特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体的制作方法

本发明涉及特异性识别粪肠球菌的ssdna适配体，具体涉及对粪肠球菌特异性的新型识别元件ssdna适配体的筛选，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学技术领域。

背景技术：

肠球菌（enterococcus）是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌，检出率仅次于大肠杆菌，其致病机理主要是通过分泌细胞溶解素、明胶酶等毒性物质侵袭破坏宿主组织细胞，并耐受宿主的非特异性免疫应答，从而引起感染性疾病的发生与发展。随着抗生素的广泛使用，肠球菌的多重耐药性不断增强，特别是耐万古霉素的肠球菌的出现，使肠球菌感染成为重要的公共卫生问题。据2010年中国chinet细菌耐药监测网显示，肠球菌在尿路感染中所占比例仅次于大肠埃希菌，而在血流感染中居第三位。临床感染的肠球菌以粪肠球菌和屎肠球菌为主，其中粪肠球菌（enterococcusfaecalis）最为多见，约45%~65%。目前，常规的粪肠球菌检测方法主要分为四大类，即微生物学检测法、分子生物学方法、免疫学方法和仪器分析法。然而，这些方法存在灵敏度低、成本高、耗时长、操作繁琐等缺点，不能很好地实现粪肠球菌的快速检测。因此，建立一种高灵敏度、快速检测粪肠球菌的方法是十分必要的。

指数富集的配体系统进化技术（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex）是近年来新建立的一种体外筛选技术，基于单链寡核苷酸碱基之间可以形成多种空间结构，这些结构容易与靶分子结合的原理，从含有10¹³~10¹⁵个不同基元的初始文库中，经过数十轮的重复筛选富集过程，获得高亲和性、高特异性的核酸适配体。selex可以应用于各种类型靶分子的筛选上，不仅可以筛选无机或有机小分子、蛋白质、糖、抗生素等单个靶分子，还可以筛选复杂的靶结构或组成不明确的复合靶如靶分子混合物、生物体、完整细胞等。利用selex技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如：靶分子范围广，不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，可应用于非生理条件下，可根据需求进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研究领域得到广泛应用。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。

技术实现要素：

本发明的目的是通过wholebacteria-selex技术，筛选得到能特异性识别和结合粪肠球菌的ssdna适配体，该适配体是粪肠球菌的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。

本发明的技术方案，特异性结合粪肠球菌的ssdna适配体，选自序列表apt1~apt35所示序列的一种或多种，包括含有apt1~apt35所述序列的ssdna。

其中，序列表apt1~apt35在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5’-tagggaattcgtcgacggatcc-n35-ctgcaggtcgacgcatgcgccg-3’。其中n代表碱基a、t、c、g中任一个，n35代表随机片段长度为35个碱基。

在序列表中，优选序列apt10、apt21、apt29和apt34所示的序列。具体如下：

apt10:5’-tagggaattcgtcgacggatcccaaggtcacatagtgcactctatgtgagtacccttctgcaggtcgacgcatgcgccg-3’；

apt21:5’-tagggaattcgtcgacggatccttgaaatcgcacaagttccgtcctctctacgactcctgcaggtcgacgcatgcgccg-3’；

apt29:5’-tagggaattcgtcgacggatcccgtcgtccaagcattgctcaaaaggaaccgtagttctgcaggtcgacgcatgcgccg-3’；

apt34:5’-tagggaattcgtcgacggatccgttgcagcgacagcccggttttatgtttgtaagtgctgcaggtcgacgcatgcgccg-3’。

根据序列表apt1~apt35所述的适配体，其能被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基等所修饰。

用于粪肠球菌检测的组合物、试剂盒和芯片，其中含有序列表apt1~apt35中任一项的适配体。

筛选特异性结合粪肠球菌ssdna适配体的wholebacteria-selex技术是采用文库与菌株孵育结合后，热变性并离心的方法，结合pcr扩增技术，在链霉亲和素-生物素的作用下，以指数的方式富集与粪肠球菌特异性结合的寡核苷酸（图1），包括步骤（a）-（j）：

a、筛选文库：5’-tagggaattcgtcgacggatcc-n35-ctgcaggtcgacgcatgcgccg-3’，其中n代表碱基a、t、c、g中任一个，n35代表随机片段长度为35个碱基；

