斑石鲷雄性特异DNA标记及遗传性别鉴定方法与流程

本发明属于水产遗传育种中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术领域，具体涉及一种斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法。

背景技术：

斑石鲷(oplegnathuspunctatus)隶属于鲈形目、石鲷科、石鲷属，俗称斑鲷，黑金鼓。主要分布于中国东海和南海以及周边的日本、朝鲜海域，属温热带近岸中下层鱼类，常栖息于岩礁和珊瑚中，其牙齿尖利，可咬碎贝类、龙虾、海胆等的坚硬外壳，斑石鲷常以垂钓获得，自然资源极其稀少(尤宏争等2016)。斑石鲷肉质细嫩，口感独特，深受消费者的喜爱。其食用与药用价值极高，在日本料理中具有“刺身绝品”之誉。该鱼运输便利、运输成活率高。斑石鲷体态优美，蓝色灯光下如梦如幻，因此又称“梦幻鱼”，极具观赏价值。2014年，山东莱州明波水产有限公司和中国科学院海洋研究所合作在国内首次突破斑石鲷生殖调控及苗种生产技术在山东莱州已成功培育出批量斑石鲷苗种和成鱼。其较高的观赏价值和经济价值，使其成为新兴的鱼类养殖品种。

斑石鲷具有22对常染色体和一组复性染色体(x1、x2和y)，其性别决定机制为(x1x2y)型，遗传雌性为同型性染色体(x1x1x2x2)，遗传雄性为异型染色体(x1x2y)(薛蕊等2016)。自然条件下，雌性斑石鲷产生x1x2型卵子，雄性斑石鲷产生x1x2、y两种精子，受精后得到正常的x1x1x2x2雌性和x1x2y雄性后代。在人工繁育及选择育种过程中，为了获得优质的苗种必须做好亲鱼的雌雄筛选，为了建立家系，必须能准确鉴定斑石鲷的性别。斑石鲷第一次性成熟需要3-4年，在幼苗、鱼种和成鱼时期无法通过外观形态鉴定斑石鲷的性别，限制了斑石鲷人工繁育和良种选育的研究进程。开发斑石鲷性别特异分子标记，建立快速鉴定斑石鲷遗传性别的分子方法是控制雌雄亲本性别比例、鉴定性染色体、研究性别决定和性染色体进化机制的重要手段。

有关斑石鲷性别特异分子标记的筛选和遗传性别鉴定研究，目前国内外尚未见报道。因此，发掘斑石鲷性别特异分子标记，建立一种能采用琼脂糖凝胶电泳方法准确分辨、且可以在养殖场现场应用的斑石鲷遗传性别快速鉴定的分子技术成为斑石鲷养殖产业中亟待攻克的重要课题。

技术实现要素：

本发明通过斑石鲷雌、雄鱼全基因组测序和比对分析，发现了斑石鲷雄性特异的dna标记，即一段雄性y染色体特异的dna片段，并将这个片段应用到斑石鲷遗传性别鉴定。

本发明首先通过三代基因组测序技术完成了斑石鲷雌鱼和雄鱼的全基因组测序，随后通过生物信息学方法比较分析雌鱼和雄鱼基因组序列，发现了两条斑石鲷x(x1或x2)、y染色体同源的差异dna片段，其中y染色体上dna片段长573bp，命名为seqchry，其序列为seqidno:1；

x染色体上dna片段长度为561bp，命名为seqchrx，其序列为seqidno:2；

其中y染色体dna片段比x染色体上的片段多出12个bp，这个片段即为雄性y染色体特有的dna标记。

本发明还提供一种鉴定斑石鲷遗传性别的方法，是通过y染色体和x染色体的上述差异片段来确定性别；

其一种具体的检测方法，是确定待检测的斑石鲷是否存在上述序列为seqidno:1的核苷酸片段；通过pcr引物进行鉴别。

本发明还基于对斑石鲷x、y性染色体的序列进行比较分析，利用y染色体特异的片段，设计了三个引物。采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，判断雌雄个体，准确鉴定斑石鲷遗传性别，上、下游引物序列分别为：

seqxy:1：5′-tatctctctgctctgcctgggta-3′(seqidno:3)；

seqxy:2：5′-acggcaacaaacacacacatcat-3′(seqidno:4)；

seqy:3：5′-gctaggaggagaataacaac-3′(seqidno:5)；

使用上述的引物鉴定斑石鲷遗传性别，主要包括以下步骤：

斑石鲷基因组dna的提取、雄性特异标记dna片段pcr扩增、pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测步骤；其中在遗传雌性(x1x1x2x2)个体中扩增出561bp的单一dna片段；在遗传雄性个体(x1x2y)中扩增出561bp、573bp和222bp三个dna片段，但由于561bp和573bp片段差异太小，从电泳图上看融合为一条带。

