：将靶双链多核苷酸、蛋白和向导rna混合并进行培养的步骤；以及上述蛋白在位于pam序列上游的结合位点修饰上述靶双链多核苷酸的步骤，上述靶双链多核苷酸具有由nngnnn(n是指任意碱基，g是指鸟嘌呤)构成的pam序列，上述蛋白为上述[1]～[24]中任一项所述的蛋白，上述向导rna包含由与上述靶双链多核苷酸中的上述pam序列的从1个碱基上游到20个碱基以上且24个碱基以下上游的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的多核苷酸。[28]上述[27]所述的方法，其中，修饰是指靶双链多核苷酸的位点特异性切割。[29]上述[27]所述的方法，其中，修饰是指靶双链多核苷酸中的位点特异性的1个以上的核苷酸的取代、缺失和/或添加。[30]增加细胞的靶基因表达的方法，该方法包括：使上述[23]所述的蛋白和针对上述靶基因的1个或多个向导rna在上述细胞内表达。[31]减少细胞的靶基因表达的方法，该方法包括：使上述[24]所述的蛋白和针对上述靶基因的1个或多个向导rna在上述细胞内表达。[32]上述[30]或[31]所述的方法，其中，细胞为真核细胞。[33]上述[30]或[31]所述的方法，其中，细胞为酵母细胞、植物细胞或动物细胞。发明效果根据本发明，可以获得在保持与向导rna的结合力的同时pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白。另外，可以提供利用了上述cas9蛋白的简便且快速的靶序列位点特异性的基因组编辑技术。附图说明[图1]图1是表示实施例1中的dna切割活性测定试验的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。使用“(nn)gaaa”作为pam序列。[图2]图2是表示实施例1中的dna切割活性测定试验的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。使用“(nn)gaaa”作为pam序列。[图3]图3是表示实施例1中的dna切割活性测定试验的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。使用“(nn)gaaa”作为pam序列。[图4]图4是表示实施例2中的dna切割活性测定试验的琼脂糖凝胶电泳的结果的图。对于各种突变型cas9蛋白研究了pam序列。[图5]图5是显示在实施例3中以动物细胞(hek293细胞)中的切割活性为指标验证突变体的pam序列的修饰的结果的图。[图6]图6显示nls-wt-dsacas(d10a,n580a)-nls-krab-p2a-puro融合蛋白(有时还简记为wt-dsacas9-krab)的氨基酸序列(图6-1)和编码该氨基酸序列的核苷酸序列(图6-2)。[图7]图7显示nls-pf(v15)-dsacas(d10a,n580a)-nls-krab-p2a-puro融合蛋白(有时还简记为pf(v15)-dsacas9(d10a,n580a)-krab)的氨基酸序列(图7-1)和编码该氨基酸序列的核苷酸序列(图7-2)。[图8]图8显示nls-pf(v51)-dsacas(d10a,n580a)-nls-krab-p2a-puro融合蛋白(有时还简记为pf(v51)-dsacas9(d10a,n580a)-krab)的氨基酸序列(图8-1)和编码该氨基酸序列的核苷酸序列(图8-2)。[图9]图9显示与wt-dsacas9相比pf(v15)-dsacas9更强地抑制kras基因的表达。[图10]图10显示pf(v15)和pf(v51)对wt-dsacas9的脱靶(off-target)抑制效果。具体实施方式以下，对本发明进行说明。本说明书中使用的术语只要没有特别说明，则具有该领域中通常使用的意义。<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白>本实施方式的蛋白是在保持与向导rna的结合力的同时pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白。根据本实施方式的蛋白，可以提供简便且快速、并且针对靶序列进行位点特异性的基因组编辑的技术。在本说明书中，“向导rna”是指模仿tracrrna-crrna的发夹结构的rna，在其5’末端区域包含多核苷酸，所述多核苷酸由与靶双链多核苷酸中的pam序列的从1个碱基上游到优选20个碱基以上且24个碱基以下、更优选22个碱基以上且24个碱基以下的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成。该向导rna可以进一步包含1个以上的多核苷酸，所述多核苷酸由可获得发夹结构的核苷酸序列构成，该核苷酸序列由与靶双链多核苷酸不互补的核苷酸序列构成，并排列成以一点为轴对称性地互补的序列。向导rna具有与本发明的突变型cas9蛋白结合而将该蛋白引导至靶dna的功能。向导rna在其5’末端具有与靶dna互补的序列，经由该互补序列与靶dna结合，从而将本发明的突变型cas9蛋白引导至靶dna。在突变型cas9蛋白发挥dna核酸内切酶的功能的情况下，可以在靶dna存在的位点切割dna，例如可以特异性地使靶dna的功能丧失。向导rna是根据应该切割或修饰的靶dna的序列信息设计、调制的。具体而言，可以列举如实施例中使用的序列。在本说明书中，“核酸内切酶”是指切割核苷酸链的中间位置的酶。因此，具有核酸内切酶活性的、使本实施方式的pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白具有通过向导rna诱导而切割dna链的中间位置的酶活性。在本说明书中，“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物，且互换地使用。另外，还指下述的氨基酸聚合物：1个或多个氨基酸为天然存在的对应氨基酸的化学类似物或修饰衍生物。在本说明书中，“非芳族氨基酸”是指谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等不具有苯环的氨基酸。在本说明书中，“dna序列”是指任意长度的核苷酸序列，为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，呈线状、环状或支链状，为单链或双链。在本说明书中，“pam序列”是指存在于靶双链多核苷酸中、且可由cas9蛋白识别的序列，pam序列的长度或核苷酸序列根据细菌种类而不同。可由本实施方式的pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白识别的序列可用“5’-nngnnn-3’”表示。需要说明的是，在本说明书中，“n”是指选自腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和鸟嘌呤的任意一种碱基，“a”是指腺嘌呤，“g”是指鸟嘌呤，“c”是指胞嘧啶，“t”是指胸腺嘧啶，“r”是指具有嘌呤骨架的碱基(腺嘌呤或鸟嘌呤)，“y”是指具有嘧啶骨架的碱基(胞嘧啶或胸腺嘧啶)。在本说明书中，“多核苷酸”是指呈线状或环状构象、且为单链或双链形态的任一种形态的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，关于聚合物的长度没有限制性的解释。另外，还包含天然核苷酸的已知的类似物、以及在碱基部分、糖部分和磷酸部分中的至少一个部分被修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸盐骨架)。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性，例如，a的类似物与t进行碱基配对。在一个实施方式中，本发明提供蛋白(方案1)，该蛋白由包含在seqidno:2所表示的氨基酸序列中在985位和991位以及任意的986位具有突变、此外还在选自782位、800位、968位、888位、988位、1017位和1021位的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个位点具有突变的氨基酸序列的序列构成，并且具有与向导rna的结合能力。方案1的蛋白具有rna诱导性dna核酸内切酶活性。seqidno:2是sacas9蛋白的全长氨基酸序列。具体而言，seqidno:2的782位的突变是指782位的谷氨酸被取代成赖氨酸或精氨酸，优选取代成赖氨酸。具体而言，seqidno:2的800位的突变是指800位的亮氨酸被取代成精氨酸或赖氨酸，优选取代成精氨酸。具体而言，seqidno:2的888位的突变是指888位的天冬酰胺被取代成选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸的氨基酸，优选取代成赖氨酸。具体而言，seqidno:2的968位的突变是指968位的天冬酰胺被取代成精氨酸或赖氨酸，优选取代成精氨酸。具体而言，seqidno:2的985位的突变是指985位的天冬酰胺被取代成选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸的异亮氨酸的氨基酸，优选取代成丙氨酸。具体而言，seqidno:2的986位的突变是指986位的天冬酰胺被取代成选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸的异亮氨酸的氨基酸，优选取代成丙氨酸。具体而言，seqidno:2的988位的突变是指988位的亮氨酸被取代成组氨酸。具体而言，seqidno:2的991位的突变是指991位的精氨酸被取代成非芳族氨基酸，优选取代成丙氨酸。具体而言，seqidno:2的1017位的突变是指1017位的异亮氨酸被取代成体积更大的氨基酸。通过取代成体积大的氨基酸，可以期待与1015位的精氨酸的侧链发生相互作用而变得稳定。作为体积大的氨基酸，可以列举苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸，优选取代成苯丙氨酸。具体而言，seqidno:2的1021位的突变是指1021位的丙氨酸被取代成选自丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺的氨基酸，优选取代成丝氨酸。在本发明的另一实施方案中，本发明提供蛋白(方案2)，该蛋白除了具有上述方案1的突变以外，还进一步在927位和929位具有突变，并且具有与向导rna的结合能力。此外，方案2的蛋白还具有rna诱导性dna核酸内切酶活性。具体而言，927位的突变是指927位的苏氨酸被取代成赖氨酸或精氨酸，优选取代成赖氨酸。具体而言，929位的突变是指929位的赖氨酸被取代成天冬酰胺、天冬氨酸或丙氨酸，优选取代成天冬酰胺。在本发明的又一实施方案中，本发明提供蛋白(方案3)，该蛋白除了具有上述方案1的突变以外，还进一步在929位具有突变，并且具有与向导rna的结合能力。