一种基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于有机合成技术领域，尤其涉及一种基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

cu²⁺在植物、动物和人类的生物系统中起着重要的作用。更重要的是，高浓度的cu²⁺对许多细菌和病毒等有机体具有高度毒性，同时cu²⁺细胞稳态的改变与一些严重的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病，威尔逊氏病和门克斯病。因此，迫切需要开发有效的探针用于生物体系中cu²⁺检测。

近年来，荧光分子探针技术由于具有灵敏度高、操作简单、成本低等特点，已经成为检测金属离子的重要手段。因此，cu²⁺荧光探针受到广泛关注。但现有探针水溶性差，使用时多需要有机溶剂助溶，且合成相对复杂，成本高。聚集诱导发光(aie)或聚集诱导发射增强(aiee)分子背景噪声低，其最显著的优势就是聚集态下的高效稳定发光。其在富水或纯水体系下形成聚集体，荧光效率出现显著增加甚至由暗到明的突跃，使高品质的活体成像和高灵敏度的在线传感监测变得更加容易。因此，开发aie或aiee活性荧光探针用于cu²⁺检测是目前研究的热点。

现有技术中，中国专利cn108276371a公开了一种香豆素硫代卡巴腙衍生物，但是存在检出限高(检出限为1.008×10^-7mol/l)的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针及其制备方法和应用。本发明提供的荧光探针检出限低。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针，所述香豆素卡巴腙衍生物结构式如式i所示：

本发明还提供了上述技术方案所述的基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

将7-二乙氨基-3-乙酰基香豆素和乙醇溶液混合后，再加入卡巴肼，得到混合物；

将所述混合物在常压下进行回流反应，得到溶液；

将所述溶液冷却后，得到所述基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针。

优选地，所述7-二乙氨基-3-乙酰基香豆素和卡巴肼的摩尔比为1:1。

优选地，所述7-二乙氨基-3-乙酰基香豆素与乙醇溶液的用量比为0.002～0.004mol：0.005～0.01l。

优选地，所述乙醇溶液为无水乙醇或浓度为75％的乙醇溶液。

优选地，所述回流反应的时间为2～3h。

优选地，所述溶液冷却至室温后进行减压过滤，将所得滤渣用无水乙醇洗涤，得到所述基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针。

本发明还提供了上述技术方案所述的基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针或上述技术方案所述制备方法制得的基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针作为cu²⁺荧光探针的应用。

优选地，所述cu²⁺的荧光探针为检测细胞内cu²⁺的荧光探针。

本发明提供了一种基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针，基于香豆素卡巴腙衍生物能够与cu²⁺形成稳定配合物，具有较好的cu²⁺离子识别性能，在ph＝7.4的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes，5×10^-3mol/l，含体积比为0.5％的dmso)缓冲溶液中表现出显著的aiee性质，且对cu²⁺离子表现出较高的选择性荧光识别性能。cu²⁺加入使探针溶液的绿色荧光几乎完全淬灭，具有荧光减弱效应，可实现裸眼辨别检测。更为重要的是也可用于细胞中cu²⁺离子的荧光成像检测，具有快速、简便、灵敏度高、检出限低、选择性强的特点，以及广泛的潜在应用价值。实施例的数据表明，本发明提供的基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针对cu²⁺的线性响应浓度为0～4.5×10^-7mol/l，检出限为1.5×10^-9mol/l。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的荧光探针的¹hnmr谱图；

图2为本发明实施例1制得的荧光探针的质谱谱图；

图3为本发明实施例1制得的荧光探针在不同比例dmso/hepes缓冲溶液(5×10^-3mol/l，ph＝7.4)介质中的荧光发射图，插图表示365nm紫外灯下溶液的荧光变化；

图4为本发明实施例1制得的荧光探针的hepes缓冲溶液(5×10^-3mol/l，ph＝7.4)分别加入ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，cu²⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²⁺和zn²⁺金属阳离子的荧光光谱图，插图表示365nm紫外灯下探针溶液加cu²⁺前后的荧光变化；

图5为本发明实施例1制得的荧光探针的hepes缓冲溶液(5×10^-3mol/l，ph＝7.4)滴定不同浓度cu²⁺的荧光光谱图，插图表示溶液荧光强度与cu²⁺浓度的线性相关范围；