引物：

引物i-1：5’-tagggaattcgtcgacggat-3’；

引物i-2：5’-fam-tagggaattcgtcgacggat-3’；

引物ii-1：5’-cggcgcatgcgtcgacctg-3’；

引物ii-2：5’-biotin-cggcgcatgcgtcgacctg-3’。

b、粪肠球菌溶液：1×10⁸cfu/ml；

c、链霉亲和素磁珠：粒径1-2µm，浓度为5mg·ml^-1；

d、使步骤a中的ssdna文库与步骤b中的粪肠球菌溶液在适宜的条件下孵育；所述适宜条件包括37℃，作用时间45min，结合缓冲液（bb）成分为50mmol·l^-1tris-hcl（ph7.4），5mmol·l^-1kcl，100mmol·l^-1nacl，1mmol·l^-1mgcl2·h2o；

e、通过热变性、离心收集经步骤d处理的与步骤b中粪肠球菌结合的ssdna序列；

f、采用引物i-1和引物ii-2对步骤e的文库成员进行pcr扩增；

g、链霉亲和素磁珠法制备ssdna次级文库：步骤c中的链霉亲和素磁珠经pbs（94.7mmol·l^-1na2hpo4·12h2o，5.3mmol·l^-1nah2po4·2h2o，1.54mmol·l^-1nacl，ph8.0）洗涤后加入步骤f中所得的生物素标记的pcr产物，室温结合2h（轻微震荡），磁性分离弃上清、经pbs缓冲液冲洗，洗去未结合到磁珠上的dsdna。向上述混合物中加入naoh溶液，37℃孵育2h，磁性分离，将带生物素的一条链留在链霉亲和素磁珠上，洗下不带生物素的一条单链dna，即为下一轮筛选的次级文库；

h、收集步骤e或步骤g中与步骤b特异性结合的文库成员；

i、重复步骤d～g，重复次数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12次，优选重复12次；

j、对步骤h获得的最终文库成员进行确定，优选序列测定。

本发明的有益效果：本发明采用wholebacteria-selex技术，筛选得到与粪肠球菌高特异结合的ssdna适配体，方法快速简便易操作，使用仪器简单，一般的实验条件都可以达到。筛选得到的高亲和力适配体序列可以特异性地跟粪肠球菌结合，为粪肠球菌的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰的高特异性检测识别元件。

附图说明

图1基于wholebacteria-selex技术筛选粪肠球菌适配体的原理图。

图2selex筛选过程中结合粪肠球菌的ssdna文库的荧光强度。

图3-a测定适配体序列apt10的kd值的拟合曲线图。

图3-b测定适配体序列apt21的kd值的拟合曲线图。

图3-c测定适配体序列apt29的kd值的拟合曲线图。

图3-d测定适配体序列apt34的kd值的拟合曲线图。

具体实施方式

实施例1核酸适配体的体外筛选

a、随机单链dna文库与引物合成：构建长度为79nt的随机ssdna文库，其两端为固定引物序列，中间为随机序列，其中n代表碱基a、t、c、g中任一个，序列为：5’-tagggaattcgtcgacggatcc-n35-ctgcaggtcgacgcatgcgccg-3’。

引物：

引物i-1：5’-tagggaattcgtcgacggat-3’；

引物i-2：5’-fam-tagggaattcgtcgacggat-3’；

引物ii-1：5’-cggcgcatgcgtcgacctg-3’；

引物ii-2：5’-biotin-cggcgcatgcgtcgacctg-3’。

b、核酸适配体的体外筛选：为筛选出与粪肠球菌有高亲和力和高特异性的ssdna适配体，共进行了12轮筛选，每一轮筛选获得的次级文库与粪肠球菌结合的ssdna的荧光强度如图2所示。

wholebacteria-selex技术筛选粪肠球菌适配体的具体流程为：将粪肠球菌在液体培养基中，37℃、220r·min^-1摇床培养至对数生长期（od600=0.3），收集菌液1ml，3500r·min^-1、4℃离心5min，弃上清，用bb清洗两次，去除培养基。同时，对ssdna文库进行预处理，即95℃热变性10min，立即冰浴10min。第一轮筛选时，反应体系为600μl，缓冲液为bb，随机ssdna文库的投入量为2nmol，粪肠球菌投入量为10⁸cfu/ml。ssdna文库与粪肠球菌37℃、180r·min^-1孵育1h后，将其在4℃，3500r·min^-1条件下离心5min，弃上清。复合物用含0.2%bsa的bb清洗2次后，重悬于100μlddh2o中，95℃热变性10min，立即冰浴10min，解离与细胞紧密结合的适配体，8000r·min^-1，4℃离心5min，上清即为该轮筛选的产物。从第二轮开始，每轮次级文库的投入量为100pmol，孵育体系调整为350μl。为了获得高特异性的适配体，从第八轮开始，连续分别采用大肠杆菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌对得到的次级文库进行反向筛选。