此外，方案3的蛋白还具有rna诱导性dna核酸内切酶活性。具体而言，该929位的突变是指929位的赖氨酸被取代成精氨酸。在本发明的又一实施方案中，本发明提供蛋白(方案4)，该蛋白除了具有上述方案1的突变以外，还进一步在927位具有突变，并且具有与向导rna的结合能力。方案4的蛋白具有rna诱导性dna核酸内切酶活性。具体而言，该927位的突变是指927位的苏氨酸被取代成赖氨酸。在本发明的又一实施方案中，本发明提供蛋白(方案5)，该蛋白除了具有上述方案1的突变以外，还进一步在889位具有突变，并且具有与向导rna的结合能力。此外，方案5的蛋白还具有rna诱导性dna核酸内切酶活性。具体而言，该889位的突变是指889位的丙氨酸被取代成天冬酰胺、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸，优选取代成天冬酰胺。在本发明的又一实施方案中，本发明提供蛋白(方案6)，该蛋白除了具有上述方案1的突变以外，还进一步在927位、929位和889位具有突变，并且具有与向导rna的结合能力。此外，方案6的蛋白还具有rna诱导性dna核酸内切酶活性。具体而言，927位的突变是指927位的苏氨酸被取代成赖氨酸或精氨酸，优选取代成赖氨酸。具体而言，929位的突变是指929位的赖氨酸被取代成天冬酰胺、天冬氨酸或丙氨酸，优选取代成天冬酰胺。具体而言，889位的突变是指取代成天冬酰胺。在本发明的又一实施方案中，本发明提供在功能上与上述方案1～6的蛋白同等的蛋白(方案7)。为了在功能上与上述方案1～6的蛋白同等，在seqidno:2所表示的氨基酸序列中，在上述方案1～6中施行了突变的位置以外的位点具有80%以上的序列同源性，并且具有与向导rna的结合能力。在通过突变而使氨基酸有所增减的情况下，该“施行了突变的位置以外的位点”可理解为“相当于施行了突变的位置的位置以外的位点”。作为所涉及的同源性，优选80%以上，更优选85%以上，进一步优选90%以上，特别优选95%以上，最优选99%以上。氨基酸序列同源性可通过自身已知的方法来确定。例如，氨基酸序列同源性(%)可以按照初期设定使用该领域中所常用的程序(例如blast、fasta等)来确定。另一方面，同源性(%)可以使用该领域中已知的任意算法、例如needleman等人(1970)(j.mol.biol.48:444-453)、myers和miller(cabios,1988,4:11-17)的算法等来确定。needleman等人的算法被整合到gcg软件包(可通过www.gcg.com获取)的gap程序中，例如可以通过使用blosum62matrix或pam250matrix、以及空位权重(加权)(gapweight):16、14、12、10、8、6或4和长度权重(lengthweight):1、2、3、4、5或6的任一者来确定同源性(%)。另外，myers和miller的算法被整合到作为gcg序列比对软件包的一部分的align程序中。在为了比较氨基酸序列而利用align程序的情况下，例如可以使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、空位长度罚分(gaplengthpenalty)12、空位罚分(gappenalty)4。作为在功能上与上述方案1～6的蛋白同等的蛋白，提供下述蛋白(方案7)：该蛋白在seqidno:2所表示的氨基酸序列中在通过上述方案1～6施行了突变的位置以外的位点有1个～多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且具有与向导rna的结合能力。在通过突变而使氨基酸有所增减的情况下，该“施行了突变的位置以外的位点”可以理解为“相当于施行了突变的位置的位置以外的位点”。作为人为地进行“氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加”的情形的手法(方法)，例如可以列举：对编码规定的氨基酸序列的dna施行常用的位点特异性突变导入，之后通过常规方法使该dna表达的手法。这里，作为位点特异性突变导入法，例如可以列举：利用琥珀突变的方法(缺口双链体(gappedduplex)法、nucleicacidsres.,12,9441-9456(1984))、使用了突变导入用引物的pcr的方法等。上述中所修饰的氨基酸的数目至少是1个残基，具体而言，是指1个或多个、或其以上。另外，在上述取代、缺失、插入或添加中，特别优选氨基酸的取代。该取代更优选取代成具有在疏水性、电荷、pk、立体结构(立体構造，空间结构)上的特征等类似的性质的氨基酸。作为这样的取代，例如可以列举下述组内的取代：i)甘氨酸、丙氨酸；ii)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；iii)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；iv)丝氨酸、苏氨酸；v)赖氨酸、精氨酸；vi)苯丙氨酸、酪氨酸。在本发明的又一实施方案中，本发明提供蛋白(方案8)，该蛋白除了具有上述方案1～7的突变以外，还进一步在相当于seqidno:2的10位、556位、557位和/或580位的位置具有突变，并且具有与向导rna的结合能力。在本说明书中，“相当的位置”的氨基酸残基的特定可以使用已知的算法，通过将目标氨基酸序列与参比序列(seqidno:2所示的氨基酸序列)进行比较，将序列排成队(比对)使对具有各突变的蛋白的氨基酸序列中存在的保守氨基酸残基赋予最大的同源性来进行。通过按照这样的方法将各蛋白的氨基酸序列排成队，不论氨基酸序列中是否存在插入、缺失，均可确定施行突变的氨基酸残基在序列中的位置。具体而言，该10位的突变是指10位的天冬氨酸被取代成丙氨酸。具体而言，该556位的突变是指556位的天冬氨酸被取代成丙氨酸。具体而言，该557位的突变是指557位的组氨酸被取代成丙氨酸。具体而言，该580位的突变是指580位的天冬酰胺被取代成丙氨酸。作为方案8，优选列举：10位的天冬氨酸取代成了丙氨酸的蛋白；580位的天冬酰胺取代成了丙氨酸的蛋白；以及10位的天冬氨酸取代成了丙氨酸且580位的天冬酰胺取代成了丙氨酸的蛋白。前两种蛋白具有切口酶活性，第3种蛋白虽然与向导rna结合而被运送到靶dna中，但丧失了核酸内切酶活性。作为本发明的pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白，优选的例子可以列举包含下述氨基酸序列的蛋白：在seqidno:2中782位的谷氨酸突变成赖氨酸(e782k)、800位的亮氨酸突变成精氨酸(l800r)、968位的天冬酰胺突变成精氨酸(n968r)、985位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n985a)、986位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n986a)、991位的精氨酸突变成丙氨酸(r991a)、988位的亮氨酸突变成组氨酸(l988h)、1021位的丙氨酸突变成丝氨酸(a1021s)、927位的苏氨酸突变成赖氨酸(t927k)、929位的赖氨酸突变成天冬酰胺(k929n)而得到的氨基酸序列。本说明书中，表示到取代位点为止的氨基酸残基数的数字的左侧显示的字母(alphabet)表示seqidno:2的氨基酸序列的取代前的氨基酸的单字母标记，而右侧显示的字母(alphabet)表示取代后的氨基酸的单字母标记。作为本发明的pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白，其他的优选例子可以列举包含下述氨基酸序列的蛋白：在seqidno:2中782位的谷氨酸突变成赖氨酸(e782k)、800位的亮氨酸突变成精氨酸(l800r)、968位的天冬酰胺突变成精氨酸(n968r)、985位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n985a)、986位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n986a)、991位的精氨酸突变成丙氨酸(r991a)、988位的亮氨酸突变成组氨酸(l988h)、1021位的丙氨酸突变成丝氨酸(a1021s)、889位的丙氨酸突变成天冬酰胺(a889n)、927位的苏氨酸突变成赖氨酸(t927k)、929位的赖氨酸突变成天冬酰胺(k929n)而得到的氨基酸序列。作为本发明的pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白，其他的优选例子可以列举包含下述氨基酸序列的蛋白：在seqidno:2中782位的谷氨酸突变成赖氨酸(e782k)、800位的亮氨酸突变成精氨酸(l800r)、968位的天冬酰胺突变成精氨酸(n968r)、985位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n985a)、986位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n986a)、991位的精氨酸突变成丙氨酸(r991a)、988位的亮氨酸突变成组氨酸(l988h)、1021位的丙氨酸突变成丝氨酸(a1021s)而得到的氨基酸序列。作为本发明的pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白，其他的优选例子可以列举包含下述氨基酸序列的蛋白：在seqidno:2中782位的谷氨酸突变成赖氨酸(e782k)、800位的亮氨酸突变成精氨酸(l800r)、968位的天冬酰胺突变成精氨酸(n968r)、985位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n985a)、991位的精氨酸突变成丙氨酸(r991a)、1021位的丙氨酸突变成丝氨酸(a1021s)、927位的苏氨酸突变成赖氨酸(t927k)、929位的赖氨酸突变成天冬酰胺(k929n)、1017位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸(i1017f)而得到的氨基酸序列。作为本发明的pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白，优选的例子可以列举包含下述氨基酸序列的蛋白：在seqidno:2中782位的谷氨酸突变成赖氨酸(e782k)、800位的亮氨酸突变成精氨酸(l800r)、968位的天冬酰胺突变成精氨酸(n968r)、985位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n985a)、986位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n986a)、991位的精氨酸突变成丙氨酸(r991a)、988位的亮氨酸突变成组氨酸(l988h)、1021位的丙氨酸突变成丝氨酸(a1021s)、927位的苏氨酸突变成赖氨酸(t927k)、929位的赖氨酸突变成天冬酰胺(k929n)、10位的天冬氨酸突变成丙氨酸(d10a)、580位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n580a)而得到的氨基酸序列。