图6为本发明实施例1制得的荧光探针的hepes缓冲溶液(5×10^-3mol/l，ph＝7.4)先加入cu²⁺，再分别加入ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，cu²⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²⁺和zn²⁺在505nm处的荧光发射强度对比图，激发波长为418nm；

图7为实施例1中，在hela细胞中，荧光探针与cu²⁺的荧光成像图；

其中：a为荧光探针荧光成像图；b为荧光探针明场下的成像图；c为荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；d为荧光探针+cu²⁺荧光成像图；e为荧光探针+cu²⁺明场下的成像图；f为荧光探针+cu²⁺明场图和荧光图叠加后的图片。

具体实施方式

本发明提供了一种基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针，所述香豆素卡巴腙衍生物结构式如式i所示：

本发明还提供了上述技术方案所述的基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

将7-二乙氨基-3-乙酰基香豆素和乙醇溶液混合后，再加入卡巴肼，得到混合物；

将所述混合物在常压下进行回流反应，得到溶液；

将所述溶液冷却后，得到所述基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针。

本发明将7-二乙氨基-3-乙酰基香豆素和乙醇溶液混合后，再加入卡巴肼，得到混合物。在本发明中，所述7-二乙氨基-3-乙酰基香豆素和卡巴肼的摩尔比优选为1:1。

在本发明中，所述7-二乙氨基-3-乙酰基香豆素与乙醇溶液的用量比优选为0.002～0.004mol：0.005～0.01l。

在本发明中，所述乙醇溶液优选为无水乙醇或浓度为75％的乙醇溶液。

得到混合物后，本发明将所述混合物在常压下进行回流反应，得到溶液。

在本发明中，所述回流反应的时间优选为2～3h。在本发明中，所述回流反应优选在搅拌的条件下进行。在本发明中，所述回流反应中优选加入冰醋酸催化回流反应。本发明对所述冰醋酸的用量没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方案即可。

得到溶液后，本发明将所述溶液冷却后，得到所述基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针。

在本发明中，所述冷却优选为自然冷却至室温。

在本发明中，所述溶液冷却至室温后优选进行减压过滤，将所得滤渣用无水乙醇洗涤，得到所述基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针。本发明对所述无水乙醇的洗涤次数以及每次无水乙醇的用量没有特殊的限定，采用本领域技术人员的常规方式即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针或上述技术方案所述制备方法制得的基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针作为cu²⁺荧光探针的应用。

在本发明中，所述应用是以非疾病的诊断和治疗方法为目的。

在本发明中，所述cu²⁺的荧光探针优选为检测细胞内cu²⁺的荧光探针。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于香豆素卡巴腙衍生物的荧光探针及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

香豆素卡巴腙衍生物的合成

将0.259g7-二乙氨基-3-乙酰基香豆素卡巴腙溶于10ml无水乙醇中，再加入0.09g卡巴肼，再滴加两滴冰醋酸催化，常压下回流搅拌3h，冷却至室温后析出大量固体，减压过滤，将滤渣用无水乙醇洗涤得到黄色固体，即为目标产物基于香豆素卡巴腙衍生物，目标产物的产率为75％。

采用核磁共振仪对制得的香豆素卡巴腙衍生物进行核磁共振分析，结果如图1所示，核磁数据如下：

¹hnmr(400mhz,d6-dmso)δ:9.50(1h,s,nh),8.26(1h,s,nh),7.89(1h,s,ar-h),7.48-7.51(1h,d,ar-h),6.71-6.76(1h,d,ar-h),6.54(1h,s,ar-h),4.11(s,2h,nh2),3.43-3.48(4h,q,2ch2),2.10(3h,s,ch3),1.12-1.16(6h,s,2ch3).

质谱分析谱图如图2所示，质谱数据如下：esi-ms:m/z＝332.1598([m+h]⁺)；354.1585([m+na]⁺)；370.1271(calcd.[m+k]⁺).