c、以次级文库为模板，用引物i-1和引物ii-2进行pcr扩增，核酸电泳进行验证。25μl的pcr扩增体系如表1所示。

表1

扩增条件：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；57.6℃，退火30s；72℃，延伸15s；72℃，延伸5min；12~30个循环。

d、制备次级文库：取350μl链霉亲和素磁珠液，经pbs（94.7mmol·l^-1na2hpo4·12h2o,5.3mmol·l^-1nah2po4·2h2o,1.54mmol·l^-1nacl,ph8.0）洗涤后加入生物素标记的pcr产物160pmol，并用pbs将体系补足到400μl，220r·min^-1、28.5℃孵育2h。磁性分离弃上清，经pbs洗涤4次后，加入现配的50μl0.1mnaoh，37℃孵育2h，磁性分离取上清即为ssdna次级文库，用于下一轮筛选。

e、筛选次数的确定：筛选得到的ssdna次级文库用引物i-2和ii-2进行pcr扩增，扩增产物通过链霉亲和素磁珠法获得fam标记的ssdna次级文库。将100pmolssdna文库与1x10⁸cfu/ml的粪肠球菌在500μlbb中，37℃、180r·min^-1孵育45min，3500r·min^-1、4℃离心5min，弃上清，重复洗涤3次。将ssdna-粪肠球菌混合物重悬于100μlddh2o中，95℃热变性10min，立即冰浴10min，8000r·min^-1，4℃离心5min，重复三次，最后将三次离心所得上清液置于96孔板中，用多功能酶标仪（激发波长494nm，发射波长520nm）测其荧光强度。评价各轮筛选的次级文库与粪肠球菌的结合能力。

f、下一轮筛选根据上面的筛选方法重复进行，重复12次。如图2所示，随着筛选轮数的增加，筛选产物出现了明显的富集，且富集现象在第九轮达到顶峰。由于反向筛选的进行，从第十轮开始与粪肠球菌结合的ssdna文库的荧光强度略微下降，但ssdna文库的特异性得到了进一步提高，因此选择第十二轮的ssdna次级文库进行后续实验。

实施例2.筛选得到的ssdna文库克隆、测序、结构分析

经过12轮筛选得到的ssdna文库，用i-1和ii-1进行pcr扩增，扩增产物全量上样于3%琼脂糖凝胶，并对其进行回收。用7μl纯化的pcr产物与1μlpmd-19t载体混合均匀，在t4连接酶的作用下16℃连接12-14h，转化大肠杆菌jm109感受态细胞，37℃过夜培养。随机挑取39个阳性克隆子转接到液体lb培养基中，培养12h，用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒测序得到apt1~apt35的35条不同的适配体序列。

实施例3.荧光分析法测定适配体序列的解离常数kd值

运用荧光分析法来测定候选适配体的解离常数（kd），具体方法为：取不同浓度梯度的fam标记的适配体（0~1500nmol·l^-1）与固定浓度的粪肠球菌（10⁸cfu/ml）37℃、180r·min^-1孵育45min后，3500r·min^-1离心5min，弃上清，用bb清洗三次后重悬于100μlddh2o中，95℃热变性10min，立即冰浴10min，8000r·min^-1，4℃离心5min，重复三次，最后将三次离心所得上清液置于96孔板中，用多功能酶标仪测定其荧光强度。在实验过程中，荧光标记的单链dna文库被用作控制非特异性结合。根据测量得到的荧光强度，利用graphpadprism5.0软件进行非线性回归分析，根据公式：y=bmax×x/(kd+x)计算出kd值（bmax为最大结合位点的数目，x为适配体浓度，y为荧光强度）。图3是apt10、apt21、apt29、apt34与粪肠球菌的结合饱和曲线，解离常数（kd）分别为829.5±170.4nmol·l^-1，549.2±147.4nmol·l^-1，614.3±121.9nmol·l^-1和988.0±208.7nmol·l^-1。

序列表

<110>江南大学

<120>特异性识别粪肠球菌的ssdna适配体

<141>2019-01-25

<160>35

<170>siposequencelisting1.0

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