作为本发明的pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白，其他的优选例子可以列举包含下述氨基酸序列的蛋白：在seqidno:2中782位的谷氨酸突变成赖氨酸(e782k)、800位的亮氨酸突变成精氨酸(l800r)、968位的天冬酰胺突变成精氨酸(n968r)、985位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n985a)、991位的精氨酸突变成丙氨酸(r991a)、1021位的丙氨酸突变成丝氨酸(a1021s)、927位的苏氨酸突变成赖氨酸(t927k)、929位的赖氨酸突变成天冬酰胺(k929n)、1017位的异亮氨酸突变成苯丙氨酸(i1017f)、10位的天冬氨酸突变成丙氨酸(d10a)、580位的天冬酰胺突变成丙氨酸(n580a)而得到的氨基酸序列。本实施方式中的pam识别变得广泛的cas9蛋白例如可以通过如下所述的方法来制作。首先，使用包含编码上述本发明的pam识别变得广泛的cas9蛋白的核酸的载体转化宿主。然后，培养该宿主，使上述蛋白表达。培养基的组成、培养的温度、时间、诱导物质的添加等条件可由本领域技术人员按照已知的方法来确定，使转化体生长，高效率地产生上述蛋白。另外，例如在将抗生素抗性基因整合到表达载体中作为选择标志物的情况下，通过在培养基中加入抗生素，可以选择转化体。然后，通过将宿主所表达的上述蛋白通过自身已知的适当方法进行纯化，得到pam识别变得广泛的cas9蛋白。对宿主没有特别限定，可以列举：动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、或大肠杆菌、枯草杆菌、酵母等微生物。<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白-向导rna复合物>在一个实施方式中，本发明提供蛋白-rna复合物，该复合物具备：上述的<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白>中所示的蛋白和向导rna，所述向导rna包含多核苷酸，该多核苷酸由与靶双链多核苷酸中的pam(前间隔序列邻近基序，proto-spaceradjacentmotif)序列的从1个碱基上游到20个碱基以上且24个碱基以下上游的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成。根据本实施方式的蛋白-rna复合物，pam序列变得广泛，可以简便且快速、并且针对靶序列进行位点特异性的靶双链多核苷酸的编辑。上述蛋白和上述向导rna通过在体外和体内、在温和的条件下混合，可以形成蛋白-rna复合物。温和的条件表示蛋白不会分解或变性的程度的温度和ph，温度优选4℃以上且40℃以下，ph优选4以上且10以下。另外，混合上述蛋白和上述向导rna进行培养的时间优选0.5小时以上且1小时以下。由上述蛋白和上述向导rna形成的复合物稳定，即使在室温下静置数小时也可保持稳定性。<crispr-cas载体系统>在一个实施方式中，本发明提供crispr-cas载体系统，该载体系统具备第1载体和第2载体，所述第1载体包含编码上述的<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白>中所示的蛋白的基因，所述第2载体包含向导rna，该向导rna包含由与靶双链多核苷酸中的pam序列的从1个碱基上游到20个碱基以上且24个碱基以下上游的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的多核苷酸。根据本实施方式的crispr-cas载体系统，可以简便且快速、并且针对靶序列进行位点特异性的靶双链多核苷酸的编辑。关于向导rna，只要适当设计在5’末端区域包含多核苷酸的向导rna即可，所述多核苷酸由与靶双链多核苷酸中的pam序列的从1个碱基上游到优选20个碱基以上且24个碱基以下、更优选22个碱基以上且24个碱基以下的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成。该向导rna可以进一步包含1个以上的多核苷酸，所述多核苷酸由可获得发夹结构的核苷酸序列构成，该核苷酸序列由与靶双链多核苷酸不互补的核苷酸序列构成，并排列成以一点为轴对称性地互补的序列。本实施方式的载体优选为表达载体。对表达载体没有特别限定，例如可以使用：pbr322、pbr325、puc12、puc13等来自大肠杆菌的质粒；pub110、ptp5、pc194等来自枯草杆菌的质粒；psh19、psh15等来自酵母的质粒；λ噬菌体等噬菌体；腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、牛痘病毒、杆状病毒等病毒；以及修饰这些载体而得到的载体等。在上述的表达载体中，对用于表达上述cas9蛋白和上述向导rna的启动子没有特别限定，例如可以使用：ef1α启动子、srα启动子、sv40启动子、ltr启动子、cmv(巨细胞病毒)启动子、hsv-tk启动子等用于在动物细胞中表达的启动子；花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子、ref(橡胶延伸因子，rubberelongationfactor)启动子等用于在植物细胞中表达的启动子；多角体蛋白启动子、p10启动子等用于在昆虫细胞中表达的启动子等。这些启动子可以根据上述cas9蛋白和上述向导rna、或者根据表达上述cas9蛋白和上述向导rna的细胞的种类而适当选择。上述的表达载体可以进一步具有多克隆位点、增强子、剪接信号、添加了聚a的信号、选择标志物、复制起点等。<用于位点特异性地修饰靶双链多核苷酸的方法>[第1实施方式]在一个实施方式中，本发明提供用于位点特异性地修饰靶双链多核苷酸的方法，该方法具备以下步骤：将靶双链多核苷酸、蛋白和向导rna混合进行培养的步骤；以及上述蛋白在位于pam序列上游的结合位点修饰上述靶双链多核苷酸的步骤，上述靶双链多核苷酸具有由nngnnn(n是指任意碱基，g是指鸟嘌呤)构成的pam序列，上述蛋白为上述的<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白>中所示的蛋白，上述向导rna包含多核苷酸，所述多核苷酸由与上述靶双链多核苷酸中的上述pam序列的从1个碱基上游到20个碱基以上且24个碱基以下上游的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成。根据本实施方式的方法，通过使用pam序列变得广泛的突变型cas9蛋白，可以简便且快速、并且针对靶序列进行位点特异性地修饰靶双链多核苷酸。在本实施方式中，靶双链多核苷酸只要具有由nngnnn(n是指任意碱基，g是指鸟嘌呤)构成的pam序列即可，没有特别限定。在本实施方式中，关于蛋白和向导rna，如上述的<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白>中所示。以下，对用于位点特异性地修饰靶双链多核苷酸的方法的细节进行说明。首先，在温和的条件下混合上述蛋白和上述向导rna，并进行培养。温和的条件如上所述。进行培养的时间优选0.5小时以上且1小时以下。由上述蛋白和上述向导rna形成的复合物稳定，即使在室温下静置数小时也可保持稳定性。接下来，上述蛋白和上述向导rna在上述靶双链多核苷酸上形成复合物。上述蛋白识别pam序列，在位于pam序列上游的结合位点与上述靶双链多核苷酸结合。在上述蛋白具有核酸内切酶活性的情况下在该位点切割该多核苷酸。上述cas9蛋白识别pam序列，以pam序列为起点，剥离上述靶双链多核苷酸的双螺旋结构，和上述向导rna中的与上述靶双链多核苷酸互补的核苷酸序列退火，从而使上述靶双链多核苷酸的一部分双螺旋结构解开。此时，上述cas9蛋白在位于pam序列上游的切割位点和位于与pam序列互补的序列的上游的切割位点，切割上述靶双链多核苷酸的磷酸二酯键。[第2实施方式]在本实施方式中，在培养步骤之前，可以进一步具备下述表达步骤：使用上述的crispr-cas载体系统，使上述的<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白>中所示的蛋白和向导rna表达。在本实施方式的表达步骤中，首先，使用上述的crispr-cas载体系统使cas9蛋白和向导rna表达。作为使之表达的具体方法，分别使用包含编码cas9蛋白的基因的表达载体和包含向导rna的表达载体来转化宿主。然后，培养该宿主，使cas9蛋白和向导rna表达。培养基的组成、培养的温度、时间、诱导物质的添加等条件可由本领域技术人员按照已知的方法确定，使转化体生长，高效率地产生融合蛋白。另外，例如在将抗生素抗性基因整合到表达载体中作为选择标志物的情况下，通过在培养基中加入抗生素，可以选择转化体。然后，通过利用适当的方法纯化宿主所表达的cas9蛋白和向导rna，获得cas9蛋白和向导rna。<用于位点特异性地修饰靶双链核苷酸的方法>[第1实施方式]在一个实施方式中，本发明提供用于位点特异性地修饰靶双链多核苷酸的方法，该方法具备以下步骤：将靶双链多核苷酸、蛋白和向导rna混合进行培养的步骤；上述蛋白在位于pam序列上游的结合位点与上述靶双链多核苷酸结合的步骤；以及在通过上述向导rna与上述靶双链多核苷酸的互补性结合确定的区域获得被修饰的上述靶双链多核苷酸的步骤，上述蛋白为上述的<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白>中所示的蛋白，上述向导rna包含多核苷酸，所述多核苷酸由与上述靶双链多核苷酸中的上述pam序列的从1个碱基上游到20个碱基以上且24个碱基以下上游的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成。根据本实施方式的方法，通过使用与向导rna的结合能力和切割活性有所提高的rna诱导性dna核酸内切酶，可以简便且快速、并且针对靶序列进行位点特异性地修饰靶双链多核苷酸。在本实施方式中，关于靶双链多核苷酸、蛋白和向导rna，如上述的<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白>和<用于位点特异性地修饰靶双链多核苷酸的方法>中所示。以下，对用于位点特异性地修饰靶双链多核苷酸的方法的细节进行说明。直到与靶双链多核苷酸位点特异性地结合为止的步骤与上述的<用于位点特异性地切割靶双链多核苷酸的方法>中所示的步骤同样。