根据图1～2可知，制得的香豆素卡巴腙衍生物具有式i所示结构。

实施例2

香豆素卡巴腙衍生物的aiee性质测定

将上述实施例1制得的香豆素卡巴腙衍生物作为荧光探针在不同体积比的dmso/hepes缓冲溶液(5×10^-3mol/l，ph＝7.4)中配制成摩尔浓度为1×10^-5mol/l的溶液，采用荧光光谱仪对其分别进行荧光光谱分析(激发波长为418nm)，记录505nm处的荧光强度值，所得的荧光光谱图见图3，插图表示365nm紫外灯下溶液的荧光变化。通过图3可以看出，随着体系缓冲溶液比例增加，本发明实施例1制得的香豆素卡巴腙衍生物的荧光发射强度也随之增加，在365nm紫外灯激发下溶液的绿色荧光同时增强，证明上述实施例1制得的香豆素卡巴腙衍生物具有典型的aiee性质。

实施例3

香豆素卡巴腙衍生物对cu²⁺的荧光光谱响应

将上述实施例1制得的香豆素卡巴腙衍生物作为荧光探针用ph＝7.4的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes，5×10^-3mol/l，含体积比为0.5％的dmso)的缓冲溶液配制成摩尔浓度为1×10^-5mol/l的溶液，分别在含摩尔浓度为2×10^-5mol/l的ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，cu²⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²⁺和zn²⁺金属阳离子的溶液中加入等量的上述荧光探针溶液，采用荧光光谱仪对其分别进行荧光光谱分析(激发波长为418nm)，记录505nm处的荧光强度值，所得的荧光光谱图见图4，插图表示365nm紫外灯下探针溶液加cu²⁺前后的荧光变化。通过图4可以看出，本发明实施例1制得的香豆素卡巴腙衍生物在365nm紫外灯激发下发射明亮的绿色，加入cu²⁺后荧光明显淬灭。而本发明实施例1制得的香豆素卡巴腙衍生物对其它阳离子如ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²⁺和zn²⁺无明显荧光响应。

ph＝7.4的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes，5×10^-3mol/l，含体积比为0.5％的dmso)的缓冲溶液中摩尔浓度为1×10^-5mol/l的香豆素卡巴腙衍生物荧光探针对cu²⁺具有高灵敏、高选择性响应。为本发明实施例1制得的荧光探针的hepes缓冲溶液(5×10^-3mol/l，ph＝7.4)滴定不同浓度cu²⁺的荧光光谱图，插图表示溶液荧光强度与cu²⁺浓度的线性相关范围通过图5荧光滴定光谱可以计算得到cu²⁺的线性响应浓度为0～4.5×10^-7mol/l，检出限为1.5×10^-9mol/l，因此本发明实施例1制得的香豆素卡巴腙衍生物可用于cu²⁺的荧光定量检测。

图6为本发明实施例1制得的荧光探针(1×10^-5mol/l)的ph＝7.4的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes，5×10^-3mol/l，含体积比为0.5％的dmso)的缓冲溶液先加入cu²⁺(2×10^-5mol/l)，再分别加入ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，cu²⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²⁺和zn²⁺金属离子(1×10^-4mol/l)在505nm处的荧光发射强度对比图，激发波长为418nm。从图6可以看出，共存金属离子对cu²⁺荧光淬灭检测无明显影响。

实施例4

香豆素卡巴腙衍生物荧光探针在细胞内cu²⁺离子的检测实验

hela细胞用1×10^-5m的上述实施例1制得的香豆素卡巴腙衍生物荧光探针培育0.5小时后加入cu²⁺，继续培育0.5小时后使用olympusfv500-ix70激光共聚焦显微镜进行荧光成像，获得在hela细胞的荧光成像图，具体如图7所示，其中a为上述荧光探针荧光成像图；b为上述荧光探针明场下的成像图；c为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；d为上述荧光探针+cu²⁺荧光成像图；e为上述荧光探针+cu²⁺明场下的成像图；f为上述荧光探针+cu²⁺明场图和荧光图叠加后的图片。从图7中可以看出，hela细胞中加入香豆素卡巴腙衍生物荧光探针有明显绿色荧光，而再加入cu²⁺后，荧光强度有所降低。故本发明实施例1制得的香豆素卡巴腙衍生物可用于细胞中cu²⁺的定性检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。