本发明从斑石鲷全基因组序列中筛选到两条x、y染色体同源且差异的dna片段，建立了斑石鲷遗传性别鉴定方法，采用该方法可以快速、准确、有效的区分斑石鲷遗传性别。该方法在雄性个体中扩增出特异目的条带(222bp)，而在雌性个体不能扩增出该222bp的dna条带，并可以用琼脂糖电泳分辨，缩短了准确鉴定斑石鲷遗传性别的时间，适用于养殖场简易环境内斑石鲷遗传性别的鉴定，节约了检测时间和成本。本发明检测斑石鲷遗传性别的方法，对斑石鲷亲鱼繁育、家系建立及控制养殖群体的雌雄性别比例，推动斑石鲷养殖业可持续健康发展具有重要意义和应用价值。

附图说明

图1：本发明x、y染色体dna片段序列比对图，引物位置用下划线表示；空格：x、y染色体dna片段差异序列；*：x、y染色体dna片段一致序列；-：缺失序列

图2：本发明遗传雌、雄斑石鲷pcr产物1.5％琼脂糖凝胶电泳结果图，♀：生理雌鱼；♂：生理雄鱼；m：dl2000dnamaker；图中呈现单条带的为遗传雌鱼，双条带的为遗传雄鱼，其中60尾生理雄鱼中出现两尾遗传性别为雌性的斑石鲷，此两尾斑石鲷解剖检测确定为生理伪雄鱼。这两尾鱼应该是遗传上雌性、生理上雄性的伪雄鱼。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1斑石鲷雄性特异dna片段的筛选与验证

雄性特异dna片段的发现：本发明所用的性染色体连锁的dna片段序列来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所水产生物技术与基因组研究室陈松林研究团队完成的斑石鲷全基因组测序结果(未发表)，生物信息学分析斑石鲷基因组序列筛选出两条x、y染色体同源且差异的dna片段。发现了两条斑石鲷x(x1或x2)、y染色体同源的差异dna片段，其中y染色体上dna片段长573bp，命名为seqchry，其序列为seqidno:1：

tatctctctgctctgcctgggtagctctgattgtcaagagcatcgtaaaaaccattaaactgttgtaaatagtttagtctcctgttttattcctcaaaagcctttacagcatttagtgaaatttcctccagcttttttaatcagtgttttattgtctgtaaagccagttttagctcttaagttctattagaatatataaacaaagtgcctctgctattttccacagtattatactgtagacagatgagccgctccatattgggcagctttctcaaattgctgtatgttaatttgtgtaatcagaaagtagcaggaggtgccaatctgatcacaaccagtcagataatgacagctaggaggagaataacaactattatgatttttcccctcgcgcctttggttttctctaggactgttaattccaattactctccttaatttttggaatttcctgcttttcacgactgagtgtggtgccctgatgtttcagtttgggttcggatcgtgtcggaccagaatgtgaagtgaattcatgatgatgatgatgatgatgatgtgtgtgtttgttgccgt；

x染色体上dna片段长度为561bp，命名为seqchrx，其序列为seqidno:2：

tatctctctgctctgcctgggtaactctgattgtcaagagcatcgtaaaaaccattaaactgttgtaaatagtttagtctcctgttttattcctcaaaagcctttacagcatttagtgaaatttcctccagcttttttaatcagtgttttattgtctgtaaagccagttttagctcttaagttctattagaatatacaaacaaagtgcctctgctattttccacagtattatactgtagacagatgagccgctccatattgggcagctttctcaaattgctgtatgttaatttgtgtaatcagaaagtagcaggaggcgccaatctgatcacaaccagtcagataatgacagctattatgatttttcccctcgcgcctttggttttctctaggattgttaattccaattactctccttaatttttggaatttcctgcttttcacgactgagtgtggtgccctgatgtttcagtttgggttcggatcgtgtcggaccagaatgtgaagtgaattcatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgtgtgtgtttgttgccgt。

其中y染色体dna片段比x染色体上的片段多出12个bp，这个多出来的片段即为y染色体特有的dna片段，其存在与否可用来鉴别斑石鲷的雌雄遗传性别。

雄性特异dna片段的序列验证：设计多对引物，筛选出了扩增结果稳定的一对引物。选择已知生理性别的雌、雄斑石鲷dna，同时使用引物seqxy:1、seqxy:2、seqy:3进行pcr扩增，反应条件及程序如下：pcr反应体系共50μl，包括35.5μlddh2o；5.0μl10×buffer；4.0μldntp(2.5mmol/l)；1.0μlseqxy:1(10μmol/l)；1.0μlseqxy:2(10μmol/l)；2.0μlseqy:3(10μmol/l)；0.5μlrtaq酶(5u/μl)；3.0μl模板dna(上清)，混匀后离心。pcr扩增程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，30个循环；72℃7min，4℃保存。pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳可看出雌、雄个体存在差异。将雌、雄差异片段回收连接pmd18-t载体，转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛华大测序。测序结果验证了x、y染色体上的同源差异dna片段的序列。