然后，在通过上述向导rna与上述双链多核苷酸的互补性结合确定的区域可以获得根据目的施行了修饰的靶双链多核苷酸。在本说明书中，“修饰”是指靶双链多核苷酸的核苷酸序列发生变化。例如，除了通过靶双链多核苷酸的切割、切割后的外源性序列的插入(物理性插入或经由同源定向修复的复制进行的插入)而引起的靶双链多核苷酸的核苷酸序列的变化、切割后的非同源末端连接(nhej：通过切割产生的dna末端彼此再次结合)以外，还可以列举通过添加功能性的蛋白或核苷酸序列而引起的靶双链多核苷酸的核苷酸序列的变化等。通过本实施方式中的靶双链多核苷酸的修饰，可以向靶双链多核苷酸中导入突变，或者可以破坏、改变靶双链多核苷酸的功能。[第2实施方式]在本实施方式中，在培养步骤之前，可以进一步具备下述的表达步骤：使用上述的crispr-cas载体系统，使上述的<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白>中所示的蛋白和向导rna表达。在本实施方式的表达步骤中，首先，使用上述的crispr-cas载体系统使cas9蛋白和向导rna表达。作为使之表达的具体方法，与上述的<用于位点特异性地修饰靶双链多核苷酸的方法>的[第2实施方式]中例示的方法同样。<用于在细胞内位点特异性地修饰靶双链多核苷酸的方法>在一个实施方式中，本发明提供用于在细胞内位点特异性地修饰靶双链多核苷酸的方法，该方法具备以下步骤：将上述的crispr-cas载体系统导入到细胞中，使上述的<pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白>中所示的蛋白和向导rna表达的表达步骤；上述蛋白在位于pam序列上游的结合位点与上述靶双链多核苷酸结合的步骤；以及在通过上述向导rna与上述靶双链多核苷酸的互补性结合确定的区域获得被修饰的上述靶双链多核苷酸的步骤，上述向导rna包含多核苷酸，所述多核苷酸由与上述靶双链多核苷酸中的上述pam序列的从1个碱基上游到20个碱基以上且24个碱基以下上游的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成。在本实施方式的表达步骤中，首先，使用上述的crispr-cas载体系统使cas9蛋白和向导rna在细胞内表达。作为本实施方式的方法的应用对象的细胞的来源的生物，例如可以列举：原核生物、酵母、动物、植物、昆虫等。对上述动物没有特别限定，例如可以列举：人、猴、狗、猫、兔、猪、牛、小鼠、大鼠等，不限于这些。另外，作为细胞来源的生物的种类，可以根据所期望的靶双链多核苷酸的种类、目的等任意选择。作为本实施方式的方法的应用对象的动物来源的细胞，例如可以列举：生殖细胞(精子、卵子等)、构成生物体的体细胞、干细胞、前体细胞、由生物体分离的癌细胞、由生物体分离并获得永生化能力而在体外稳定维持的细胞(细胞株)、由生物体分离且人为地进行了基因修饰的细胞、由生物体分离且人为地交换了核的细胞等，不限于这些。作为构成生物体的体细胞，例如可以列举：由皮肤、肾脏、脾脏、腎上腺、肝脏、肺、卵巢、胰腺、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液、心脏、眼、脑、神经组织等任意的组织采集的细胞等，不限于这些。作为体细胞，更具体而言，例如可以列举：成纤维细胞、骨髄细胞、免疫细胞(例如，b淋巴细胞、t淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等)、红细胞、血小板、骨细胞、骨髄细胞、周皮细胞(周细胞)、树突状细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、肝细胞、胰岛细胞(例如，α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、pp细胞等)、软骨细胞、卵丘细胞、胶质细胞、神经细胞(神经元)、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心肌细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如，平滑肌细胞、骨骼肌细胞等)、黑色素细胞、单核细胞等，不限于这些。干细胞是指兼具自身复制能力和分化成其他多个系统的细胞的能力的细胞。作为干细胞，例如可以列举：胚胎干细胞(es细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工多能性干细胞(ips细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰干细胞、肌肉干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞等，但不限于这些。癌细胞是指由体细胞衍生而获得无限增殖能力的细胞。作为癌细胞来源的癌，例如可以列举：乳腺癌(例如，浸润性乳腺管癌、非浸润性乳腺管癌、炎症性乳腺癌等)、前列腺癌(例如，激素依赖性前列腺癌、激素非依赖性前列腺癌等)、胰腺癌(例如，胰腺管癌等)、胃癌(例如，乳头状腺癌、粘液性腺癌、腺鳞癌等)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤等)、结肠癌(例如，胃肠道间质肿瘤等)、直肠癌(例如，胃肠道间质肿瘤等)、大肠癌(例如，家族性大肠癌、遗传性非息肉病性大肠癌、胃肠道间质肿瘤等)、小肠癌(例如，非霍奇金氏淋巴瘤、胃肠道间质肿瘤等)、食道癌、十二指肠癌、舌癌、咽癌(例如，鼻咽癌(上咽癌)、口咽癌、下咽癌等)、头颈部癌、唾液腺癌、脑肿瘤(例如，松果体星形细胞瘤、毛细胞性星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤等)、神经鞘瘤、肝癌(例如，原发性肝癌、肝外胆管癌等)、肾癌(例如，肾细胞癌、肾盂与输尿管的移行上皮癌等)、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌(例如，上皮性卵巢癌、性腺外胚细胞肿瘤、卵巢性胚细胞肿瘤、卵巢低度恶性肿瘤等)、膀胱癌、尿道癌、皮肤癌(例如，眼内(眼)黑色素瘤、merkel(梅克尔)细胞癌等)、血管瘤、恶性淋巴瘤(例如，网状细胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病等)、黑色素瘤(恶性黑色素瘤)、甲状腺癌(例如，甲状腺髓样癌等)、甲状旁腺癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、骨肿瘤(例如，骨肉瘤、尤文氏肿瘤(尤文氏肉瘤)、子宫肉瘤、软组织肉瘤等)、转移性髓母细胞瘤、血管纤维瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、视网膜肉瘤、阴茎癌、睾丸肿瘤、儿童实体瘤(癌)(例如，威尔姆氏肿瘤、儿童肾脏肿瘤等)、卡波西肉瘤、因aids引起的卡波西肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、慢性骨髄增殖性疾病、白血病(例如，急性骨髄性白血病、急性淋巴母细胞白血病等)等，不限于这些。细胞株是指在生物体外通过人为操作获得了无限增殖能力的细胞。作为细胞株，例如可以列举：hct116、huh7、hek293(人胎肾细胞)、hela(人子宫颈癌细胞株)、hepg2(人肝癌细胞株)、ut7/tpo(人白血病细胞株)、cho(中国仓鼠卵巢细胞株)、mdck、mdbk、bhk、c-33a、ht-29、ae-1、3d9、ns0/1、jurkat、nih3t3、pc12、s2、sf9、sf21、highfive、vero等，不限于这些。作为向细胞内导入crispr-cas载体系统的方法，可以通过适合于所使用的活细胞的方法来进行，可以列举：电穿孔法、热休克法、磷酸钙法、脂质转染法、deae葡聚糖法、微注射法、粒子枪法、使用了病毒的方法、或者使用了fugene(注册商标)6转染试剂(transfectionreagent)(roche公司制造)、转染胺(lipofectamine)2000试剂(invitrogen公司制造)、转染胺ltx试剂(invitrogen公司制造)、转染胺3000试剂(invitrogen公司制造)等市售的转染试剂的方法等。然后，关于修饰步骤，与上述的<用于位点特异性地修饰靶双链核苷酸的方法>的[第1实施方式]中所示的方法同样。通过本实施方式中的靶双链多核苷酸的修饰，可以获得向靶双链多核苷酸中导入了突变、或者靶双链多核苷酸的功能已被破坏、改变的细胞。作为本发明的突变型cas9蛋白，在使用不具有核酸内切酶活性的方案的情况下，该蛋白虽然可以在位于pam序列上游的结合位点与上述靶双链多核苷酸结合，但停留在此而无法进行切割。因此，例如若使该蛋白与荧光蛋白(例如gfp)等标记蛋白融合，则可经由向导rna-突变型cas9蛋白使标记蛋白与靶双链多核苷酸结合。通过适当选择与突变型cas9蛋白结合的物质，可以对靶双链多核苷酸赋予各种各样的功能。而且，可以在突变型cas9蛋白的n末端或c末端连接转录调控因子蛋白或结构域。作为转录调控因子或其结构域，可以列举：转录激活因子或其结构域(例如，vp64、nf-κbp65)和转录沉默子或其结构域(例如，异染色质蛋白1(hp1))或转录抑制因子或其结构域(例如，kruppel相关盒(krab)、erf阻遏域(erd)、msin3a相互作用结构域(sid))。还可以连接修饰dna的甲基化状态的酶(例如，dna甲基转移酶(dnmt)、tet)或修饰组蛋白亚单位的酶(例如，组蛋白乙酰转移酶(hat)、组蛋白脱乙酰酶(hdac)、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶)。<基因治疗>在一个实施方式中，本发明提供用于实行基因组编辑、进行基因治疗的方法和组合物。与以前已知的靶向化的基因重组方法相比，本实施方式的方法的实行有效且廉价，而且可适合于任意的细胞或生物。细胞或生物的双链核酸的任意片段可以通过本实施方式的基因治疗方法进行修饰。本实施方式的基因治疗方法利用在所有细胞中均为内在的同源重组工艺和非同源重组工艺两者。本说明书中，“基因组编辑”是指，通过利用crispr/cas9系统或转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，talen)等技术实行已靶向化的基因重组或已靶向化的突变，进行特异性的基因破坏或报道基因的敲入等新的基因修饰技术。另外，在一个实施方式中，本发明提供：进行已靶向化的dna插入或已靶向化的dna缺失的基因治疗方法。该基因治疗方法包括：使用包含供体dna的核酸构建物来转化细胞的步骤。关于与靶基因切割后的dna插入和dna缺失相关的图解，本领域技术人员可以按照已知的方法确定。另外，在一个实施方式中，本发明提供基因治疗方法：该方法在体细胞和生殖细胞中均被利用，于特定的基因座进行基因操作。另外，在一个实施方式中，本发明提供：用于在体细胞内破坏基因的基因治疗方法。这里，基因过度表达对细胞或生物有害的产物，并表达对细胞或生物有害的产物。这样的基因能够在疾病中所产生的1个以上的细胞型中过度表达。通过本实施方式的基因治疗方法进行的上述过度表达的基因的破坏，可以对患有由上述过度表达的基因引起的疾病的个体带来更好的健康。即，细胞的微小比例的基因的破坏起作用，表达水平降低，产生治疗效果。另外，在一个实施方式中，本发明提供：用于在生殖细胞内破坏基因的基因治疗方法。特定的基因被破坏的细胞可有效用于制作不具有特定的基因的功能的生物。在上述基因被破坏的细胞中，基因可以完全敲除。该特定细胞中的功能的缺失能够具有治疗效果。另外，在一个实施方式中，本发明提供：插入编码基因产物的供体dna的基因治疗方法。该基因产物在构成性地表达的情况下具有治疗效果。例如可以列举下述方法：为了在胰细胞的个体组中引起活性启动子和编码胰岛素基因的供体dna的插入，而在患有糖尿病的个体中插入上述供体dna。然后，包含上述供体dna的胰细胞的上述个体组可以生成胰岛素，对糖尿病患者进行治疗。而且，将上述供体dna插入作物中，可以生成药剂相关基因产物。蛋白产物的基因(例如，胰岛素、脂肪酶或血红蛋白)可以和调控元件(组成型活性启动子、或诱导型启动子)一起插入到植物中，在植物中生成大量的药物。然后，可从植物中分离这样的蛋白产物。转基因植物或转基因动物可以通过使用核酸移入技术(mccreath,k.j.等人(2000)nature405:1066-1069；polejaeva,i.a.等人,(2000)nature407：86-90)的方法进行制作。组织型特异性载体或细胞型特异性载体可以为了仅在所选择的细胞内提供基因表达而利用。另外，在将上述方法用于生殖细胞的情况下，可以在靶基因中插入供体dna，通过之后的所有的细胞分裂，生成具有所设计的遗传变更的细胞。作为本实施方式的基因治疗方法的应用对象，例如可以列举：任意的生物、培养细胞、培养组织、培养核(在完整的培养细胞、培养组织或培养核中包含可用于再生生物的细胞、组织或核)、配子(例如，发育的各种阶段的卵或精子)等，并不限于这些。作为本实施方式的基因治疗方法的应用对象的细胞的来源，可以列举任意的生物(可以列举昆虫、真菌、啮齿类、牛、绵羊、山羊、鸡和其他的农业上重要的动物、以及其他哺乳动物(例如可以列举狗、猫和人，但并不限于这些)，并不限于这些)等，并不限于这些。本实施方式的基因治疗方法可以进一步在植物中使用。对作为本实施方式的基因治疗方法的应用对象的植物没有特别限定，可以在任意的各种植物种(例如，单子叶植物或双子叶植物等)中应用。以下，给出实施例，以更详细地说明本发明，但这些实施例并不限定本发明的范围。实施例实施例1：突变型sacas9的dna切割活性评价1.野生型和突变型sacas9的调制(1)结构体(construct)的设计将通过基因合成使密码子最优化的野生型或突变型sacas9基因整合到pesumo载体(novagen)中。而且，在his标记物与sacas9基因之间添加tev识别序列。在由完成的结构体表达的cas9的n末端连接6残基的组氨酸(his标记物)，形成添加有tev蛋白酶识别位点的设计。所使用的sacas9基因的核苷酸序列如下。・野生型sacas9的核苷酸序列：seqidno:1；・突变型sacas9(v11_e782k_l800r_a889r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在seqidno:1的核苷酸序列中将2344-2346位的gag变换成aaa、2398-2400位的ctg变换成cgt、2665-2667位的gcc变换成cgt、2902-2904位的aac变换成cgt、2953-2955位的aac变换成gcg、2956-2958位的aat变换成gcg、2962-2964位的ctg变换成cac、2971-2973位的cgc变换成gcg、3061-3063位的gcc变换成tct而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11a(+n785w)_e782k_n785w_l800r_a889r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2353-2355位的aat变换成tgg而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11b(+n785y)_e782k_n785y_l800r_a889r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2353-2353位的aat变换成tat而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11c(+n785s)_e782k_n785s_l800r_a889r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2353-2353位的aat变换成agc而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11d(+n888h)_e782k_l800r_n888h_a889r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2362-2364位的aat变换成cat而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11e(+n888r)_e782k_l800r_n888r_a889r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2362-2364位的aat变换成cgt而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11f(n985s)_e782k_l800r_a889r_n968r_n985s_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v11的核苷酸序列中将2953-2955位的gcg变换成tct而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11g(n985v)_e782k_l800r_a889r_n968r_n985v_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v11的核苷酸序列中将2953-2955位的gcg变换成gtg而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11h(n985l)_e782k_l800r_a889r_n968r_n985l_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v11的核苷酸序列中将2953-2955位的gcg变换成ctg而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11i(n985m)_e782k_l800r_a889r_n968r_n985m_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v11的核苷酸序列中将2953-2955位的gcg变换成atg而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11j(n985i)_e782k_l800r_a889r_n968r_n985i_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v11的核苷酸序列中将2953-2955位的gcg变换成att而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11k(+n995r)_e782k_l800r_a889r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_n995r_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2983-2985位的aat变换成cgt而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11l(+n995k)_e782k_l800r_a889r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_n995k_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2983-2985位的aat变换成aaa而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11m(+k910r)_e782k_l800r_a889r_k910r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2728-2730的aag变换成cgt而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11n(a889a)_e782k_l800r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v11的核苷酸序列中将2665-2667位的cgt变换成gcg(恢复成野生型)而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11o(a889a_+t927k)_e782k_l800r_t927k_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v11的核苷酸序列中将2665-2667位的cgt变换成gcg(恢复成野生型)、并进一步将2779-2781位的act变换成aaa而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11p(a889a_+t927k_+k929a)_e782k_l800r_t927k_k929a_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v11的核苷酸序列中将2665-2667位的cgt变换成gcg(恢复成野生型)、并进一步将2779-2781位的act变换成aaa、将2785-2787位的aag变换成gcg而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11q(a889a_+k929r)_e782k_l800r_k929r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v11的核苷酸序列中将2665-2667位的cgt变换成gcg(恢复成野生型)、并将2785-2787