实施例2：斑石鲷遗传性别鉴定技术的建立与应用

1.实验室条件下斑石鲷遗传性别鉴定

dna提取：使用海洋生物dna提取试剂盒(天根)提取斑石鲷鳍条dna，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，用紫外分光光度计测量其od值，调整dna浓度至50ng/μl，于-20℃冻存待用。

pcr鉴定：使用斑石鲷性别特异的dna片段引物seqxy:1、seqxy:2、seqy:3通过pcr方法检测斑石鲷遗传性别。pcr反应体系15μl，其中10×buffer1.5μl、dntp0.8μl、上游引物各0.3μl、下游引物0.6μl、模板dna1μl(50ng/μl)、ddh2o11.0μl，rtaq酶0.1μl。pcr扩增程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，30个循环；72℃7min，4℃保存。加入10×loadingbuffer2.0μl，1.5％琼脂糖凝胶电泳，150v，20分钟，凝胶成像可分辨遗传性别。x1x1x2x2的遗传雌性个体只扩增出561bp的单一dna片段，x1x2y遗传雄性个体扩增出561-573bp和222bp的两条dna带，如图2所示。

2.养殖场条件下斑石鲷遗传性别的鉴定

dna提取：剪取斑石鲷背鳍或尾鳍的少量鳍条，在每个装有鳍条的离心管中加入500μl裂解液和20μl蛋白酶k，55℃水浴裂解1小时，期间轻摇数次以加速裂解。将裂解好的离心管取出，加入500μl酚：氯仿：异戊醇，颠倒轻摇10min，12000转离心10min，取上清液450μl加入提前准备好对应编号装有500μl无水酒精的离心管中，轻摇30次，12000转离心5min，可见白色dna沉淀于离心管底部。倒掉离心管中的液体，将dna沉淀晾干，加入100μlddh2o,涡旋两次使dna充分溶解。

pcr鉴定：使用上述三条引物进行pcr实验，pcr反应体系15μl，其中10×buffer1.5μl、dntp0.8μl、上游引物各0.3μl、下游引物0.6μl、模板dna1μl(50ng/μl)、ddh2o11.0μl，rtaq酶0.1μl。pcr扩增程序：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，30个循环；72℃7min，4℃保存。加入10×loadingbuffer2.0μl，1％琼脂糖凝胶电泳，120v，20分钟，凝胶成像可分辨遗传性别。从遗传雌鱼dna中只扩增出561bp单一条带，从遗传雄鱼dna中扩增出561-573bp和222bp两条条带，如图2所示。

序列表

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>573

<212>dna

<213>斑石鲷(oplegnathuspunctatus)

<400>1

tatctctctgctctgcctgggtagctctgattgtcaagagcatcgtaaaaaccattaaac60

tgttgtaaatagtttagtctcctgttttattcctcaaaagcctttacagcatttagtgaa120

atttcctccagcttttttaatcagtgttttattgtctgtaaagccagttttagctcttaa180

gttctattagaatatataaacaaagtgcctctgctattttccacagtattatactgtaga240

cagatgagccgctccatattgggcagctttctcaaattgctgtatgttaatttgtgtaat300

cagaaagtagcaggaggtgccaatctgatcacaaccagtcagataatgacagctaggagg360

agaataacaactattatgatttttcccctcgcgcctttggttttctctaggactgttaat420

tccaattactctccttaatttttggaatttcctgcttttcacgactgagtgtggtgccct480

gatgtttcagtttgggttcggatcgtgtcggaccagaatgtgaagtgaattcatgatgat540

gatgatgatgatgatgtgtgtgtttgttgccgt573

<210>2

<211>561

<212>dna

<213>斑石鲷(oplegnathuspunctatus)

<400>2

tatctctctgctctgcctgggtaactctgattgtcaagagcatcgtaaaaaccattaaac60

tgttgtaaatagtttagtctcctgttttattcctcaaaagcctttacagcatttagtgaa120

atttcctccagcttttttaatcagtgttttattgtctgtaaagccagttttagctcttaa180

gttctattagaatatacaaacaaagtgcctctgctattttccacagtattatactgtaga240

cagatgagccgctccatattgggcagctttctcaaattgctgtatgttaatttgtgtaat300

cagaaagtagcaggaggcgccaatctgatcacaaccagtcagataatgacagctattatg360

atttttcccctcgcgcctttggttttctctaggattgttaattccaattactctccttaa420

tttttggaatttcctgcttttcacgactgagtgtggtgccctgatgtttcagtttgggtt480

cggatcgtgtcggaccagaatgtgaagtgaattcatgatgatgatgatgatgatgatgat540

gatgtgtgtgtttgttgccgt561

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tatctctctgctctgcctgggta23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acggcaacaaacacacacatcat23

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gctaggaggagaataacaac20