位的aag变换成cgt而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11r(+t927k)_e782k_l800r_a889r_t927k_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2779-2781位的act变换成aaa而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11s(+k929r)_e782k_l800r_a889r_k929r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2785-2787位的aag变换成cgt而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v11t(k929a)_e782k_l800r_a889r_t927a_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v11的核苷酸序列进一步将2785-2787位的aag变换成gcg而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v12_e782k_l800r_n888k_a889r_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在seqidno:1的核苷酸序列中将2344-2346位的gag变换成aaa、2398-2400位的ctg变换成cgt、2662-2664位的aat变换成aaa、2665-2667位的gcc变换成cgt、2902-2904位的aac变换成cgt、2953-2955位的aac变换成gcg、2956-2958位的aat变换成gcg、2962-2964位的ctg变换成cac、2971-2973位的cgc变换成gcg、3061-3063位的gcc变换成tct而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v15_e782k_l800r_t927k_k929n_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在seqidno:1的核苷酸序列中将2344-2346位的gag变换成aaa、2398-2400位的ctg变换成cgt、2779-2781位的act变换成aaa、2785-2787位的aag变换成aac、2902-2904位的aac变换成cgt、2953-2955位的aac变换成gcg、2956-2958位的aat变换成gcg、2962-2964位的ctg变换成cac、2971-2973位的cgc变换成gcg、3061-3063位的gcc变换成tct而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v15a(+n785s)_e782k_n785s_l800r_t927k_k929n_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v15的核苷酸序列进一步将2353-2355位的aat变换成agc而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v15b(+n888h)_e782k_l800r_n888h_t927k_k929n_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v15的核苷酸序列进一步将2662-2664位的aat变换成cat而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v15c(+n888k)_e782k_l800r_n888k_t927k_k929n_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v15的核苷酸序列进一步将2662-2664位的aat变换成aaa而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v15d(+a889s)_e782k_l800r_a889s_t927k_k929n_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：相对于v15的核苷酸序列进一步将2665-2667位的gcg变换成tct而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v15e(k929l)_e782k_l800r_t927k_k929l_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v15的核苷酸序列中将2785-2787位的aac变换成ctg而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v15f(n929i)_e782k_l800r_t927k_n929i_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在v15的核苷酸序列中将2785-2787位的aac变换成atc而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v16_e782k_l800r_a889n_t927k_k929n_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在seqidno:1的核苷酸序列中将2344-2346位的gag变换成aaa、2398-2400位的ctg变换成cgt、2665-2667位的gcc变换成aac、2779-2781位的act变换成aaa、2785-2787位的aag变换成aac、2902-2904位的aac变换成cgt、2953-2955位的aac变换成gcg、2956-2958位的aat变换成gcg、2962-2964位的ctg变换成cac、2971-2973位的cgc变换成gcg、3061-3063位的gcc变换成tct而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v17_e782k_l800r_t927k_k929d_n968r_n985a_n986a_l988h_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在seqidno:1的核苷酸序列中将2344-2346位的gag变换成aaa、2398-2400位的ctg变换成cgt、2779-2781位的act变换成aaa、2785-2787位的aag变换成gat、2902-2904位的aac变换成cgt、2953-2955位的aac变换成gcg、2956-2958位的aat变换成gcg、2962-2964位的ctg变换成cac、2971-2973位的cgc变换成gcg、3061-3063位的gcc变换成tct而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v43_e782k_l800r_t927k_k929n_n968r_n985a_r991a_a1021s)的核苷酸序列：在seqidno:1的核苷酸序列中将2344-2346位的gag变换成aaa、2398-2400位的ctg变换成cgt、2779-2781位的act变换成aaa、2785-2787位的aag变换成aac、2902-2904位的aac变换成cgt、2953-2955位的aac变换成gcg、2971-2973位的cgc变换成gcg、3061-3063位的gcc变换成tct而得到的核苷酸序列。・突变型sacas9(v51_e782k_l800r_t927k_k929n_n968r_n985a_r991a_a1021s_i1017f)的核苷酸序列：在v43的核苷酸序列中将3049-3051位的atc变换成ttc而得到的核苷酸序列。(2)将所制作的载体转化到大肠杆菌escherichiacolirosetta2(de3)株中。之后，使用含有20μg/ml的卡那霉素的lb培养基进行培养。在培养直至od=0.8的时间点添加作为表达诱导剂的异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside：iptg)(终浓度为0.5mm)，在20℃下培养20小时。培养后，通过离心(8,000g、10分钟)回收大肠杆菌。(3)野生型和突变型sacas9的纯化将(2)中回收的菌体用缓冲液a悬浮，进行超声波破碎。通过离心(25,000g、30分钟)回收上清，与用缓冲液a平衡化的mg-his珠粒混合，平稳地混合1小时。回收未吸附组分，之后用缓冲液a洗涤1次。用高盐浓度缓冲液b洗涤1次，之后，用高浓度缓冲液a洗涤1次。最终，用高咪唑浓度缓冲液c洗脱目标蛋白。缓冲液a～c的组成如下所示。缓冲液a：20mm的tris-hcl、ph8.0、300mm的nacl、20mm的咪唑；缓冲液b：20mm的tris-hcl、ph8.0、1000mm的nacl、20mm的咪唑；缓冲液c：20mm的tris-hcl、ph8.0、300mm的nacl、300mm的咪唑。2.向导rna的调制进行了插入有目标向导rna序列的载体的制作。在向导rna序列的上游添加t7启动子序列，整合到已形成线状的puc119载体(takara)中。根据所制作的载体，使用pcr制作了体外转录反应的模板dna。使用该模板dna，在37℃下进行了4小时的t7rna聚合酶的体外转录反应。转录产物通过rneasy进行纯化。由向导序列和支架部分构成的核苷酸序列见seqidno:3。3.质粒dna切割活性测定试验进行了插入有靶dna序列和pam序列(5’-nngaaa-3’)的载体的制作，以便在dna切割活性测定试验中使用。在靶dna序列中分别添加pam序列，整合到已形成线状的puc119载体中(seqidno:4)。使用所制作的载体转化大肠杆菌mach1株(lifetechnologies)，用含有20μg/ml的氨苄青霉素的lb培养基，在37℃下进行了培养。培养后，通过离心(8,000g、1分钟)回收菌体，使用qiaprepspinminiprep试剂盒(qiagen)纯化了质粒dna。使用添加有已纯化的pam序列的靶质粒dna，进行了切割实验。质粒dna通过限制酶形成1根线状。若野生型或突变型的sacas9切割该线状化dna中的靶dna序列，则可产生约1,000bp和约2,000bp的切割产物。作为切割时的缓冲液，使用了下述组成的裂解缓冲液b。裂解缓冲液b(×10)的组成200mm的hepes7.5；1000mm的kcl；50%的甘油；10mm的dtt；5mm的edta；20mm的mgcl2。使用1%浓度的琼脂糖凝胶对反应后的样品进行电泳，确认了切割产物的谱带。结果见图1～3。实施例2：突变型sacas9的pam序列嗜好性的确认作为突变型sacas9，使用实施例1中调制的各突变型和野生型sacas9，进行与实施例1同样的操作，研究切割活性，确认了对各种pam序列的嗜好性。pam序列1～4见表1。[表1]核苷酸序列pam序列15’-nngaaa-3’pam序列25’-nngttt-3’pam序列35’-nngggg-3’pam序列45’-nngccc-3’在野生型sacas9中对靶质粒dna具有受限制的切割活性，相对于此，在突变型sacas9中确认到对靶质粒dna的切割活性的限制得到改善(图4-1、图4-2)。使用野生型sacas9(sacas9wt)和突变型sacas9(sacas9v15)，进行与实施例1同样的操作，改变处理时间，研究对靶质粒dna的切割活性，确认了对各种pam序列的嗜好性。关于pam序列，除了表1中记载的pam序列1～4以外，还对5’-nngaat-3’进行了研究(pam序列5)。结果见图4-3。sacas9wt在pam序列4中在任一处理时间几乎均未见切割活性，但在saca9v15中通过一定时间以上的处理也确认到对pam序列4的切割活性。另外，在其他的作为突变型sacas9的sacas9v51中，即使在更短的处理时间也确认到对pam序列4(这里是5’-ttgccc-3’)的切割活性(图4-4)。实施例31.真核细胞中的靶基因切割活性的验证(1)结构体的设计将通过基因合成使密码子最优化的野生型或突变型sacas9基因整合到cp-lvc9nu-09载体(genocopia)的bglii/xhoi位点。另外，为了以hprt和emx1基因中的多个序列为靶，将向导rna分别整合到pcrispr-lvsg03(genocopia)载体的bsmb1位点，制作了各种向导rna表达质粒。表2中显示各向导rna表达质粒的构成。[表2-1][表2-2][表2-3][表2-4][表2-5][表2-6](2)在hek细胞中的表达在24孔板中使用脂质转染胺(lipofectamine2000)将所制作的250ng的两种sacas9表达载体lvnuc9-09sacas9(野生型(wt)、pam-柔性变体(pf))和向导rna表达质粒(lvsg03sgrna)转化到hek株中。培养1天后，在培养基中添加1μg/ml的嘌呤霉素，第4天回收了细胞。(3)pcr使用guide-ittm突变检测试剂盒(631448)(clontech)的提取缓冲液1和2，由所回收的细胞调制了样品。然后，使用q5(注册商标)hotstarthigh-fidelity2xmastermix(m0494)(neb)实施了pcr。详细的pcr条件如下。・hprtpcr引物(扩增子大小：468bps)正向引物：tacacgtgtgaaccaacccg(seqidno:31)；反向引物：gtaaggccctcctcttttattt(seqidno:32)；・emx1区apcr引物(扩增子大小：643bps)正向引物：agtttctcatctgtgcccctcc(seqidno:33)；反向引物：ctgaacgcgtttgctctaccag(seqidno:34)；・emx1区bpcr引物(扩增子大小:732bps)正向引物：tttcacttgggtgccctagg(seqidno:35)；反向引物：ccctcttgccagaacttcc(seqidno:36)；・循环条件预变性(initialdenaturation)：98℃、30秒；35个循环：98℃(5秒)、63℃(20秒)、72℃(20秒)；最终延伸反应：72℃、2分钟；保持：4-10℃。(4)t7核酸内切酶i处理将所得的pcr产物进行热变性，再次进行了退火。对于将所得的反应物用t7核酸内切酶i(t7enconucleasei(m0302))进行处理而得到的样品，使用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，确认了切割产物的谱带。结果见图5(图5-1～5-6)。实施例4：cas9突变体的脱靶分析(方法)1.克隆使用dsacas9(在seqidno:2所表示的氨基酸序列中将10位的天冬氨酸取代成丙氨酸、并将580位的天冬酰胺取代成丙氨酸而得到的蛋白：也称作dsacas9(d10a，n580a))和向其中导入突变而制作的突变型dsacas9进行了脱靶分析。dsacas9是向野生型sacas9中导入无效突变而得到的蛋白。将在两端连接有核定位信号(nls)的dsacas9(d10a、n580a)蛋白的c末端连接了krab-p2a-puro的突变型dsacas9的基因构建物整合到px601载体中(f.annran等人,nature2015;520(7546);第186-191页)。突变型dsacas9是使用实施例1中制作的突变型sacas9(v15)或突变型sacas9(v51)代替野生型sacas9、并导入无效突变(d10a、n580a)而制作的。wt-dsacas9-krab(seqidno:37和seqidno:38；图6)；pf(v15)-dsacas9(d10a,n580a)-krab(seqidno:39和seqidno:40；图7)；pf(v51)-dsacas9(d10a,n580a)-krab(seqidno:41和seqidno:42；图8)。2.sgrna(单一分子向导rna)序列的选择和克隆根据通过benchling软件(www.benchling.com)得到的预测的在靶标(ontarget)和非靶标(offtarget，脱靶)评分，选择了标靶kras基因的向导序列。该序列位于通过ucsc基因组浏览器(人grch38/hg38装配)公开的chr12:25,249,500-25,253,000区域内。由于pam序列发生变更，所以与wt-dsacas9(#1、2、3)具有互换性的向导rna不同于与pf(v15)-dsacas9(#4、5、6)具有互換性的向导rna。3个对照rna向导(c1、c2、c3)选自人crispr敲除混合文库(humancrisprknockoutpooledlibrary)(sanjanan等人,natmethods.2014aug;11(8):783-784.)。填充序列(stuffersequence)是在克隆前的效应质粒中事先存在向导rna的核苷酸序列，起到其他的对照向导rna序列的作用。使所有的向导rna与示踪rna序列融合，制作sgrna，如下所述克隆到效应载体中：px601-aio-cmv-wt-dsacas9-puro;#1,2,3,c1,c2,c3,填充序列；px601-aio-cmv-pf(v15)dsacas9-puro;#4,5,6,c1,c2,c3,填充序列；px601-aio-cmv-pf(v51)dsacas9-puro;c1,c2,c3。sgrna表达由u6启动子驱动，为了使sgrna表达细胞的追踪和选择变得容易，构建载体以在p2a启动子下表达嘌呤霉素基因。各sgrna和填充序列的序列信息如下。sgrna-kras#1(wt);gggaaggctggaccgaggcag(seqidno:43)；sgrna-kras#2(wt);cagtccgaaatggcgggggcc(seqidno:44)；sgrna-kras#3(wt);aatcgagctccgagcacaccg(seqidno:45)；sgrna-kras#4(pf-v15);gtgcgggagagaggtacggag(seqidno:46)；sgrna-kras#5(pf-v15);ggagcgagcgcggcgcaggca(seqidno:47)；sgrna-kras#6(pf-v15);cggccgcggcggcggaggcag(seqidno:48)；sgrna-c1;acggaggctaagcgtcgcaa(seqidno:49)；sgrna-c2;cgcttccgcggcccgttcaa(seqidno:50)；sgrna-c3;gtaggcgcgccgctctctac(seqidno:51)；填充序列;gaaacaccggagaccacggcaggtctca(seqidno:52)。3.细胞培养和转染在转染的24小时前以75,000个细胞/孔的密度在24孔板上接种hek293ft细胞，用添加有10%fbs、2mm的新鲜的l-谷氨酰胺、1mm的丙酮酸钠和非必需氨基酸的dmem培养基进行了培养。使用1.5μl的脂质转染胺2000(lifetechnologies)，按照操作说明书将细胞转染到分别包含sgrna中的1种的500ng的px601-cmv-wt-dsacas9-puro、px601-cmv-pf(v15)dsacas9-puro或px601-cmv-pf(v51)dsacas9-puro中。在转染后72小时(1μg/ml的嘌呤霉素选择后48小时)回收细胞，溶解在rlt缓冲液(qiagen)中，使用rneasy试剂盒(qiagen)提取了总rna。4.用于rnaseq分析的样品提取(提出)针对各实验调制双份样品，对每个样品通过genewiz分析了2.5μg的总rna。对rna文库进行聚a选择，然后如genewiz(www.genewiz.com)所示进行测序(illuminahiseq,2×150b.p.,singleindexperlanesequencingconfiguration)，而进行了调制。所有的rna均满足genewiz的qc标准。成为靶的未处理的配对末端读数是每个样品为25m。5.使用splicedtranscriptsalignmenttoareference(star)(http://labshare.cshl.edu/shares/gingeraslab/www-data/dobin/star/star.posix/doc/starmanual.pdf)，将通过标准illumina配对末端测序得到的rawfastq文件与h.sapiensgenomebuild,grch38.第12页(https://useast.ensembl.org/homo_sapiens/info/index)进行了比对。将生物性复制品(biologicalreplicate)分成组，采用使用了处理过的比对数据的deseq2(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/deseq2.html)预先进行了样品间的差异分析(differentialanalysis)。在进行了fkpm数据文件处理的样品中，不具有读数的基因组、表达以平均计小于1.0读数的基因和具有小的转录物(micrornas或snors)的基因组均从分析中去除。所有的复制品样品均显示出相关系数>98%。将来自2个复制品的平均表达用于计算各类别的各基因的代表性表达值。使用multiplotstudio软件制作了mva图。x轴显示平均2-类别表达，y轴显示2个类别间的log2倍数变化(log2fold-change)。(结果)可知：与wt-dsacas9相比，pf(v15)-dsacas9更强地抑制kras基因的表达，并且显示出较低的脱靶抑制(图9)。关于wt-dsacas9和pf(v15)-dsacas9分别显示具有kras-sgrna和对照填充sgrna的类别的mva图。x轴显示2-类别表达的平均，y轴显示2个类别间的log2倍数变化。kras基因被具有3个不同的sgrna(sgrna#1、#2和#3)的wtdsacas9和具有3个不同的sgrna(sgrna#4、#5、#6)的pf(v15)-cas9抑制。相对于对照填充sgrna的log2倍数变化抑制如下：-2.261(sgrna#1)、-1.888(sgrna#2)和-2.934(sgrna#3)、-5.041(sgrna#4)、-2.538(sgrna#5)和-2.642(sgrna#6)。pf(v15)-dsacas9显示出更少的脱靶抑制。与对照填充sgrna相比被抑制2倍以上的基因数如下：在wt-dsacas9中为71(sgrna#1)、93(sgrna#2)和57(sgrna#3)，相对于此，在pf(v15)-dsacas9中为38(#4)、23(#5)和35(#6)。研究了pf(v15)和pf(v51)对wt-dsacas9的脱靶抑制效果(图10)。mva图显示针对wt-dsacas9的被pf(v15)和pf(v51)抑制了2倍以上的基因数。使用3个对照sgrna：c1、c2和c3，按照pf(v15)vs.wt和pf(v51)vs.wt进行了比较。pf(v15)对c1、c2和c3分别显示出5、7和7个基因的数目极少的脱靶抑制(超过2倍的抑制)数。pf(v51)对c1、c2和c3分别显示出84、26和16个基因的数目较多的脱靶抑制(超过2倍的抑制)。x轴显示2-类别表达的平均，y轴显示2个类别间的log2倍数变化。产业实用性根据本发明，可以获得在保持与向导rna的结合力的同时pam序列的识别变得广泛的cas9蛋白。与wtcas9蛋白相比，该cas9蛋白具有较强的靶dna结合能力，并且显示出较低的脱靶结合能力。另外，还可以提供利用了上述cas9蛋白的简便且快速的靶序列位点特异性的基因组编辑技术。本申请以在美国申请的美国临时专利申请第62/554,227(申请日为2017年9月5日)、美国临时专利申请第62/668,968(申请日为2018年5月9日)和美国临时专利申请第62/724,981(申请日为2018年8月30日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。<110>东京大学edigene株式会社<120>经修饰的cas9蛋白及其用途<130>092798<150>us62/554227<151>2017-09-05<150>us62/668968<151>2018-05-09<150>us62/724981<151>2018-08-30<160>52<170>patentinversion3.5<210>1<211>3162<212>dna<213>金黄色葡萄球菌<220><221>cds<222>(1)..(3162)<400>1atgaaaaggaactacattctggggctggacatcgggattacaagcgtg48metlysargasntyrileleuglyleuaspileglyilethrserval151015gggtatgggattattgactatgaaacaagggacgtgatcgacgcaggc96glytyrglyileileasptyrgluthrargaspvalileaspalagly202530gtcagactgttcaaggaggccaacgtggaaaacaatgagggacggaga144valargleuphelysglualaasnvalgluasnasngluglyargarg354045agcaagaggggagccaggcgcctgaaacgacggagaaggcacagaatc192serlysargglyalaargargleulysargargargarghisargile505560cagagggtgaagaaactgctgttcgattacaacctgctgaccgaccat240glnargvallyslysleuleupheasptyrasnleuleuthrasphis65707580tctgagctgagtggaattaatccttatgaagccagggtgaaaggcctg288sergluleuserglyileasnprotyrglualaargvallysglyleu859095agtcagaagctgtcagaggaagagttttccgcagctctgctgcacctg336serglnlysleuserglugluglupheseralaalaleuleuhisleu100105110gctaagcgccgaggagtgcataacgtcaatgaggtggaagaggacacc384alalysargargglyvalhisasnvalasngluvalglugluaspthr115120125ggcaacgagctgtctacaaaggaacagatctcacgcaatagcaaagct432glyasngluleuserthrlysgluglnileserargasnserlysala130135140ctggaagagaagtatgtcgcagagctgcagctggaacggctgaagaaa480leugluglulystyrvalalagluleuglnleugluargleulyslys145150155160gatggcgaggtgagagggtcaattaataggttcaagacaagcgactac528aspglygluvalargglyserileasnargphelysthrserasptyr165170175gtcaaagaagccaagcagctgctgaaagtgcagaaggcttaccaccag576vallysglualalysglnleuleulysvalglnlysalatyrhisgln180185190ctggatcagagcttcatcgatacttatatcgacctgctggagactcgg624leuaspglnserpheileaspthrtyrileaspleuleugluthrarg195200205agaacctactatgagggaccaggagaagggagccccttcggatggaaa672argthrtyrtyrgluglyproglygluglyserpropheglytrplys210215220gacatcaaggaatggtacgagatgctgatgggacattgcacctatttt720aspilelysglutrptyrglumetleumetglyhiscysthrtyrphe225230235240ccagaagagctgagaagcgtcaagtacgcttataacgcagatctgtac768proglugluleuargservallystyralatyrasnalaaspleutyr245250255aacgccctgaatgacctgaacaacctggtcatcaccagggatgaaaac816asnalaleuasnaspleuasnasnleuvalilethrargaspgluasn260265270gagaaactggaatactatgagaagttccagatcatcgaaaacgtgttt864glulysleuglutyrtyrglulyspheglnileilegluasnvalphe275280285aagcagaagaaaaagcctacactgaaacagattgctaaggagatcctg912lysglnlyslyslysprothrleulysglnilealalysgluileleu290295300gtcaacgaagaggacatcaagggctaccgggtgacaagcactggaaaa960valasnglugluaspilelysglytyrargvalthrserthrglylys305310315320ccagagttcaccaatctgaaagtgtatcacgatattaaggacatcaca1008progluphethrasnleulysvaltyrhisaspilelysaspilethr325330335gcacggaaagaaatcattgagaacgccgaactgctggatcagattgct1056alaarglysgluileilegluasnalagluleuleuaspglnileala340345350aagatcctgactatctaccagagctccgaggacatccaggaagagctg1104lysileleuthriletyrglnsersergluaspileglnglugluleu355360365actaacctgaacagcgagctgacccaggaagagatcgaacagattagt1152thrasnleuasnsergluleuthrglnglugluilegluglnileser370375380aatctgaaggggtacaccggaacacacaacctgtccctgaaagctatc1200asnleulysglytyrthrglythrhisasnleuserleulysalaile385390395400aatctgattctggatgagctgtggcatacaaacgacaatcagattgca1248asnleuileleuaspgluleutrphisthrasnaspasnglnileala405410415atctttaaccggctgaagctggtcccaaaaaaggtggacctgagtcag1296ilepheasnargleulysleuvalprolyslysvalaspleusergln420425430cagaaagagatcccaaccacactggtggacgatttcattctgtcaccc1344glnlysgluileprothrthrleuvalaspasppheileleuserpro435440445gtggtcaagcggagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatc1392valvallysargserpheileglnserilelysvalileasnalaile450455460atcaagaagtacggcctgcccaatgatatcattatcgagctggctagg1440ilelyslystyrglyleuproasnaspileileilegluleualaarg465470475480gagaagaacagcaaggacgcacagaagatgatcaatgagatgcagaaa1488glulysasnserlysaspalaglnlysmetileasnglumetglnlys485490495cgaaaccggcagaccaatgaacgcattgaagagattatccgaactacc1536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